Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia a trước chuyển phôi

Nghiên cứu thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích các trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán bệnh hemophilia A trước chuyển phôi tại Hà Nội” mã số 01C-08/11-2017-3 thực hiện

-

Nguyễn Kim Ngân

THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A

TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2019

-

Nguyễn Kim Ngân

THIẾT KẾ BỘ CHỈ THỊ STR PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN HEMOPHILIA A

TRƯỚC CHUYỂN PHÔI

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 8420101.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS Đặng Tiến Trường

TS Trần Đức Long

Hà Nội – 10/2019

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực nghiệm để hoàn thành luận văn, tôi đã may mắn nhận được sự hỗ trợ cả về vật chất và tinh thần từ các thầy cô, cộng

sự và bạn bè Tôi luôn trân trọng những sự giúp đỡ quý báu đó

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS.BS Đặng Tiến Trường – Phó

Chủ nhiệm Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y, người đã trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt cho tôi những kiến thức, kĩ năng chuyên ngành và tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi được học tập và nghiên cứu cho đến ngày hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Trần Đức Long – Khoa Sinh học,

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, người đã luôn hỗ trợ, động viên, chỉ bảo tôi khắc phục những thiếu sót và truyền cho tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy, cô Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và đặc biệt là các thầy cô Bộ môn

Di truyền học - những người đã giảng dạy cho tôi trong quá trình học tập; các cán

bộ của Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân Y, đặc biệt là ThS.BS Nguyễn Minh

Tâm, các cán bộ tại Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW và

Bệnh viện Nam Học và Hiếm muộn Hà Nội đã tận tình hỗ trợ tôi trong suốt quá trình thu mẫu

Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân sâu sắc tới những người bạn, người anh chị em tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN – chỗ dựa tinh thần vững chắc đã luôn ở bên cạnh động viên, chia sẻ, giúp đỡ, cổ vũ và giúp tôi vượt qua mọi giai đoạn khó khăn trong cuộc sống nói chung và trong quá trình hoàn thiện luận văn nói riêng

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn và ghi nhớ

Hà Nội, ngày 25 tháng 10 năm 2019 Học viên

Nguyễn Kim Ngân

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Bệnh hemophilia A 3

1.1.1 Tổng quan hemophilia A 3

1.1.2 Cơ sở phân tử của bệnh 5

1.1.3 Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A 11

1.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A 15

1.2.1 Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi 15

1.2.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A 16

1.3 Phân tích di truyền liên kết 19

1.3.1 Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết 19

1.3.2 Chỉ thị phân tử STR 21

1.3.3 Các chỉ số đa hình di truyền 22

1.4 Kỹ thuật PCR đa mồi 22

1.5 Kỹ thuật điện di mao quản 24

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng nghiên cứu 26

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu 26

2.2.2 Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen 27

2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu 28

2.3 Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 29

2.4 Các kỹ thuật được sử dụng 29

2.4.1 Giai đoạn tối ưu và xác định tính đa hình 29

2.4.2 Giai đoạn áp dụng và phân tích di truyền trước chuyển phôi 38

2.4.3 Giai đoạn xác nhận kết quả bằng chẩn đoán trước sinh 39

2.5 Các chỉ tiêu nghiên cứu 40

2.6 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 40

2.7 Vấn đề y đức và đạo đức trong nghiên cứu 40

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Bộ STR đa hình liên kết với gen F8 phục vụ PGT-M hemophilia A tại Việt Nam 41

