TIỂU LUẬN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH

Với cây lúa, các chất dinh dưỡng cần thiết, không thể thiếu đối với sự sinh trưởng và phát triển là: Cacbon, hydro, oxy (trong tự nhiên) và các chất khoáng: nito (N), lân (P), kali (K), canxi, sắt, kẽm, đồng, magie, mangan, môlípđen, bo, silic, lưu huỳnh, trong đó 3 chất dinh dưỡng cây lúa cần lượng lớn là: nito, photpho, kali. Trong cơ thể thực vật, lân đóng vai trò quyết định trong sự biến đổi vật chất và năng lượng. Nó tham gia cấu tạo nên các acid nucleic, coenzyme, adenosine triphosphate (ATP)… là những chất cần thiết cho sự sống. Ngoài ra lân còn đóng vai trò khác nhau như tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến quá trình hút các chất khoáng khác của cây. Thiếu photpho, năng suất cây trồng bị giảm sụt nghiêm trọng, ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ (Havlin et al., 1999). Sự xuất hiện, tồn tại và chuyển hóa của photpho trong tự nhiên diễn ra theo một quy trình khép kín gọi là vòng tuần hoàn của photpho thông qua 4 quá trình (khoáng hóa, cố định sinh học, cố định hóa học và phân giải). Theo Murphy et al, 2013, cây trồng chỉ có thể hấp thu 525% lượng lân được bón, số còn lại bị đất giữ lại dưới dạng hấp phụ hoặc cố định, trong đó hấp phụ thông qua trao đổi ion sẽ trở thành dạng tan, còn cố định thì không thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi.

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CƠNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM ›››› TIỂU LUẬN KĨ THUẬT PHÂN TÍCH VI SINH PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN KHÓ TAN TỪ ĐẤT TRỒNG LÚA Giảng viên hướng dẫn: Lớp: Nhóm thuyết trình: Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh Hồ Chí Minh, ngày 08 tháng 04 năm 2019 MỤC LỤC Danh sách bảng Danh sach chữ viết tắt Mở đầu 1.1 Tổng quan 1.2 Vsv phân giải lân khó tan 1.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến trình phân giải lân vsv Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Thiết bị 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất 2.2.2 Phương pháp phân tích tiêu đất 2.2.3 Phương pháp phân tích tiêu vsv 2.2.3.1 Phương pháp xác định mật độ VKTS, XKTS, NTS 2.2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật tế bào 2.2.3.3 Phương pháp phân tích mơi trường thạch Quy trình .9 3.1 Quy trình 3.2 Thuyết minh quy trình 10 3.2.1 Lấy mẫu đất .10 3.2.2 Đồng mẫu 10 3.2.3 Pha loãng mẫu thập phân .10 3.2.4 Đếm khuẩn lạc 10 3.2.5 Đánh giá hoạt tính phân giải lân vsv 11 3.2.6 Đánh giá hoạt tính tổng hợp IAA 11 Kết luận số giải pháp phát triển hệ vsv phân giải lân nâng cao hiệu dinh dưỡng lân (tham khảo từ “ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN TRONG ĐẤT PHÙ SA GLÂY TRỒNG ĐHSH12ATT Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh LÚA TẠI MỘT SỐ Xà THUỘC HUYỆN TIÊN LỮ, TỈNH HƯNG YÊN”) 12 Tài liệu tham khảo .14 Phụ lục DANH MỤC BẢNG Số biểu bảng Danh mục bảng Trang Bảng Thành phần môi trường Salkowski 14 Bảng 2.1 Thành phần môi trường NBRIP Bảng 2.2 Thành phần môi trường phân lập vsv phân giải lân hữu Bảng 2.3 Môi trường nấm tổng số 14 Bảng 2.4 Mơi trường vsv hiếu khí tổng số 15 Bảng 2.5 Mơi trường vsv kị khí tổng số 15 Bảng 2.6 Môi trường xạ khuẩn tổng số 15 Bảng Môi trường Pikovskaya’s 15 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích