Nghiên cứu hiệu quả hai phương pháp đông phôi chậm và đông phôi thủy tinh hóa

1 TV N ThƠnh công c a m t quy trình th tinh ng nghi m đ c th hi n qua t l mang thai Hi n nay, xu h ng gi m s l ng phôi chuy n nh ng không lƠm gi m t l mang thai Vi c l a ch n phơi có ch t l ng t t nh t đ chuy n, k t h p v i ch ng trình tr l nh s giúp ng i b nh ti t ki m chi phí đáng k , đ ng th i góp ph n c i thi n t l thai c ng d n m t chu k có kích thích bu ng tr ng vƠ t ng tính an toƠn c a k thu t u tr Theo th ng kê c a Van Voorhis (1995), tr l nh phơi có kh n ng lƠm t ng t l mang thai lên kho ng 6,6%, tính m i noưn thu đ c sau ch c hút vƠ chi phí u tr s gi m 25-45% so v i chu kì chuy n phơi t i, bên c nh k t qu s n khoa l i cao h n h n[1],[2],[3],[4] có ph ng pháp tr l nh đ c áp d ng lƠ: H nhi t đ ch m vƠ th y tinh hóa S khác bi t c a ph ng pháp nƠy lƠ t c đ h nhi t vƠ n ng đ ch t b o qu n H nhi t đ ch m đ c Whittingham gi i thi u l n đ u tiên vƠo nh ng n m đ u th p niên 70 mơ hình phơi chu t Em bé đ u tiên t phôi ng i đông l nh th gi i đ i b ng ph ng pháp nƠy đ c ghi nh n vƠo n m 1983 [5] Trong ph ng pháp h nhi t đ ch m, m u t bƠo đ c lƠm l nh v i t c đ h nhi t ch m (1-30C/1 phút) t nhi t đ sinh lỦ xu ng nhi t đ r t th p (kho ng - 800C) tr c đ a m u vƠo l u tr ni - t l ng NgoƠi ra, t c đ rư đông c ng di n ch m, trình xơm nh p vƠ lo i b ch t b o v đông l nh (CPA) đ c di n qua nhi u b c nh Do n ng đ CPA s d ng th p vƠ tr i qua nhi u b c, t bƠo tránh đ c s c th m th u gơy b i n ng đ CPA, đ ng th i kh n ng gơy đ c cho t bƠo th p VƠo n m 1985, Rall vƠ Fahy đư ch ng minh đ c phơi chu t có th đ c đơng l nh thƠnh công b ng m t ph ng pháp m i, đ c g i lƠ th y tinh hóa(non - equylibrium cryopreservation method) [6] Em bé đ u tiên th gi i đ i b ng k thu t nƠy đ c báo cáo vƠo n m 2002 (Liebermann vƠ cs.,2002; Shaw Jones,2003) [7], [8] Trong k thu t th y tinh hóa, ba y u t quan tr ng góp ph n vƠo s thƠnh công c a k thu t lƠ n ng đ c a CPA s d ng, t c đ h nhi t/lƠm m vƠ th tích m u tr l nh (Vajta vƠ Nagy, 2006), (Yahin vƠ Arav, 2007) [9],[10] có th chuy n m t l ng mơi tr ng có ch a phơi t d ng l ng thƠnh d ng "kính", CPA c n ph i đ c s d ng n ng đ r t cao Trong m t th i gian dƠi, dù có nh ng h n ch v m t hi u qu nh ng h nhi t đ ch m đư đ c xem lƠ m t ph ng pháp tr l nh chu n m c ngƠnh công nghi p ch n nuôi c ng nh IVF ng i Trái l i, m t kho ng th i gian dƠi sau đ c gi i thi u, th y tinh hóa v n đ c xem lƠ m t k thu t mang tính th nghi m nhi u lỦ Trong đó, lo ng i v đ c tính có th có c a vi c s d ng ch t b o qu n n ng đ cao phơi vƠ khó kh n vi c thi t l p m t h th ng lƠm l nh v i t c đ cao lƠ nh ng tr ng i Vì v y, cho đ n nay, nhƠ khoa h c th gi i v n liên t c th c hi n nghiên c u so sánh u nh c m c a ph ng pháp, c ng nh theo d̃i s c kh e, b nh t t c a nh ng tr sinh t ph ng pháp tr l nh đ đ a l a ch n t i u an toƠn T i trung tơm h tr sinh s n Qu c Gia, k thu t đông l nh ch m đ c th c hi n thƠnh công n m 2002, th y tinh hóa b t đ u tri n khai n m 2006, v i phôi giai đo n phơn chia (phôi ngƠy vƠ phôi ngƠy 3) T i th i m nghiên c u (2012- 2013), h u h t trung tơm h tr sinh s n Vi t Nam, đ u đư th c hi n th y tinh hóa phơi m i vƠ ti p t c rư đông nh ng phôi đư đông l nh ch m Tuy nhiên, ch a có m t nghiên c u theo d̃i d c nƠo t i Vi t Nam, đánh giá hi u qu quy trình tr l nh thơng qua tiêu chí:t l phơi s ng, t l có thai, t l sinh s ng, c ng nh y u t liên quan, tiên l ng k t qu có thai, theo d̃i s hình thƠnh phát tri n chi u cao, n ng, th ch t, trí tu , tơm v n đ ng, b nh t t t sinh cho đ n tu i đ đ a tiên l ng cho s phát tri n ti p theo cho nh ng tr sinh t ph ng pháp nƠy Do th c hi n đ tƠi: “Nghiên c u hi u qu hai ph ng ph́p đông phôi ch m v̀ đông phôi th y tinh h́a"v i m c tiêu: ́nh gí đ c m phôi sau rư đông c a hai ph ng ph́p đông phôi ch m vƠ đông phôi th y tinh hóa ́nh gí m t s y u t liên quan vƠ tiên l ng c a hai ph ng ph́p đông phôi ch m vƠ đông phôi th y tinh hóa