3.1.1 Các STR nằm cách gen F8 1Mb 41

3.1.2 Kết quả tối ưu hóa quy trình PCR đa mồi khuếch đại các STR 42

3.1.3 Chỉ số đa hình và chỉ số dị hợp tử của các STR 48

3.1.4 Chuẩn hóa quy trình PGT-M trên mẫu tế bào phôi 52

3.2 Áp dụng bộ chỉ thị STR thiết kế cho gia đình bệnh nhân hemophilia A 56

3.2.1 Áp dụng quy trình PGT-M trên gia đình bệnh nhân 56

3.2.2 Kết quả mang thai và chẩn đoán trước sinh cho gia đình bệnh nhân 63

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

Kết luận 68

Kiến nghị 68

TÀI LIỆU THAM KHẢO 69

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng 4

Bảng 2 Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia 10

Bảng 3 Một số STR được sử dụng trong chẩn đoán Hemophilia A 18

Bảng 4 Thành phần D2 32

Bảng 5 Thành phần Mastermix 33

Bảng 6 Thành phần phản ứng PCR đơn mồi 34

Bảng 7 Chu trình nhiệt tiến hành phản ứng PCR đơn mồi 34

Bảng 8 Thành phần phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang 35

Bảng 9 Chu trình nhiệt phản ứng PCR đa mồi gắn màu huỳnh quang 35

Bảng 10 Thông tin mồi huỳnh quang 36

Bảng 11 Thành phần phản ứng biến tính DNA cho điện di mao quản 36

Bảng 12 Chu trình nhiệt biến tính DNA 36

Bảng 13 Thông tin các STR được sử dụng trong nghiên cứu 42

Bảng 14 Trình tự mồi khuếch đại các chỉ thị STR 43

Bảng 15 Kết quả nồng độ và độ tinh sạch DNA tách từ mẫu máu 44

Bảng 16 Nồng độ mồi trong phản ứng PCR đa mồi 47

Bảng 17 Kết quả tính toán chỉ số Ho, He, PIC 49

Bảng 18 Kết quả nồng độ sản phẩm WGA 05 mẫu phôi bào phục vụ tối ưu hóa 52

Bảng 19 Kết quả phân tích đột biến gen F8 ở phôi IVF 63

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp 3

Hình 2 Vị trí của gen tổng hợp FVIII 5

Hình 3 Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam 6

Hình 4 Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 7

Hình 5 Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 8

Hình 6 Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A 11

Hình 7 Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn int22 trong gen F8 12

Hình 8 Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 13

Hình 9 Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI 14

Hình 10 Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen 16

Hình 11 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản 24

Hình 12 Sơ đồ nghiên cứu 28

Hình 13 Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc 30

Hình 14 Giao diện phân tích kết quả phần mềm Genemapper 4.0 37

Hình 15 Sơ đồ vị trí các STR sử dụng trong nghiên cứu trên NST X 41

Hình 16 Kết quả tối ưu hóa các mồi X1 đến X5 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65 44

Hình 17 Kết quả tối ưu hóa các mồi X6 đến X10 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC 44

Hình 18 Kết quả tối ưu hóa các mồi X11 đến X15 ở dải nhiệt độ 55, 60, 65oC 45

Hình 19 Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có 46

Hình 20 Kết quả điện di mao quản phản ứng PCR đa mồi cho 14 cặp mồi có nồng độ phản ứng đã hiệu chỉnh 48

Hình 21 Biểu đồ tần số dị hợp tử quan sát Ho trong các quần thể nghiên cứu 50

Hình 22 Biểu đồ tần số dị hợp tử lý thuyết He trong các quần thể nghiên cứu 50

Hình 23 Biểu đồ chỉ số đa hình PIC trong các quần thể nghiên cứu 51

Hình 24 Biểu đồ tỉ lệ cá thể dị hợp tử các chỉ thị STR ở 2 bên gen F8 52

Hình 25 Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 1 53

Hình 26 Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 2 54

Hình 27 Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 3 54 Hình 28 Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 4 55 Hình 29 Kết quả tối ưu hóa trên phôi bào 5 55 Hình 30 Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q1 57 Hình 31 Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q2 58 Hình 32 Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q3 59 Hình 33 Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và phôi Q4 60 Hình 34 Kết quả phân tích di truyền liên kết phục vụ PGT-M hemophilia A của gia đình bệnh nhân tham gia nghiên cứu 62 Hình 35 Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng Longrange PCR do Viện Huyết học – Truyền máu Trung ương thực hiện 64 Hình 36 Kết quả điện di mao quản phân tích STR trên các mẫu máu bố, mẹ, con và dịch ối 65 Hình 37 Kết quả chẩn đoán trước sinh bằng phân tích di truyền liên kết sử dụng bộ STR thiết kế được 66