IAA Indole-3-acetic acid PSM Phosphate Solubilizing Microorganisms VSV Vi sinh vật VKTS Vi khuẩn tổng số NTS Nấm tổng số XKTS Xạ khuẩn tổng số NBRIP PVK ĐHSH12ATT National Botanical Research Institute of Phosphate solubilizing bacteria Pikovskaya’s Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh PHÂN LẬP CHỦNG VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN KHÓ TAN TỪ ĐẤT TRỒNG LÚA Mở đầu 1.1 Tổng quan Với lúa, chất dinh dưỡng cần thiết, thiếu sinh trưởng phát triển là: Cacbon, hydro, oxy (trong tự nhiên) chất khoáng: nito (N), lân (P), kali (K), canxi, sắt, kẽm, đồng, magie, mangan, mơlíp-đen, bo, silic, lưu huỳnh, chất dinh dưỡng lúa cần lượng lớn là: nito, photpho, kali Trong thể thực vật, lân đóng vai trị định biến đổi vật chất lượng Nó tham gia cấu tạo nên acid nucleic, coenzyme, adenosine triphosphate (ATP)… chất cần thiết cho sống Ngồi lân cịn đóng vai trị khác tạo môi trường đệm, ảnh hưởng đến trình hút chất khống khác Thiếu photpho, suất trồng bị giảm sụt nghiêm trọng, cung cấp đủ nitơ (Havlin et al., 1999) Sự xuất hiện, tồn chuyển hóa photpho tự nhiên diễn theo quy trình khép kín gọi vịng tuần hồn photpho thơng qua q trình (khống hóa, cố định sinh học, cố định hóa học phân giải) Theo Murphy et al, 2013, trồng hấp thu 5-25% lượng lân bón, số cịn lại bị đất giữ lại dạng hấp phụ cố định, hấp phụ thông qua trao đổi ion trở thành dạng tan, cịn cố định khơng thể chuyển đổi thông qua ion trao đổi 1.2 Vsv phân giải lân khó tan VSV phân giải lân, VSV chuyển hóa lân (Phosphate Solubilizing Microorganisms – PSMs) VSV có khả chuyển hóa hợp chất photpho khó tan thành dạng dễ tiêu cho trồng sử dụng Vsv phân giải lân chia thành nhóm: vsv phân giải lân hữu vsv phân giải lân vô ĐHSH12ATT Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh Các nghiên cứu trước ghi nhận nhiều nhóm vsv: Pseudomonas, Micrococcus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Selerotium, Aspergillus nấm rễ (Mycorrhira) có khả tiết số enzyme từ phân giải chuyển hóa phosphate canxi mà phosphate nhơm, sắt, mangan dạng khác kể quặng thành dạng dễ tan, giúp rễ hấp thụ VSV không chuyển hóa photpho vơ cơ, mà cịn có khả khống hóa hợp chất lân hữu tạo sản phẩm mà trồng hấp thu (Gaur, A C., 1992; Richardson, 2001) Bên cạnh đó, số nhóm vsv cịn có khả sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật, Indole-3-acetic acid (IAA) Vì thế, bổ sung nguồn vsv phân giải P khó tan đất xem giải pháp hữu hiệu thân thiện với môi trường, đồng thời làm tăng hiệu sử dụng phân bón Bởi lý mà chúng em tiến hành thực đề tài “Phân lập chủng vi sinh vật phân giải lân khó tan từ đất trồng lúa” với mục tiêu: - Phân lập thành cơng chủng vsv có khả phân giải lân khó tan - Đánh giá hoạt tính phân giả lân chủng vsv tìm - Đánh giá chủng vsv có khả tổng hợp IAA 1.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến trình phân giải lân vsv Khả phân giải lân vi sinh vật ảnh hưởng số yếu tố sau: - - - - pH: nhìn chung độ pH ảnh hưởng đến khả phân giải lân Tuy nhiên pH khoảng 7,5-8 phù hợp cho hệ vi sinh vật phân giải lân Nhiệt độ: chủng vi sinh vật khác có nhiệt độ ảnh hưởng đến khả phân giải lân khác Nhìn chung, nhiệt độ thích hợp nằm khoảng 20-400C (Phạm Thanh Hà cộng sự., 2003) Độ ẩm: độ ẩm cao giúp hoạt động vi sinh vật mạnh tạo nhiều acid hữu làm tăng