Formatted: bd, Justified, Indent: Left: cm, First line: cm, Line spacing: Multiple 1.25 li Ch ng T NG QUAN 1.1 Nh ng thay đ i bên t bƠo qú tr̀nh tr l nh Hình 1.1 Ph n ng c a phôi cho v̀o môi tr ng ć ch a CPA [9] (CPA: ch t b o v l nh) A: Phôi phôi bƠo B: Các phôi bƠo b m t n ti p xúc môi tr c lƠm cho kích th c phơi co nh (khi v a ng tr l nh) C: Khi CPA vƠo bên phôi bƠo vƠ thay th l m t đi, lúc nƠy kích th c c a phơi đ c t bƠo đư c ph c h i Nguyên lỦ c a tr l nh lƠ gi m nhi t đ c a môi tr hay m u mô xu ng nhi t đ r t th p, th l ng) ng n ng ch a m u t bƠo ng lƠ 196ºC (nhi t đ sôi c a ni-t nhi t đ th p nƠy, h u h t ho t đ ng sinh h c bên t bƠo bao g m ph n ng sinh hoá vƠ ho t đ ng trao đ i ch t b ng ng l i Nh đó, t bƠo s ng d ng ti m sinh (hybernate) vƠ có th b o qu n m t th i gian r t dƠi V i u ki n nhi t đ th p, phơn t n ch t hoƠ tan môi tr bƠo t n t i d c, ng xung quanh c ng nh v t ch t bên t i d ng k t h p (d ng tinh th vƠ d ng kính), đó, khơng có b t k y u t nƠo t môi tr ng bên c ng nh bên ngoƠi có th tác đ ng đ n t bƠo giai đo n nƠy Tuy nhiên, nhi t đ c th c a đa s loƠi đ c ki m soát ch t ch , nh t lƠ đ ng v t có vú Do đó, q trình tr l nh, vi c h nhi t đ c a t bƠo v m c d m t môi tr i 0ºC có th đ a t bƠo vƠo ng khơng sinh lỦ H u qu lƠ t n th ng có th x y t t c giai đo n c a trình h nhi t đ Trong trình lƠm l nh vƠ rư đông, m t s thay đ i môi tr ch a t bƠo vƠ c b n thơn t bƠo có th nh h ng ng đ n c u trúc, ch c n ng, s toƠn v n vƠ kh n ng s ng c a t bƠo sau rư đông M t chu k tr l nh th ông l nh: (1) ng tr i qua ba giai đo n quan tr ng lƠ a t bƠo t nhi t đ sinh lỦ 37ºC xu ng nhi t đ r t th p -196ºC (2) L u tr : M u t bƠo đ (3) Rư đông: c b o qu n ni-t l ng a t bƠo t nhi t đ th p c a ni-t l ng v nhi t đ sinh lỦ c n đ t bƠo ti p t c phát tri n Trong trình lƠm l nh, tu theo t ng giai đo n h nhi t mƠ t n th ng t bƠo có th khác Trong giai đo n h nhi t t 15ºC đ n -5ºC, h t lipid, mƠng giƠu lipid vƠ s i vi ng bên t bƠo có th b t n th ng [10] ơy lƠ nh ng t n th ng không th ph c h i đông l nh noưn So v i nh ng loƠi khác, gi t lipid ch a t bƠo noưn ng it ng đ i th p h n Nh ng u nƠy c ng không lo i tr kh n ng t n th ng t bƠo noưn ng i q trình đơng l nh M t khác, kho ng nhi t đ nƠy có th gơy t n th ng mƠng vƠ polymer hoá vi ng, s lƠm r i lo n kh n ng s p x p c a nhi m s c th m t ph ng xích đ o t bƠo phơn chia vƠ k t qu lƠ gơy hi n t ng l ch b i trình phơn chia c a t bƠo [12] M t s th ng đ nh h ng khác mƠ kho ng nhi t đ nƠy gơy cho t bƠo c nh c đ n nh vi c gi m t c đ ho t đ ng c a men (enzyme) s d ng trình chuy n hoá c a t bƠo Nghiên c u cho th y nhi t đ gi m t 37ºC xu ng 7ºC ho t đ ng c a men gi m l n Tuy nhiên, nh h ng c a vi c gi m ho t đ ng men lên kh n ng phát tri n c a t bào sau nƠy v n ch a đ tr ng nuôi c y t bƠo th c lƠm sáng t [13] Bên c nh khí hồ tan, mơi ng dùng khí CO2 lƠm h đ m đ b ng pH môi tr ng Khi nhi t đ h xu ng th p, khí nƠy khơng hoƠ tan mơi tr kích th ng n a mƠ tách t o thƠnh b t khí S l c c a b t khí cƠng l n vi c chèn ép lƠm t n th d ng ng vƠ ng đ n c u trúc t bƠo cƠng nghiêm tr ng [14] Khi t bƠo đ c lƠm l nh t -5ºC đ n -15ºC hi n t th đá t phơn t n (môi tr c tinh t môi tr ng sát bên ngoƠi t bƠo ng ngo i bƠo) vƠ bên t bƠo (mơi tr hi n S hình thƠnh tinh th đá có th gơy t n th bƠo vƠ bƠo quan bên ng hình thƠnh tinh ng n i bƠo) s xu t ng c h c lên mƠng t ơy lƠ giai đo n gơy t n th ng l n nh t vƠ quan tr ng nh t mƠ t bƠo ph i tr i qua q trình lƠm l nh vƠ rư đơng [11] N môi tr n c lƠ thƠnh ph n chi m th tích l n nh t bên t bƠo c ng nh ng bên ngoƠi t bƠo Khi nhi t đ cƠng gi m, s l c chuy n thƠnh tinh th đá cƠng t ng, l h u qu lƠ n ng đ ch t tan môi tr ng n bƠo b co nh m c, s t n th th l ng gi m d n, ng ngo i bƠo t ng gơy m t b ng v áp l c th m th u gi a t bƠo v i môi tr t bƠo ch t b rút ngoƠi vƠ kích th c ng phơn t ng H u qu lƠ n c t bên c t bƠo tr nên co nh N u t ng mƠng lipoprotein c a t bƠo x y không th ph c h i [15] T ng nhi