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

CGH Comparative genomic

CSGE Conformation sensitive gel

DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

DOP Degenerate oligonucleotide

F8 F8 gene Gen quy định yếu tố VIII

FISH Fluorescence in situ

Ho Observed Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử quan sát

He Expected Heterozygosity Chỉ số dị hợp tử lý thuyết

IVF In vitro fertilization Thụ tinh trong ống nghiệm

ICSI Intra-cytoplasmic sperm

injection

Tiêm tinh trùng vào bào tương trứng

MDA Multiple displacement

Chữ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

MLPA Multiplex ligation dependent

testing for Aneuploidies

Xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi phát hiện dị bội

PIC Polymorphism Information

PGT – M

Preimplantation genetic testing for monogenic/single gene disorders

Xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi phát hiện bệnh đơn gen

PGT – SR

Preimplantation genetic testing for chromosome structural rearrangements

Xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi phát hiện rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể

STR Short tandem repeat Trình tự lặp kế tiếp

WGA Whole genome amplification Khuếch đại toàn bộ hệ gen

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hemophilia A là bệnh rối loạn đông máu di truyền liên kết nhiễm sắc thể

(NST) X, do đột biến gen F8, giảm yếu tố VIII, gây chảy máu không cầm, có thể dẫn

tới tử vong Trên thế giới, tỷ lệ mắc bệnh khoảng 1/5000 người nam [38] Ở Việt Nam, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương, có khoảng

30.000 người mang gen F8 đột biến [82] Điều trị hemophilia A chủ yếu bằng truyền

máu tươi hoặc yếu tố VIII nên kinh phí điều trị rất cao nhưng không giải quyết được nguyên nhân bị bệnh Vì vậy, việc dự phòng không sinh con bị bệnh hoặc không mang gen bệnh bằng chẩn đoán trước sinh và xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi

là rất cần thiết

Kỹ thuật chẩn đoán trước sinh giúp tránh sinh con bị bệnh dựa trên việc chọc

ối ở thời điểm thai 16 tuần tuổi - tuy nhiên, cặp vợ chồng mang gen phải đối mặt với nguy cơ đình chỉ thai nghén khi thai nhi bị bệnh Để khắc phục hạn chế này, kỹ thuật xét nghiệm di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Testing –PGT) được ưu tiên sử dụng PGT là sự kết hợp giữa kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization – IVF) tạo phôi với việc chẩn đoán di truyền Việc lựa chọn trên nhiều phôi giúp khả năng chọn được phôi và mang thai không bị bệnh cao hơn nhiều việc chỉ lựa chọn trên một thai nhi trong chẩn đoán trước sinh Hơn nữa, PGT giúp các thai phụ tránh phải đình chỉ thai nghén, giảm gánh nặng về tâm lý và bảo vệ sức khỏe của người phụ nữ

Gen F8 lớn, tổn thương trong bệnh hemophilia A phức tạp nên khó có một kỹ thuật xác định trực tiếp các đột biến gen F8 trên tế bào phôi Bên cạnh đó, hiện tượng

khuếch đại hỏng một hoặc cả hai allele (Allele DropOut-ADO) ở mẫu tế bào phôi, được xác định trên 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi [12], có thể dẫn tới chẩn đoán sai Ngoài ra, ngoại nhiễm cũng là nguyên nhân phổ biến thứ hai gây chẩn đoán sai trong PGT Do vậy, kỹ thuật phân tích liên kết gen sử dụng nhiều trình tự lặp ngắn (Short Tandem Repeat – STR) giúp chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A được

ưu tiên lựa chọn vì giúp kiểm soát ADO và ngoại nhiễm

Các STR phục vụ PGT phải có tính đa hình cao và nằm gần gen tổn thương để

Tại Việt Nam, đã có nghiên cứu xây dựng quy trình PGT cho bệnh hemophilia

A dựa trên phân tích STR [2] nhưng một số STR nằm khá xa gen F8 Hơn nữa, các

báo cáo trên thế giới thấy tính đa hình của các STR này thấp, thậm chí tỷ lệ dị hợp tử quan sát chỉ đạt 1,5% trên một số quần thể người khác nhau [6, 61] Tính đa hình của các STR phục vụ PGT chưa được đề cập trên quần thể người Việt Nam [2]

Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ

chẩn đoán hemophilia A trước chuyển phôi” với hai mục tiêu:

1 Thiết kế bộ chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán hemophilia A cho quần thể

người Việt Nam, đảm bảo liên kết chặt với gen F8 và có chỉ số đa hình cao

trong quần thể này

2 Áp dụng bộ chỉ thị thiết kế được trong chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi bệnh hemophilia A cho gia đình bệnh nhân người Việt Nam