hiệu phân giải lân Hệ rễ: hệ rễ trồng kích thích sinh trưởng vi sinh vật Do đó, phân giải lân tăng cường Tuy nhiên số lồi tiết chất độc ngăn cản sinh trưởng phát triển vi sinh vật Tỉ lệ N C môi trường: N, C môi trường cao thúc đẩy khả phân giải lân (Vũ Hữu Yêm., 1995) Hợp chất hữu cơ: Theo Tardieux – Roche (1996), hàm lượng chất hữu mùn hóa khơng làm ảnh hưởng đến trình phân giải lân Hợp chất hữu tươi làm tăng trình sinh trưởng vi sinh vật, từ dẫn đến q trình hịa tan hợp chất lân khó tan ĐHSH12ATT Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Thiết bị Đĩa petri, ống nghiệm, falcon, bình tam giác, ống đong Que cấy, que trải thủy tinh, cốc thủy tinh, đèn cồn Kính hiển vi, lame, lamelle Cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp khử trùng, máy li tâm, máy li tâm lạnh Tủ cấy, tủ ủ, máy lắc mẫu, microwave, máy đo OD, máy khuấy từ Micropipet, đầu tip, eppendorf số dụng cụ khác phịng thí nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu       2.2.1 Phương pháp lấy mẫu đất Loại đất: đất phù sa không bồi, trồng chuyên lúa Cách lấy xử lý mẫu: lấy mẫu sát rễ lúa, đo lại nhiệt độ đất, ruộng lấy vị trí, vị trí 200g Mẫu bảo quản lạnh trình vận chuyển Các tiêu vsv phân tích bảo quản tủ lạnh (khoảng 50C) không tuần 2.2.2 Phương pháp phân tích tiêu đất        pH: máy đo pH N (%): phương pháp Kjeldhal P2O5 (%): phương pháp so màu K2O (%): phương pháp quang kế P2O5 dễ tiêu (mg/100g đất): phương pháp Oniani K2O dễ tiêu (mg/100g đất): phương pháp Maxlova OC (%): Phương pháp Walkley – Black 2.2.3 Phương pháp phân tích tiêu vsv 2.2.3.1 Phương pháp xác định mật độ VKTS, XKTS, NTS Phương pháp đếm số lượng tế bào buồng đếm hồng cầu Phương pháp đếm khuẩn lạc đĩa thạch: dùng phương pháp MPN phương pháp đếm - Phương pháp trải đĩa: trải 0,1ml mẫu lên đĩa chứa môi trường, ủ ngửa đĩa đếm khuẩn lạc ĐHSH12ATT Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh - Phương pháp đổ đĩa: chọn nồng độ pha lỗng thích hợp, chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vơ trùng Rót vào đĩa petri 10-15ml mơi trường làm nguội 450C-500C, lắc cho mẫu phân tán vào môi trường, ủ ngửa đĩa Chọn đĩa có số khuẩn lạc khoảng 25-250 khuẩn lạc để đếm 2.2.3.2 Phương pháp quan sát hình thái vi sinh vật tế bào Tạo khuẩn lạc đơn đĩa thạch Sau ủ 370C 72h Quan sát hình thái mơ tả đặc điểm sau: hình dạng, kích thước, bề mặt, màu sắc, cấu trúc Làm tiêu tế bào thuốc nhuộm (Crystal Violet, liugol, Safranin O) quan sát kính hiển vi quang học 2.2.3.3 Phương pháp phân tích mơi trường thạch Hoạt tính phân giải lân xác định thơng qua đường kính vịng phân giải (định tính) thơng qua nồng độ lân hịa tan mơi trường ni cấy (NBRIP PVK) theo tỷ lệ % ppm (định lượng) Hoạt tính tổng hợp kích thích sinh trưởng thực vật (IAA) xác định theo phương pháp nuôi cấy VSV mơi trường Salkowski cải tiến có bổ sung 0,1% Tryptophan Khả đối kháng vi khuẩn/nấm gây bệnh vùng rễ trồng đánh giá theo phương pháp khuếch tán hoạt chất ức chế VSV môi trường thạch 2.2.3.4 Phương pháp phân tích mơi trường lỏng Để định tính khả phân giải lân môi trường lỏng, dịch nuôi cấy cho vào ống chứa 10 ml môi trường NBRIP, PVK lỏng Ủ 30 0C 10 ngày Hỗn hợp ly tâm 3000 rpm 20 phút Lượng lân phân giải dịch xác định phương pháp đo màu Olsen Sommers (1982) để đánh giá hoạt tính phân giải lân khó tan khả sinh IAA 2.3 