t đ ti m tƠng c ng lƠ m t h u qu c a s hình thƠnh tinh th đá Các phơn t n c chuy n sang th r n s gi i thoát m t l nhi t N u m t lúc có nhi u phơn t n l ng c chuy n sang th r n nhi t ng đ l n đ lƠm thay đ i nhi t đ t vƠi đ ơm lên 0ºC S thay đ i nhi t đ đ t ng t nƠy có th lƠm nh h ng đ n c u trúc vƠ ch c n ng c a t bƠo sau rư đơng hay th m chí lƠm t bƠo ch t q trình lƠm l nh Do đó, trình h nhi t đ ch m, vi c h n ch phơn t n c chuy n tr ng thái lúc lƠ t i quan tr ng T -50ºC đ n -150ºC, t n th ng mƠng su t nh ng đ t gưy mƠng su t nƠy không gi ng nh s đ t gưy mƠng su t x y hi n t ng s c th m th u nhi t đ l u tr m u (d l ng -196ºC), t bƠo b nh h i -150ºC th ng lƠ nhi t đ c a ni-t ng b t l i nh t toƠn b quy trình tr l nh Tuy nhiên, nh ng ph n ng t o thƠnh g c t vƠ nh ng s n ph m đ t gưy c a đ i phơn t b i b c x ion hoá hay s n ph m không mong mu n nƠy, c ng nh s tác đ ng c a b c x có kh n ng gơy đ t gưy ho c gơy nh ng t n th ng khác cho ADN M c dù v y, cho đ n nay, v n ch a có m t b ng ch ng nƠo r̃ rƠng v nh h ng c a b c x lên m u t bƠo l u tr ni-t l ng 1.2 Ćc bi n ph́p h n ch t n th ng t bƠo tr l nh 1.2.1 S d ng ch t b o qu n l nh (CPA) S hình thƠnh tinh th đá trình h nhi t đ lƠ y u t nh h ng quan tr ng nh t đ n kh n ng s ng c a t bƠo sau m t chu trình lƠm l nh - rã đông [14] Tinh th đá đ c hình thƠnh ng u nhiên b t k v trí nƠo bên vƠ bên ngoƠi t bƠo Do đó, vi c h n ch hình thƠnh tinh th đá lƠ u ki n tiên quy t đ m t ch ng trình tr l nh đ t t l thƠnh công cao Vi c phát hi n vai trò c a glycerol tr l nh đ c xem lƠ m t phát ki n quan tr ng, góp ph n thúc đ y k thu t tr l nh phát tri n [16] Nhi u th nghi m khác đư đ c th c hi n v i m c đích tìm nh ng ch t m i v i kh n ng b o v t bƠo s ng su t trình đơng l nh vƠ rư đơng t nƠy đ ng t glycerol Nh ng ch t c g i m t tên chung lƠ ch t b o v đông l nh (CPA) CPA lƠ nh ng ch t có kh n ng gi ng lƠ hoƠ tan đ vƠ gơy c n tr s chuy n tr ng thái gi a n c vƠ đá Chúng t nh ng phơn t sinh h c v i vai trò “thay th n ch đ c n c ng tác v i c” t bƠo, nh h n c s hình thƠnh tinh th đá n i bƠo nhi t đ h th p [17] M t vai trò khác c a CPA c ng không ph n quan tr ng lƠ t bƠo b o v nhi t đ th p [11] Do không t o thƠnh tinh th , CPA h n ch s gia t ng n ng đ c a ch t hoƠ tan Nó g n k t lên mƠng bƠo t t bƠo phơn t n ng đ b o v c ngo i bƠo b t đ u chuy n sang d ng tinh th Tuy nhiên, nh ng ghi nh n v hi u qu c a t ng lo i CPA lên t bƠo khác ch d a quan sát th c t , ch a đ d ng CPA th ng đ c ch ng minh v c ch [12] Hai c s d ng đông l nh lƠ CPA có kh n ng th m th u vƠ CPA khơng có kh n ng th m th u qua mƠng t bƠo Hai lo i CPA nƠy có tính ch t vƠ cách th c ho t đ ng khác nhau, nh ng h tr cho vai trò lƠ tác nhơn kh n c bên t bƠo, giúp h n ch s t o thƠnh tinh th đá n i bƠo M t m c n l u Ủ lƠ bên c nh nh ng l i m đư nêu, h u h t CPA đ u có kh n ng gơy đ c tính v i n ng đ vƠ th i gian ti p xúc, nh t lƠ c tính c a CPA t l thu n nhi t đ sinh lỦ [11] CPA có kh n ng th m th u lƠ nh ng ph c h p oligohydoxy (nh ethanol ho c ph c h p c a ethanol), hoƠ tan đ c n c, kh n ng gơy đ c cho t bƠo th p vƠ có th xơm nh p vƠo t bƠo qua mƠng bƠo t nh kh i l ng ng phơn t nh V i nh ng tính ch t nƠy, CPA có th xơm nh p vƠo bên vƠ th ch phơn t n đá n i bƠo vƠ gi m t n th c a CPA nƠy môi tr môi tr c, giúp gi m s hình thƠnh tinh th ng c a t bƠo NgoƠi ra, s hi n di n ng đông l nh, lƠm cho n ng đ ch t hoƠ tan ng ngo i bƠo, t ng lên đáng k so v i môi tr ng t bƠo i u nƠy gơy s m t b ng v áp su t th m th u gi a bên vƠ bên ngoƠi t bƠo ng th i, vai trò thay th phơn t n c a CPA, giúp cho kích th c c a t bƠo nhanh chóng h i ph c, sau đ rút kh i t bƠo, nh gi m đ tr ng thái co bƠo t c bên t bƠo c hi n t ng t n th c ng mƠng n u t bƠo ng lơu Các lo i CPA có kh n ng th m th u th ng đ c s d ng IVF bao g m 1,2-propanediol (PROH) (hay propylene glycol), dimethylsulfoxide (DMSO), glycerol, hay 1,2-ethanediol (hay ethylene glycol - EG) Các CPA nƠy th ng ho t đ ng pha đ u