Nghiên cứu thuộc đề tài “Ứng dụng kỹ thuật Multiplex PCR phân tích các trình tự lặp ngắn trong chẩn đoán bệnh hemophilia A trước chuyển phôi tại Hà Nội”

mã số 01C-08/11-2017-3 thực hiện tại Phòng phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu,

Học viện Quân Y

Hình 1 Bệnh nhân hemophilia bị chảy máu trong cơ và biến dạng khớp

[15, 83]

Trong ba thể bệnh trên, hemophilia A là thể phổ biến nhất trên toàn thế giới,

cứ 100000 người nam thì khoảng 10 người mắc bệnh này trong đó 3 – 4 người thuộc

các nước châu Á [49, 74] Sự xuất hiện của các đột biến tự phát trên gen F8 được

phản ánh qua 30-33% các ca bệnh ở gia đình không có tiền sử [34, 51, 54] Người

4

đột biến gen F8 gây thiếu hoặc không tổng hợp được yếu tố VIII, làm rối loạn quá

trình đông máu biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của bệnh hemophilia A Triệu chứng lâm sàng thể hiện khác nhau giữa các bệnh nhân, trong đó triệu chứng chảy máu là đặc trưng của bệnh Các thể xuất huyết nhẹ có triệu chứng xuất huyết xảy ra khi răng sữa rụng hoặc nhổ răng Bệnh càng nặng thì triệu chứng xuất hiện càng sớm Bệnh hemophilia A thể nặng đặc trưng bởi bầm tím và chảy máu thường xuyên tái phát vào khớp, đặc biệt là đầu gối, mắt cá chân, hông và khuỷu tay gây giới hạn chuyển động của các khớp Bệnh nhân có thể chảy máu tự phát hoặc sau một chấn thương nhỏ Đây là nguyên nhân phổ biến khiến bệnh nhân hemophilia A có thể chảy máu đến chết sau chấn thương

Có thể chẩn đoán thể bệnh hemophilia A theo mức độ yếu tố VIII: bình thường

nồng độ FVIII ở người là 200 ng/ml, trường hợp bị bệnh, lượng yếu tố VIII giảm dưới 30% Hemophilia A được chia làm ba thể: nặng, trung bình và nhẹ Ở thể nặng, hoạt tính FVIII dưới 1%, những bệnh nhân này thường bị chảy máu vài lần trong tháng Với thể trung bình, hoạt tính FVIII từ 1-5%, những bệnh nhân này chỉ bị chảy máu sau những chấn thương nhẹ Còn ở thể nhẹ, hoạt tính FVIII từ 5-30% so với mức bình thường, những người này chỉ bị chảy máu sau phẫu thuật hoặc những chấn thương nặng, sau những động tác mạnh khi chơi thể thao [5]

Bảng 1 Phân loại thể bệnh Hemophilia theo biểu hiện lâm sàng [86]

(chiếm 15%)

1 – 5 % (0,01 – 0,05)

Chảy máu tự nhiên hoặc liên quan đến chấn thương nhỏ Chảy máu nặng sau chấn thương, phẫu thuật

5

Hiện nay đã có nhiều phương pháp điều trị và hỗ trợ bệnh nhân mắc hemophilia, trong đó điều trị liệu pháp gen hứa hẹn nhiều lợi ích vì bệnh được gây ra bởi khiếm khuyết gen, có thể điều trị để biến đổi một dạng bệnh từ thể nặng thành thể nhẹ của bệnh Sử dụng liệu pháp gen có thể kích hoạt lên đến 150% hoạt động của FVIII [48] Các nghiên cứu thực nghiệm trên chuột và chó đã chứng minh sự thành công khi sử dụng liệu pháp gen điều trị, tuy nhiên vẫn cần thêm các nghiên cứu

và thử nghiệm về khả năng đáp ứng miễn dịch ở người để đảm bảo độ an toàn khi áp dụng [33] Thêm vào đó, kinh phí cho liệu pháp gen còn cao so với mặt bằng kinh tế

xã hội ở Việt Nam (trung bình một người bệnh mức độ nặng chảy máu 40 lần 1 năm với chi phí điều trị có thể lên tới 1 – 2 tỷ đồng [88]) nên việc chẩn đoán hemophilia nói chung và chẩn đoán di truyền trước sinh và trước chuyển phôi nói riêng là công tác quan trọng nhằm giảm thiểu tối đa các hậu quả cho thế hệ sau của các gia đình mang gen bệnh