Các môi trường sử dụng Phụ lục A trang 14 ĐHSH12ATT Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh  Môi trường phân lập vsv phân giải lân vô khó tan (NBRIP) Bảng 2.1 Cơng thức mơi trường NBRIP (Nautiya et al., 1999) Hóa chất Glucose MgSO4.7H2O Ca3(PO4)2 (tri-calcium phosphate) KCl MgCl2.6H2O (NH4)2SO4 Bromothylmol Blue 0,5% KOH 0,2N Agar pH Nồng độ (g/l) 10 0,5 0,25 0,2 0,1 ml Môi trường đặc: 18 7,2  Môi trường phân lập vsv phân giải lân hữu cơ: Bảng 2.2 Công thức môi trường phân lập vsv phân giải lân hữu     Hóa chất Nồng độ (g/l) Lecithin 0,05 (NH4)2SO4 0,5 CaCO3 NaCl 0,3 MnSO4 Vệt MgSO4 0,3 FeSO4 Vệt Glucose 10 Agar Mơi trường đặc: 15-18 pH 7,2 Hóa chất Nồng độ (g/l) Lecithin 0,05 Môi trường nấm tổng số: bảng 2.3 trang 14 Mơi trường vsv hiếu khí tổng số: bảng 2.4 trang 15 Mơi trường vsv kị khí tổng số: bảng 2.5 trang 15 Môi trường xạ khuẩn tổng số: bảng 2.6 trang 15 ĐHSH12ATT Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh Quy trình 3.1 Quy trình Lấy mẫu đất Đồng mẫu Pha loãng mẫu thập phân Hút 0,1ml mẫu cấy trải môi trường NBRIP (National Botanical Research Institute of Phosphate solubilizing bacteria) Đếm số lượng vi khuẩn Định tính vsv có khả phân giải lân mơi trường PVK (Pikovskaya’s) Đánh giá hoạt tính phân giải lân ĐHSH12ATT Dùng làm thử nghiệm để định danh vsv Đánh giá khả tổng hợp IAA Làm phương pháp Giữ cấy giống ria Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh 3.2 Thuyết minh quy trình 3.2.1 Lấy mẫu đất Vsv phân giải lân lấy từ mẫu đất, rễ trồng theo TCVN 75382005 Đất nghiền nhỏ 3.2.2 Đồng mẫu Cân 1g đất pha 9ml nước muối sinh lý 0,9% vô trùng Hỗn hợp pha loãng với nồng độ 10-1, lắc 10 phút để đồng mẫu 3.2.3 Pha loãng mẫu thập phân Pha loãng mẫu đến nồng độ 10-6 theo TCVN 6168:2002 Chuẩn bị ống chứa 9ml muối sinh lý 0,9% vơ trùng Pha lỗng nồng độ 10-2: dùng 1ml từ ống ban đầu pha loãng 10 -1 vào ống chứa 9ml nước muối Làm tiếp tục đến nồng độ pha loãng 10-5,10-6, 10-7,… 3.2.4 Đếm khuẩn lạc Đem đĩa chứa môi trường NBRIP ủ 30 0C nuôi 2-3 ngày Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa sau ủ Chọn đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 để tính toán kết Mật độ vi sinh vật phân giải lân tổng số xác định theo công thức: Trong đó: A: số tế bào vi khuẩn /1g mẫu N: tổng số khuẩn lạc đĩa chọn ni: số lượng đĩa cấy độ pha loãng V: thể tích dịch cấy vào petri fi: độ pha lỗng tương ứng ĐHSH12ATT 10 Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh Bên cạnh đó, vi sinh vật phân lập đánh giá khả phân giải lân thông qua số phân giải nuôi cấy môi trường PVK 300C ngày (Singh et al., 2013; Rani et al., 2013) Công thức đánh giá khả phân giải lân thơng qua vịng phân giải mơi trường PVK: 3.2.5 Đánh giá hoạt tính phân giải lân vsv Chuẩn bị bình tam giác chứa 50ml mơi trường NBRIP lỏng khử trùng Cấy chủng vi sinh vật phân lập vào ủ ngày Sau lấy 1,5ml dịch ni cấy đem ly tâm 10000 rpm 10 phút Hút 1ml dịch phía bổ sung 0,2 ml (NH4)6Mo7O24 2,5% SnCl2 2,5% làm phản ứng xanh molypdate đo OD xác định nồng độ PO43- Đánh giá hoạt tính phân giải phosphate vi sinh vật đánh giá dựa nồng độ PO43- có dịch ni cấy Nồng độ PO43- cao chứng tỏ lượng phosphate khó tan phân giải nhiều Nguyên tắc phương pháp: nồng độ PO43- xác định dựa phương pháp xanh molypdate với nguyên tắc ion PO4 3- phản ứng với (NH4)2SO4 tạo