tiên c a trình kh n c pha đ u tiên này, t bƠo ti p xúc v i m t dung d ch có ch a CPA có kh n ng th m th u, s hi n di n c a nh ng ch t nƠy chênh l ch v áp su t th m th u, giúp rút n môi tr ng ngo i bƠo t o m t c kh i t bƠo CPA s t t vƠo bên t bƠo, thay th phơn t n th m th u c a mƠng bƠo t ng đ i v i n ng th i, c Vì kh n ng c l n h n đ i v i CPA, đó, q trình m t n c t bƠo di n nhanh h n so v i l ngoƠi vƠo bên t bƠo, thay th phơn t n c H u qu lƠ th tích t bƠo gi m nhanh th i gian đ u ti p xúc v i mơi tr đó, CPA đư thay th hoƠn toƠn l ng n ng CPA t bên ng tr l nh Sau c m t, t bƠo s khơi ph c hình d ng v th tích ban đ u Nh đư trình bƠy, có b n lo i CPA th ng đ c s d ng lƠ glycerol, DMSO, EG vƠ PROH Các lo i CPA có th đ c s d ng đ n l hay ph i h p Nhìn chung vi c l a ch n lo i CPA nƠo s ph thu c vƠo tính th m th u c a mƠng t bƠo vƠ kh n ng gơy đ c c a lo i CPA Glycerol hay g i lƠ glycerine, lƠ m t h p ch t đ ng c a r u Glycerol có m t nhi u t bƠo gan c a nh ng loƠi đ ng v t có kh n ng s ng u ki n nhi t đ r t th p ( vùng c c) giúp cho máu c a nh ng đ ng v t nƠy khơng b đơng, t ng thích v i nh ng v t ch t sinh hoá t bƠo s ng Chính th , kh n ng gơy đ c c a glycerol đ i v i t bƠo đ th p nh t vƠ đ t n th c x p vƠo lo i c s d ng nhi u vi c b o v t bƠo b ng cách lƠm gi m ng gơy s hình thƠnh tinh th đá Tuy nhiên, nh glycerol l i n m c m c a kh n ng th m qua mƠng t bƠo ch m Dimethyl sulfoxide (DMSO) có kh n ng hoƠ tan nhi u lo i ch t h u c khác nh carbonhydrate, polymer vƠ peptit, c ng nh mu i vơ c vƠ khí Trong tr l nh, DMSO đ c s d ng r ng rưi đ b o v bƠo quan, mô vƠ t bƠo Kh n ng th m nhanh qua mƠng t bƠo c a DMSO đư kh c ph c đ c nh c m c a glycerol, có th rút ng n đ gian ti p xúc c a t bƠo v i môi tr c th i ng CPA nh m h n ch nh ng tác đ ng b t l i không mong mu n c a CPA lên t bƠo Tuy nhiên, m t nh c m c a DMSO lƠ kh n ng gơy đ c cho t bƠo cao, đ c bi t ti p xúc v i t bƠo nhi t đ cao hay th i gian ti p xúc dƠi S li u cho th y noưn ti p xúc v i dung d ch ch a DMSO th i gian dƠi s không b nh h kh n ng th tinh vƠ phát tri n thƠnh phôi, nh ng t l l ch b i ng đ n noưn nƠy l i t ng lên đáng k so v i noưn khơng ti p xúc v i DMSO [18] Do đó, s d ng DMSO tr l nh, ng i ta th ng đ t bƠo ti p xúc mơi tr ng có ch a DMSO nhi t đ th p (0-4ºC) nh m lƠm gi m đ c tính c a DMSO đ i v i t bƠo Ethylene Glycol (EG) đ c bi t đ n tr monoethylene glycol hay 1,2-ethanediol EG th l nh th ng đ ng d ng c s d ng r ng rưi tr l nh v i vai trò lƠ ch t b o v cho bƠo quan c a t bƠo nh tính th m qua mƠng nhanh tr ng l ng phơn t th p Kh n ng gơy đ c c a EG lên t bƠo, ph thu c vƠo n ng đ , nhi t đ vƠ th i gian ti p xúc DMSO có tính th m nhanh nh t, PROH có tính th m qua mƠng nhanh h n glycerol ThƠnh ph n nƠy c ng đ v i t bƠo vƠ đ c xem lƠ có kh n ng gơy đ c th p đ i c s d ng nhi u đ lƠm dung d ch hoƠ tan d c ph m Tuy nhiên, m t s nghiên c u ch ng minh r ng PROH có kh n ng lƠm t ng t l t phơn chia (pathenogenetic activation) c a noưn chu t sau tr l nh vƠ rư đông s d ng n ng đ cao (1,5 mol/l) [18] Vi c s d ng k t h p hay nhi u CPA m t dung d ch đông l nh, nh m lƠm t ng kh n ng kh n c t bƠo vƠ lƠm gi m đ c tính c a t ng thƠnh ph n riêng l lên t bƠo, lƠ mơ hình th ng g p ch ng trình tr l nh hi n l nh v c IVF [19] Khi s d ng lo i CPA có kh n ng th m qua mƠng t bƠo, trình lƠm l nh, đ c tính phơn t l nhanh h n so v i l rư đông, n ng l n, nên n c s b kéo ngoƠi ng CPA xơm nh p vƠo bên t bƠo Ng c t mơi tr ng bên ngoƠi có khuynh h c l i, ng vƠo t bƠo v i t c đ nhanh h n Tình tr ng nƠy lƠm cho t bƠo b thay đ i hình d ng, co nh trình m t n c hay phình to n c vƠo tr l i t bƠo q trình rư đơng Ng i ta th y n u s thay đ i v th tích v v i ban đ u có th nh h t 40% so ng đ n c u trúc bên c a t bƠo [20] h n ch s thay đ i th tích m c c a t bƠo, môi tr l nh, rư đơng, CPA khơng có tinh th m qua mƠng t bƠo th sung ơy lƠ nh ng ch t có kh i l xơm nh p vƠo t bƠo qua mƠng bƠo t ng đ ng tr cb ng phơn t l n