1.1.2 Cơ sở phân tử của bệnh

Gen F8 nằm ở vị trí Xq28 trên NST giới tính X (chrX:

154,835,795-155,022,753; University of California, Santa Cruz genome browser, GRCh38/hg38), là một trong những gen lớn nhất cơ thể, có kích thước 186 kb gồm

26 exon trong đó 24 exon có kích thước từ 62 bp - 262 bp và 2 exon lớn nhất exon 14 (3106 bp) và exon 26 (1958 bp) [27, 65], mã hóa cho protein FVIII gồm 2332 amino acid và có trọng lượng phân tử khoảng 300 kD

Hình 2 Vị trí của gen tổng hợp FVIII [65]

6

Khi gen F8 bị đột biến, tế bào giảm hoặc mất khả năng tổng hợp protein FVIII

gây nên bệnh hemophilia A [18] Cơ sở phân tử của hemophilia A được phân tích

trong nhiều năm và rất nhiều dạng đột biến gen F8 gây bệnh đã được công bố Các

nghiên cứu khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau [65]: Bệnh nhân hemohilia A thể nặng thường gặp dạng đột biến đảo đoạn intron 22 (chiếm 45-50%), trong khi đó đột biến điểm chiếm đa số ở bệnh nhân hemophilia A thể bệnh vừa và nhẹ 90-95% [25] Ở Việt Nam, đột biến đảo đoạn chiếm tỷ lệ cao nhất 38,1% Tiếp theo là đột biến sai nghĩa chiếm tỷ lệ 23,9% Chiếm

tỷ lệ cao thứ ba là các dạng đột biến mất nucleotide, đột biến vô nghĩa, đột biến thêm nucleotide với tỷ lệ 9,8% Tỷ lệ thấp nhất là dạng đột biến ở biên giới exon-intron và

đột biến mất đoạn lớn chiếm tỷ lệ 4,3% [1]

Vào năm 2014, bản đồ đột biến gen F8 của các bệnh nhân Hemophilia ở Việt

Nam đã được xây dựng nhằm hỗ trợ chẩn đoán và điều trị bệnh này (hình 3) [1]

Hình 3 Bản đồ vị trí đột biến gen F8 gây bệnh hemophilia A ở Việt Nam [1]

Nghiên cứu của Kaufman và cộng sự năm 1995 khẳng định dạng đột biến khác nhau sẽ gây những kiểu hình đặc trưng khác nhau của bệnh nhân mắc hemophilia [65]

Cụ thể, nhiều cơ chế đột biến khác nhau có thể gây bệnh hemophilia A thể

7

nặng, tuy nhiên dạng đột biến thường gặp nhất là đảo đoạn intron 22, chiếm 45-50%

bệnh nhân (hình 4) và intron 1 chiếm khoảng 5% bệnh nhân (hình 5) của gen F8 [16,

53] Đảo đoạn intron 22 xảy ra do sự tái tổ hợp giữa bản sao của vùng int22h1 (vùng lặp lại gồm 9,5 kb) thuộc intron 22 với một trong hai bản sao của vùng tương đồng

nằm ở telomere vùng int22h2, int22h3; vị trí 400 kb ở đầu 5’ ngoài gen F8 [41] Hiện tượng đảo đoạn dẫn đến đứt gãy gen F8 và gây thể bệnh nặng cho bệnh nhân với biểu

hiện kiểu hình là chảy máu ở mức độ nặng và biến dạng khớp Đảo đoạn intron 1 xảy

ra tương tự, do sự tái tổ hợp vùng int1h1thuộc intron 1 (kích thước 900 bp) nằm vị trí

140 kb ở đầu 5’ của gen F8 với bản sao int1h2 nằm ngoài gen F8 [41]

Hình 4 Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 22 [25]

Đột biến mất đoạn lớn phát hiện thấy ở 2-5% bệnh nhân hemophilia A thể nặng [9], có thể ở dạng mất một exon hoặc mất toàn bộ gen [70] Dạng đột biến này

là do quá trình tái tổ hợp giữa các đoạn lặp Alu [23, 75, 77] Đột biến chèn đoạn lớn làm đứt gãy gen F8 cũng gây hemophilia A thể nặng [55, 68]