phức chất (NH4)2PO4.12MoO3 màu vàng Trong điều kiện acid có ion Sn₂₊ phức màu vàng chuyển thành phức màu xanh (NH4)3(4MoO2.2MoO3): PO₄3- + 12(NH4)2SO4 + 24H+ = (NH4)2PO4.12MoO3 + 21NH4+ + 12H2O (NH4)2PO4.12MoO3 + Sn2++16H+ = (NH4)3(4MoO2.2MoO3) + Sn4+ + 8H2O Phức màu xanh có bước sóng hấp thụ cực đại 690nm Sử dụng máy UVVIS đo bước sóng 690nm để xác định độ hấp thụ màu phức chất Độ hấp thụ lớn nồng độ ion PO4 cao 3.2.6 Đánh giá hoạt tính tổng hợp IAA Vsv nuôi 100ml môi trường NBRIP lỏng khử trùng chứa 1ml tryptophan 0,2% nuôi cấy 72h, lắc liên tục 30 0C Dịch đưa vào ống ly tâm ly tâm 10 phút 12000 rpm Lấy 1ml dịch suốt trộn với 4ml môi trường Salkowski ‘s (50ml HClO ml FeCl3 0,05M) Hỗn hợp ủ tối 37°C vòng 30 phút Phụ lục F trang 15 ĐHSH12ATT 11 Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh IAA tạo xác định phương pháp Gutierrez et al., (2009) Sự có mặt IAA xác định môi trường chuyển sang màu đỏ sau thử với dung dịch Salkowski Định lượng tương đối IAA xác định phân tích phương pháp đo độ hấp thụ quang bước sóng λ = 530 nm máy quang phổ với thuốc thử Salkowski 3.3 Lưu ý Quy trình dành cho phân lập chủng vi sinh vật phân gỉai lân vô môi trường NBRIP PVK Khả phân giải lân đánh giá dựa vịng suốt hình thành xung quanh khuẩn lạc PVK NBRIP có thành phần mơi trường giống môi trường PVK chứa nhiều nguyên tố vi lượng Ban đầu nuôi cấy môi trường NBRIP để chọn lọc chủng vsv có khả sử dụng đạm nguồn dinh dưỡng, sau ni cấy mơi trường PVK để đấnh giá so sánh hoạt tính phân giải lân thơng qua vòng phân giải Để phân lập chủng vsv phân giải lân hữu khó tan cần cấy trải, đếm đánh giá vịng phân giải mơi trường có nguồn phosphate hữu khơng tan lecithine Kết luận số giải pháp phát triển hệ vsv phân giải lân nâng cao hiệu dinh dưỡng lân (tham khảo từ “ĐÁNH GIÁ THỰC TRẠNG HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI LÂN TRONG ĐẤT PHÙ SA GLÂY TRỒNG LÚA TẠI MỘT SỐ Xà THUỘC HUYỆN TIÊN LỮ, TỈNH HƯNG YÊN”) Qua trình tìm hiểu nghiên cứu tài liệu, chúng em rút kết luận: Đất mơi trường thích hợp vi sinh vật, nơi cư trú rộng rãi vi sinh vật, thành phần số lượng so với môi trường khác Sở dĩ đất nói chung đất trồng trọt nói riêng có khối lượng lớn chất hữu Đó nguồn thức ăn cho nhóm vi sinh vật dị dưỡng, ví dụ nhóm vi sinh vật phân hủy hợp chất cacbon hữu cơ, nhóm vi sinh vật phân huỷ hợp chất Nitơ hữu Các chất vô có đất nguồn dinh dưỡng cho nhóm vi sinh vật tự dưỡng Đó nhóm phân huỷ chất vơ cơ, chuyển hố chất hợp chất P, S, Fe, Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng pháp triển hệ vi sinh vật đất như: biện pháp canh tác, tưới tiêu, bón phân, Vì vậy, để phát triển hệ sinh vật đất có vi sinh vật phân giải lân cần có biện pháp canh tác phù hợp với tính chất hệ vi sinh vật địa đất - Cày bừa xới đất cày sâu Luân canh trồng Làm cỏ sục bùn Tưới tiêu hợp lí ĐHSH12ATT 12 Phân lập vi sinh vật phân giải lân khó tan Kỹ thuật phân tích vi sinh Vsv phân giải lân có khả nâng cao hiệu sử dụng lân trồng, số có khả tổng hợp chất sinh trưởng thực vật, số khác lại có khả đối kháng vsv gây bệnh vùng rễ trồng Chúng sống hội sinh với vsv cố định nitơ Mặt khác, đại phận vi khuẩn có ích vi khuẩn cố định N, vi khuẩn nitrat hóa, vi khuẩn amon hóa ure, vi khuẩn phân giải xenlulo, vi khuẩn phân giải hợp chất hữu cơ, phát triển mạnh độ ẩm 60 – 80% Độ ẩm thấp (