nên khơng có kh n ng ng 10 Các CPA ngo i bƠo đ oligosaccharide khác Chúng c s d ng th ng lƠ sucrose hay bên ngoƠi t bƠo, h tr CPA có kh n ng th m th u trì s chênh l ch th m th u pha kh n CPA khơng có kh n ng th m th u, th trình kh n c ng ho t đ ng pha th hai c a pha nƠy, t bƠo tr ng thái ti p xúc v i m t dung d ch ch a h n h p g m CPA n i bƠo (ph n CPA đ th m vƠo bên t bƠo, thay th n b c đ u tiên đư c) vƠ CPA ngo i bƠo i u nƠy giúp tái l p s m t c n b ng vƠ t o pha kh n n c t bƠo Các c s d ng c ti p theo, giúp cho s kh c c a t bƠo x y tri t đ 1.2.2 Ki m sót t c đ l̀m l nh v̀ rã đông 1.2.2.1 T c đ làm l nh (cooling rate) Khi nhi t đ h xu ng th p, ch có phơn t n sang d ng tinh th đá Nhi t đ cƠng gi m th p, s l c tinh t chuy n ng phơn t n c tinh t t o thƠnh đá cƠng nhi u H n h p mu i vƠ nh ng ch t hoƠ tan khác có mơi tr ng đông l nh v n gi nguyên tr ng thái vƠ t o thƠnh ph n không đông (unfrozen fraction) d n s l môi tr th m th u c a ph n không đông nƠy t ng ng tinh th đá cƠng t ng tr ng thái nƠy, đ th m th u c a ng ngo i bƠo gia t ng s m t n c, đòi h i t bƠo ph i có nh ng ph n ng b ng th m th u v i n ng đ môi tr bƠo b kh n c VƠ trình kh n ng ngo i bƠo K t qu lƠ t c nƠy ch d ng l i toƠn b v t ch t bên vƠ bên ngoƠi t bƠo chuy n sang d ng tinh th Do đó, t c đ lƠm l nh s nh h ng r t l n đ n kh n ng kh n c vƠ đ c bi t lƠ kh n ng s ng c a t bƠo sau rư đông Th t v y, n u t c đ lƠm l nh nhanh, phơn t n c nhanh chóng chuy n sang d ng tinh th đá, t bƠo khơng có đ th i gian đ q trình kh phơn t n c n i bƠo di n tri t đ , n cv n l i nhi u bên t bƠo vƠ chuy n sang d ng tinh th đá n i bƠo nhi t đ h xu ng h p, k t qu lƠ t bƠo b t n th ng T c đ lƠm l nh nhanh, c ng có th t o m t chênh l ch v áp su t th m th u l n gi a hai bên mƠng bƠo t ng, lƠm t n th ng đ đƠn h i c a mƠng N u t c đ lƠm 143 Zhao Y, Abuhamad A, Fleenor J et al (2016), “Prenatal and Postnatal Survival of Fetal Tetralogy of Fallot: A Meta-analysis of Prenatal outcomes and associated genetic disorders”, J Ultrasound Med, 35(5), 905-915 144 Bùi H i Nam, Tr n Danh C “Ch n đoán tr c sinh b t th ng, Nguy n Th Hi p Tuy t (2019), ng nhi m s c th thai có t ch ng Fallot”, T p chí Ph s n, t p 16 (04), 06-2019, tr 06-10 145 Dai W, Jiang Y, Gulinazi M el al (2015), “Application for prenatal diagnosis using both chromosomal karyotype analysis and BACs-onBeads assay’, Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi, 35 (3), pp 357-360 M CL C TV N Ch ng 1: T NG QUAN 1.1 Nh ng thay đ i bên t bƠo trình tr l nh 1.2 Các bi n pháp h n ch t n th ng t bƠo tr l nh 1.2.1 S d ng ch t b o qu n l nh (CPA) 1.2.2 Ki m soát t c đ lƠm l nh vƠ rư đông 10 1.2.3 Trang thi t b vƠ d ng c 12 1.3 Các ph ng pháp tr l nh 13 1.3.1 H nhi t đ ch m (Slow - freezing) 14 1.3.2 Th y tinh hóa (vitrification) 17 1.4 Các y u t nh h ng đ n k t qu chuy n phôi tr l nh 31 1.4.1 Các tác nhơn nh h 1.4.2 Tu i c a ng ng đ n hi u qu quy trình tr l nh 31 i v 33 1.4.3 Nguyên nhân vô sinh 34 1.4.4 K thu t h tr 34 1.4.5 Th i gian b o qu n phôi 34 1.4.6 Tu i phôi tr 1.4.7 S phôi đ c đông 34 c chuy n vƠo bu ng t cung 38 1.4.8 Ch t l ng phôi đ c chuy n vƠo bu ng t cung 38 1.4.9 nh h ng c a k thu t chuy n phôi 39 1.4.10 nh h ng c a n i m c t cung (NMTC) t i k t qu chuy n phôi đông l nh (FET) 40 1.4.11 nh h Ch ng 2: 2.1 it IT ng c a k thu t h tr phơi mƠng 43 NG VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C U 45 ng nghiên c u 45 2.1.1 Tiêu chu n l a ch n 45 2.1.2 Tiêu chu n lo i tr 45 2.2 a m nghiên c u 45 2.3 Th i gian nghiên c u 45 2.4 Ph ng pháp nghiên c u 45 2.5 C m u nghiên c u 45 2.6 Ph ng pháp ti n hƠnh vƠ thu th p s li u 46 2.7 S đ nghiên c u 48 2.8 Các ch tiêu vƠ bi n s nghiên c u 50 2.8.1 Phôi 50 2.8.2 M t s y u t liên quan đ n t l có thai 50 2.8.3 Thai 54 2.8.4 Di n bi n thai k 54 2.8.5 Trí tu vƠ tơm v n đ ng t sinh đ n tr tu i 55 2.9 K thu t thu th p s li u 56 2.10 X lỦ vƠ phơn tích s li u 56 2.11 M t s sai sót vƠ cách kh c ph c 