Ngoài ra, đột biến thay thế một nucleotide cũng có thể gây hemophilia A thể nặng: đột biến vô nghĩa (nonsense) tạo mã kết thúc hoặc đột biến mất nucleotide gây lệch khung dịch mã dẫn đến không tổng hợp hoặc tổng hợp protein không có chức năng Đột biến tại biên giới intron và exon đã được các tác giả công bố Nhiều đột

8

biến thay thế ảnh hưởng đến dinucleotide CpG được phát hiện trên một số bệnh nhân,

ví dụ đột biến c.6496C>T dẫn đến chuyển thành Arg2147X (Tại vị trí 6496 trên trình

tự Genebank nucleotide C thay bằng nucleotide T làm thay đổi protein Arginine ở vị trí 2147 tạo thành stop codon) [39] Mất đoạn và chèn đoạn nhỏ cũng thường thấy trong hemophilia A thể nặng, thay đổi từ 1-55 nucleotide Phổ biến nhất là mất hoặc chèn nucleotide A vào exon 14 [8], thường xảy ra trong vùng từ c.3637 đến c.4379 [39]

Hình 5 Cơ chế đột biến đảo đoạn intron 1 [25]

Đối với hemophilia A thể vừa và nhẹ, cơ chế chính là đột biến điểm gây lệch khung dịch mã và đột biến thay thế nucleotide (missense), chiếm 90-95% bệnh nhân Đột biến tại vị trí nối và vùng promoter của gen được phát hiện ở một số bệnh nhân Hiện tượng lặp đoạn exon 13 cũng được mô tả ở các bệnh nhân hemophilia A thể nhẹ [25]

Thông thường, các trường hợp nam giới bị đột biến gen F8 thể nặng gây bệnh

hemophilia A trong cùng một gia đình có những biểu hiện lâm sàng nặng nề tương tự nhau Tuy nhiên, hiệu ứng di truyền và môi trường khác nhau có thể thay đổi mức độ biểu hiện lâm sàng của bệnh [19] Các nghiên cứu đã chỉ ra 10-15% bệnh nhân với

“kiểu hình đặc trưng” chảy máu mức độ nặng (khi nồng độ FVIII hoạt động <1%) có biểu hiện triệu chứng tương đối nhẹ trên lâm sàng [12, 22, 59] Không phải tất cả

Nghiên cứu sinh học phân tử giúp phát hiện ra các dạng, các vị trí đột biến trên

gen F8 gây bệnh hemophilia A để chẩn đoán phát hiện người mang gen bệnh Có

nhiều phương pháp để xác định đột biến gen, tuỳ thuộc vào kiểu đột biến mà có các phương pháp phân tích khác nhau Một số kỹ thuật phân tích đột biến được sử dụng hiện nay là PCR phát hiện đột biến mất exon, Longrange-PCR, Inversion PCR (I-PCR) phát hiện đảo đoạn intron 22 [41, 44, 69], PCR đa mồi phát hiện đảo đoạn intron 1 [7] và Southern Blot Ngoài ra còn có hai kỹ thuật sàng lọc đột biến dựa trên phân tích sợi kép là phương pháp điện di gel phân biệt cấu hình phân tử (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE) và sắc ký lỏng biến tính hiệu năng cao (Denaturing high pressure liquid chromatography - DHPLC), trong đó

DHPLC hiện là kỹ thuật được sử dụng rộng rãi nhất để phân tích gen F8 [6, 57]

Những năm gần đây, kỹ thuật nhân bản các đoạn đầu dò phụ thuộc vào phản ứng nối (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification - MLPA) là phương

pháp được ưu tiên chọn lựa trong chẩn đoán đột biến mất đoạn, lặp đoạn gen F8 [6,

57] Đây là phương pháp bán định lượng xác định số lượng bản sao tương đối của trình tự DNA, được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu về bệnh lý di truyền người Ngoài ra, MLPA còn giúp phát hiện tổn thương gen, chẩn đoán dị hợp tử với độ chính xác cao, cho kết quả nhanh chóng [52]

Phương pháp giải trình tự DNA của toàn bộ gen F8 có thể được sử dụng để xác định các đột biến điểm gây bệnh Tuy nhiên, do kích thước lớn của gen F8 và các cơ chế

đột biến phức tạp nên giải trình tự cũng không thể giúp chẩn đoán bệnh trong mọi trường

hợp Tại Việt Nam, phát hiện đột biến gen F8 bằng kỹ thuật giải trình tự hiện nay đang

10

được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại học Y Hà Nội [1]

Bảng 2 Các phương pháp phát hiện đột biến gây bệnh hemophilia

Thời gian thực hiện lâu, nhiều công đoạn

Longrange-PCR

Xét nghiệm phân tích gen được tiến hành đơn giản, dễ thực hiện

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng kết quả PCR; đòi hỏi nồng độ DNA trong mẫu cao và mẫu phải được bảo quản tốt

11

1.1.3 Chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A

Hiện nay với các liệu pháp điều trị có hiệu quả, người bị bệnh hemophilia A hoàn toàn có thể lập gia đình, sinh con Tuy vậy, để có thể sinh ra các con không mang bệnh này và thậm chí loại bỏ được gen bệnh đang tồn tại trong dòng họ, trước khi tiến tới hôn nhân, cần phải xét nghiệm chẩn đoán toàn thể, mức độ bệnh và có thể được tư vấn trước sinh Dựa trên cơ chế di truyền bệnh hemophilia A (hình 6), để loại

bỏ gen bệnh, nếu người cha bị bệnh thì không được sinh con gái vì 100% con gái sẽ mang gen gây bệnh di truyền từ NST X của bố Còn với người phụ nữ mang gen bệnh, hoặc cả hai bố mẹ cùng mang gen bệnh thì ở thời kỳ thai nghén, người phụ nữ cần làm chẩn đoán trước sinh vì gen gây bệnh từ NST X của mẹ sẽ di truyền cho 50% con gái và 50% con trai

Hình 6 Cơ chế di truyền bệnh Hemophilia A [85]

Chẩn đoán trước sinh là sử dụng những phương pháp thăm dò trong thời kỳ thai nghén nhằm phát hiện các bất thường về hình thái hay những bất thường về nhiễm sắc thể của thai để chẩn đoán sớm các bệnh và từ đó đưa ra các biện pháp can thiệp kịp thời nhằm giảm tỷ lệ tử vong sơ sinh, tỷ lệ trẻ bị dị tật, khuyết tật nặng nề và góp phần nâng cao chất lượng dân số Các phương pháp cơ bản được ứng dụng hiện nay

là siêu âm chẩn đoán, định lượng các chất đánh dấu và các phương pháp lấy bệnh

12

phẩm thai như: chọc hút nước ối, lấy máu tĩnh mạch rốn, sinh thiết bánh rau… để xác định những bệnh lý liên quan đến bất thường về nhiễm sắc thể Tuy nhiên, vì các phương pháp lấy bệnh phẩm thai đều phải sử dụng kỹ thuật xâm lấn nên đều có thể gây các biến chứng như rỉ ối, sảy thai với tỷ lệ nhất định nếu kỹ thuật viên không tuân thủ nghiêm ngặt các quy định, hướng dẫn khi thực hiện [87]

Xét nghiệm chẩn đoán trước sinh cho hemophilia nói riêng và các rối loạn đơn gen nói chung thường tiến hành trên bệnh phẩm thai là dịch ối hoặc DNA tự do của thai nhi tách từ máu ngoại vi của người mẹ Ở nước ta hiện nay Long-range PCR được sử dụng chủ yếu để phát hiện đảo đoạn intron 22 Trong kỹ thuật này, bốn mồi

P, Q, A&B có khả năng phân biệt người nam bị bệnh mang hoặc không mang đảo

đoạn, và người nữ mang gen: hai mồi P&Q được thiết kế trong gen F8 và nằm 2 đầu

int22h1 Hai mồi xa hơn là A&B, nằm 2 đầu int22h2 và 22h3, vùng tương đồng ngoại gen của int22h1 (hình 7) Các mồi P & Q khuếch đại đoạn 12 kb, A & B đoạn 10 kb