57 2.12 V n đ đ o đ c nghiên c u 57 Ch ng 3: K T QU NGHIÊN C U 58 3.1 c m phôi tr 3.1.1 c vƠ sau rư đông c a ph ng pháp 58 c m m u phôi nghiên c u 58 3.1.2 M i t ng quan v s l ng phôi qua b c k thu t theo phân đ phôi 60 3.1.3 Ch t l ng phôi tr c vƠ sau rư đông 65 3.2 M t s y u t liên quan vƠ tiên l 3.2.1 ng c a ph ng pháp 69 c m c a b nh nhơn nghiên c u 69 3.2.2 M t s y u t liên quan đ n k t qu có thai c a hai ph 3.2.3 K t qu vƠ tiên l ng c a ph ng pháp 71 ng pháp 102 Ch ng 4: BÀN LU N 108 4.1 BƠn lu n v ph 4.1.1 it ng pháp nghiên c u 108 ng nghiên c u vƠ ph 4.1.2 C m u nghiên c u – ng pháp nghiên c u 108 c m nghiên c u 109 4.2 BƠn lu n v đ c m phôi tr c vƠ sau rư đông c a ph ng pháp đông ch m vƠ th y tinh hóa 109 c m m u phôi nghiên c u 109 4.2.1 4.2.2 M i t ng quan v s l 4.2.3 ánh giá ch t l ng phôi qua b ng phôi sau rư vƠ tr c k thu t 109 c chuy n 112 4.3 BƠn lu n v m t s y u t liên quan vƠ tiên l ng c a ph ng pháp đông ch m vƠ th y tinh hóa 119 c m b nh nhơn vƠ m i liên quan đ n k t qu có thai 119 4.3.1 4.3.2 BƠn lu n v m t s yêu t nh h ng đ n k t qu có thai 122 4.3.3 BƠn lu n v k t qu thai nghén vƠ tiên l ng s c kh e c a tr sinh t phôi đông ch m vƠ phôi th y tinh hóa 136 4.4 BƠn v nh ng h n ch c a nghiên c u 146 K T LU N 147 KHUY N NGH 150 NH NG ́NG ǴP M I C A NGHIÊN C U CƠNG TRÌNH Ã CƠNG B LIÊN QUAN TÀI LI U THAM KH O PH L C N LU N ÁN DANH M C B NG B ng 1.1: M t s d ng c đ c s d ng ph bi n t i trung tơm TTON th gi i 22 B ng 2.1: Th i m quan sát phôi, vƠ giai đo n phát tri n t ng ng t ng th i m 51 B ng 2.2 ng thu n đánh giá phôi giai đo n phơn chia 52 B ng 2.3 ng thu n đánh giá ch t l ng phôi ngƠy 53 B ng 3.1 c m m u phôi nghiên c u 58 B ng 3.2 S l ng phôi tr c đông, sau rư, tr c chuy n theo phơn đ phôi 60 B ng 3.3 M it l B ng 3.4 M it M it l B ng 3.6 ng quan gi a s l M it l B ng 3.8: M it ng quan gi a s l c chuy n c a ph c chuy n c a ph ng pháp 63 c chuy n c a ph c đông vƠ s l ng ng pháp 63 ng phơi t t (đ 3) tr ng tính theo ph B ng 3.11 Trung bình s phơi tr ng ng pháp 62 ng phôi x u (đ 1) sau rư vƠ s l ng quan gi a s l ng phôi t t tr c đơng vƠ s ng phơi trung bình (đ 2) sau rư vƠ s ng quan gi a s l cl ng pháp 61 ng pháp 62 c chuy n c a ph ng phôi t t (đ 3) tr c đông ng phôi t t (đ 3) sau rư vƠ s l ng quan gi a s l B ng 3.10: B ng giá tr l ng phôi x u (đ 1) tr ng phôi trung bình (đ 2) tr M it l ng phơi trung bình (đ 2) tr ng quan gi a s l phôi x u (đ 1) tr B ng 3.9: ng pháp 61 ng phôi x u (đ 1) sau rư c a ph M it c đơng vƠ s ng phơi trung bình (đ 2) sau rư c a ph phôi t t (đ 3) tr B ng 3.7 ng phôi t t (đ 3) tr ng phôi t t (đ 3) sau rư c a ph vƠ s l B ng 3.5 ng quan gi a s l c đông vƠ s ng pháp 64 ng trình t ng phôi t t tr ng quan gi a s c chuy n 64 c đông/ chu k FET theo phơn đ phơi 66 B ng 3.12 Trung bình s phôi sau rư/chu k FET theo phơn đ phôi 67 B ng 3.13 Trung bình s phơi tr B ng 3.14 Ch t l c chuy n/chu k FET theo phơn đ phôi 68 ng phôi sau rư vƠ tr c chuy n tính theo t l 68 B ng 3.15 Nhóm tu i 69 B ng 3.16 i m chuy n phôi 69 B ng 3.17 S phôi chuy n/ chu k FET 70 B ng 3.18 M t s đ c m c a nhóm BN đơng phơi ngƠy vƠ BN đơng phơi ngƠy c a ph ng pháp 70 B ng 3.19 M i liên quan gi a tu i v vƠ k t qu có thai 71 B ng 3.20 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a đ dƠy niêm m c t cung 73 B ng 3.21 T su t chênh v k t qu có thai gi a nhóm đ dƠy niêm m c t cung 74 B ng 3.22 B ng giá tr tiên l l ng k t qu có thai t i m c t c a s ng phôi chuy n 75 B ng 3.23 M i liên quan gi a có ≥1 phơi t t tr c đơng vƠ k t qu có thai 75 B ng 3.24 M i liên quan gi a có ≥1 phơi trung bình (đ 2) tr c đơng k t qu có thai 76 B ng 3.25 M i liên quan gi a có ≥1 phơi x u tr c đơng vƠ k t qu có thai 76 B ng 3.26 M i liên quan gi a có ≥1 phơi t t sau rư vƠ k t qu có thai 77 B ng 3.27 M i liên quan gi a có ≥1 phơi trung bình (đ 2) sau rư vƠ k t qu có thai 78 B ng 3.28 M i liên quan gi a có ≥1 phôi x u sau rư vƠ k t qu có thai 78 B ng 3.29: M i liên quan gi a có ≥1 phơi t t tr c chuy n vƠ k t qu có thai 79 B ng 3.30 M i liên quan gi a có ≥1 phơi trung bình (đ 2) tr c chuy n vƠ k t qu có thai 79 B ng 3.31 M i liên quan gi a có ≥1 phôi x u tr c chuy n vƠ k t qu có thai 80 B ng 3.32 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a m chuy n phôi 81 B ng 3.33 B ng giá tr tiên l l ng k t qu có thai t i m c t c a s ng phôi t t ngƠy tr c đông ch m 82 B ng 3.34 B ng giá tr tiên l l ng k t qu có thai t i m c t c a s ng phôi t t ngƠy tr c đơng th y tinh hóa 86 B ng 3.35 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phôi t t ngƠy tr c đông th y tinh hóa 88 B ng 3.36 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phôi t t ngƠy sau rư đông ch m 90 B ng 3.37 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phôi t t ngƠy sau rư th y tinh hóa 92 B ng 3.38 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phôi t t ngƠy sau rư th y tinh hóa 94 B ng 3.39 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phôi t t ngƠy 2- đông ch m tr c chuy n 96 B ng 3.40 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phôi t t ngƠy 2- th y tinh hóa tr c chuy n 98 B ng 3.41 B ng giá tr tiên l ng k t qu có thai t i m c t c a s l ng phơi t t ngƠy 3- th y tinh hóa tr c chuy n 100 B ng 3.42 Phơn tích h i quy đa bi n y u t nh h ng đ n k t qu có thai ph ng pháp th y tinh hóa 101 B ng 3.43 K t qu có thai vƠ di n bi n thai k sau chuy n phôi đông ch m 102 B ng 3.44 K t qu có thai vƠ di n bi n thai k sau chuy n phôi th y tinh hóa 103 B ng 3.45 T l có thai vƠ di n ti n thai k c a ph ng pháp 104 B ng 3.46 Cơn n ng trung bình thơ c a tr s sinh trai, gái t ng ng v i tu i thai 28-42 tu n 105 B ng 3.47 Cơn n ng, chi u cao trung bình thơ c a tr s trai, gái t ng ng t tháng đ n tu i 106 B ng 3.48 Phát tri n trí tu , tơm v n đ ng, b nh lỦ tr sinh sau chuy n phôi tr l nh 107 B ng 4.1 Giá tr c a s l ng phôi t t tr c đông tiên l ng k t qu có thai 129 B ng 4.2 Giá tr c a s l ng phôi t t sau rư tiên l ng k t qu có thai 131 B ng 4.3 Giá tr c a s l ng phôi t t tr c chuy n tiên l ng k t qu có thai 133 DANH M C BI U Bi u đ 3.1: Di n bi n ch t l rư, tr ng phôi theo th i m: tr c đông, sau c chuy n 65 Bi u đ 3.2 M i liên quan gi a đ dƠy niêm m c t cung vƠ k t qu có thai 72 Bi u đ 3.3 M i liên quan gi a s l Bi u đ 3.4 M i liên quan gi a m chuy n phơi vƠ k t qu có thai 80 Bi u đ 3.5 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy tr Bi u đ 3.6 c đông ch m tiên l c đông ch m tiên l ng phôi ng k t qu có thai 84 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy tr ng phôi ng k t qu có thai 82 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy tr Bi u đ 3.7 ng phơi chuy n vƠ k t qu có thai 74 c đơng th y tinh hóa tiên l ng phơi ng k t qu có thai 85 Bi u đ 3.8 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy tr c đông th y tinh hóa tiên l ng phơi ng k t qu có thai 87 Bi u đ 3.9 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy sau rư đông ch m tiên l Bi u đ 3.10 Bi u đ 3.11 ng k t qu có thai 91 ng k t qu có thai 92 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l ng phôi t t ngƠy sau rư th y tinh hóa tiên l Bi u đ 3.13 ng phôi ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l ng phôi t t ngƠy sau rư th y tinh hóa tiên l Bi u đ 3.12 ng k t qu có thai 89 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy sau rư đông ch m tiên l ng phơi ng k t qu có thai 93 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy 2- đông ch m tr c chuy n tiên l ng phôi ng k t qu có thai 95 Bi u đ 3.14 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy 3- đông ch m tr c chuy n tiên l ng phơi ng k t qu có thai 97 Bi u đ 3.15 ợ ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l ng phôi t t ngày 2- th y tinh hóa tr c chuy n tiên l ng k t qu có thai 97 Bi u đ 3.16 ng bi u th đ nh y, đ đ c hi u (ROC) c a s l t t ngƠy 3- th y tinh hóa tr c chuy n tiên l ng phơi ng k t qu có thai 99 DANH M C HÌNH Hình 1.1 Ph n ng c a phôi cho vƠo môi tr ng có ch a CPA Hình 1.2 Bình ch a ni t l ng tr phôi 12 Hình 1.3 Máy Cryologic 13 Hình 1.4 Máy Planner 13 Hình 1.5 S đ h nhi t đ h nhi t đ ch m 17 Hình 1.6 Cryoloop 24 Hình 1.7 Cryotop 25 Hình 1.8 Cryotec 26 Hình 1.9 Cryotip 27 Hình 1.10 HSV straw 27 Hình 1.11 Rapid-I 28 Hình 2.1 S đ nghiên c u nhóm phơi đơng ch m 48 Hình 2.2 S đ nghiên c u nhóm phơi th y tinh hóa 49 B GIÁO D C VÀ ÀO T O TR NG B YT I H C Y HÀ N I PHAN TH THANH LAN nghiên cứu hiệu hai ph-ơng pháp Đông phôi chậm đông phôi thủy tinh hãa LU N ÁN TI N S Y H C HÀ N I - 2020 B GIÁO D C VÀ ÀO T O TR NG B YT I H C Y HÀ N I PHAN TH THANH LAN nghiªn cøu hiệu hai ph-ơng pháp Đông phôi chậm đông ph«i thđy tinh hãa Chun ngƠnh : S n ph khoa Mư s : 62720131 LU N ÁN TI N S Y H C Ng ih ng d n khoa h c: GS.TS NGUY N VI T TI N HÀ N I - 2020 L IC M N V i t m lòng bi t n sơu s c, em xin g i l i c m n chơn thƠnh t i GS.TS Nguy n Vi t Ti n, ng i th y đư truy n đ t nh ng ki n th c sơu r ng, c ng nh t o u ki n t t nh t, đ ng viên em su t trình h c t p, nghiên c u đ hoƠn thƠnh lu n án Th y lƠ t m g ng sáng đ em su t đ i h c t p vƠ noi theo Em luôn ghi nh vƠ bi t n Th y Cô B môn Ph s n, B môn Nghiên c u khoa h c, B môn Mô phôi, B môn Nhi, Th y Cô H i đ ng ch m đ c ng, h c ph n, c ng nh chuyên đ , ti u lu n t ng quan, H i đ ng ch m lu n án c s đư ch b o, cho em Ủ ki n quỦ báu đ hoƠn ch nh lu n án Em xin chơn thƠnh c m n Ban giám hi u, Phòng đƠo t o sau phòng ban ch c n ng c a Tr ng i h c, i h c Y HƠ N i đư t o u ki n thu n l i cho em trình h c t p vƠ nghiên c u Tôi xin g i t i lưnh đ o vƠ toƠn th đ ng nghi p Trung tơm H tr sinh s n Qu c gia - B nh vi n Ph s n Trung ng, B nh vi n Ph s n H i Phòng, l i c m n chơn thƠnh đư ln giúp đ v m i m t công vi c, c ng nh h c t p đ tơi có th yên tơm h c t p vƠ nghiên c u Tôi xin đ c bi t c m n nh ng b nh nhơn đư đ ng Ủ tham gia nghiên c u nƠy Nh ng ng i đư r t tin t nhơn, giúp tơi có đ ng, h p tác, cung c p nh ng thông tin cá c nh ng d li u quỦ báu đ hoƠn thƠnh lu n án nƠy Tôi xin mưi ghi lòng t c d nh ng tình c m vƠ công n nƠy Ngày tháng n m 2020 Phan Th Thanh Lan L I CAM OAN Tôi lƠ Phan Th Thanh Lan nghiên c u sinh khóa 31 Tr ng ih cY is h ng d n HƠ N i, chuyên ngƠnh S n ph khoa xin cam đoan: ơy lƠ lu n án b n thơn tr c ti p th c hi n d c a GS.TS Nguy n Vi t Ti n Công trình nƠy khơng trùng l p v i b t k nghiên c u nƠo khác đư đ c công b t i Vi t Nam Các s li u vƠ thông tin nghiên c u lƠ hoƠn toƠn xác, trung th c vƠ khách quan, đư đ c xác nh n vƠ ch p thu n c a c s n i nghiên c u Tôi xin hoƠn toƠn ch u trách nhi m tr c pháp lu t v nh ng cam k t nƠy ảà N i, ngày tháng n m 2020 T́c gi Phan Th Thanh Lan CH VI T T T BG : butylene glycol BN : B nh nhơn CPA : Cryoprotective agents (Các ch t b o v đông l nh) Dex : dextran DMSO : Dimethyl sulfoxide EG : ethylene glycol FET : Frozen Embryo Transfer (Chuy n phôi đông l nh) Fic : Ficoll Gly : Glycerol HPC : hydroxypropyl cellulose IVF : Th tinh ng nghi m Me2SO : dimethylsulfoxide Met : methanol NMTC : Niêm m c t cung PEG : polyethylene glycol PG : propylene glycol PR : Pregnance rate (t l có thai) PROH : 1,2 – propanediol hay propylene glycol PVP : polyvilylpyrrolidone SR : Survial rate (t l s ng) TB : T bƠo 3,12,13,24-28,64,69,71-74,79-98,103,104,180 1-2,4-11,14-23,29-63,65-68,70,75-78,99-102,105-178,181- ... n đ tƠi: Nghiên c u hi u qu hai ph ng ph́p đông phôi ch m v̀ đông phôi th y tinh h́a"v i m c tiêu: ́nh gí đ c m phôi sau rư đông c a hai ph ng ph́p đông phôi ch m vƠ đông phôi th y tinh hóa... c Gia, k thu t đông l nh ch m đ c th c hi n thƠnh công n m 2002, th y tinh hóa b t đ u tri n khai n m 2006, v i phôi giai đo n phơn chia (phôi ngƠy vƠ phôi ngƠy 3) T i th i m nghiên c u (2012-... tơm h tr sinh s n Vi t Nam, đ u đư th c hi n th y tinh hóa phơi m i vƠ ti p t c rư đông nh ng phôi đư đông l nh ch m Tuy nhiên, ch a có m t nghiên c u theo d̃i d c nƠo t i Vi t Nam, đánh giá