và P & B và A & Q đoạn 11 kb (mỗi cặp) trên gel agarose

Hình 7 Vị trí 4 mồi A, B, P, Q trong Long-range PCR phát hiện đảo đoạn

int22 trong gen F8

Đoạn A & B luôn được tạo ra và đảm nhiệm với tư cách là một đối chứng

13

dương, bởi vì ít nhất một bản sao của int22h2 và int22h3 vẫn còn nguyên vẹn Sử dụng tất cả bốn mồi cùng một lúc trong một PCR ống đơn, DNA hệ gen không có đảo đoạn, mẫu của bệnh nhân nam hoặc bệnh nhân nữ mang đảo đoạn tạo ra ba mô hình khuếch đại: một băng 12 kb phía trên, và một băng 10 kb phía dưới chỉ có nghĩa

là không có đảo đoạn (làn 2- hình 8) Băng 11 kb ở giữa, và một băng 10 kb ở phía dưới nghĩa là có sự đảo đoạn ở bệnh nhân nam mắc bệnh (làn 1- hình 8) Các băng

10 kb, 11 kb và 12 kb cho biết một người nữ mang đảo đoạn (làn 3 và 4 - hình 8) Protocol Longrange-PCR để phát hiện đảo đoạn F8C khác với các protocol long range PCR tiêu chuẩn [63] Sự thay đổi bao gồm việc bổ sung nồng độ cao của dimethyl sulphoxide (DMSO) và kết hợp 7-deaza-dGTP để có thể đọc qua vùng có hàm lượng

GC cao nằm phía đầu của nhân tố gen F8, và tăng đáng kể lượng Taq and Pwo DNA

polymerases Các sửa đổi bổ sung bao gồm điều chỉnh điều kiện của chu kỳ và các thành phần khác của phản ứng PCR (Liu và Sommer 1998; Liu và cộng sự 1999) [43, 45] Tuy nhiên, kỹ thuật này còn nhiều hạn chế như đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, thời gian thực hiện chưa nhanh chóng, các phương pháp PCR có thể bị âm tính giả Bên cạnh đó, hiện tượng nhiễm máu mẹ trong quá trình thu mẫu và ngoại nhiễm trong vận chuyển, thao tác kỹ thuật trên dịch ối cũng có thể dẫn tới kết quả không chính xác

Hình 8 Kết quả LD-PCR phát hiện đảo đoạn int22 gen F8 (Làn 1: mẫu nam có

đảo đoạn – người mắc bệnh; Làn 2: mẫu nữ không có đảo đoạn – người không mang gen bệnh; Làn 3,4: mẫu nữ có đảo đoạn – người mang gen bệnh)

14

Ngoài ra, trong chẩn đoán trước sinh hemophilia A còn có xét nghiệm phát hiện đột biến trên intron 18 sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình chiều dài đoạn cắt giới

hạn của enzyme BclI Cụ thể trong phương pháp này, mẫu DNA của người mẹ (tách

từ máu) và thai nhi (tách từ dịch ối) được làm PCR khuếch đại đoạn sản phẩm kích thước 142bp Trên NST X bình thường, đoạn này chứa vị trí cắt giới hạn của enzyme

BclI tại nucleotide thứ 99 (hình 9) nên sau khi xử lý với enzyme, kết quả điện di sẽ

cho 2 băng kích thước 99bp và 43bp Khi xảy ra đột biến điểm làm thay đổi trình tự

tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn DNA không bị cắt và giữ nguyên kích thước 142bp

Trên cơ sở đó, có thể phân tích kết quả xét nghiệm của một số cặp mẹ con làm chẩn đoán trước sinh bệnh hemophilia A [3] Đây là phương pháp dễ thực hiện và phù hợp với điều kiện kinh tế của nhiều gia đình bệnh nhân, nhưng chưa đảm bảo được khả năng phát hiện đầy đủ đột biến gây bệnh cũng như kết quả chẩn đoán phụ thuộc khá nhiều vào hoạt tính enzyme, khó tránh khỏi phải lặp lại thí nghiệm nhiều lần hay hiện tượng âm tính giả khi enzyme mất hoạt tính

Hình 9 Vị trí cắt giới hạn của enzyme BclI

Do các hạn chế nói trên của chẩn đoán trước sinh, nên các cặp vợ chồng có người mang gen bệnh hemophilia A được khuyến cáo lựa chọn phương pháp thụ tinh ống nghiệm (In vitro Fertilization – IVF) và sàng lọc phôi bệnh để có thể tránh được việc sinh trẻ mắc các bệnh này từ giai đoạn trước mang thai để giảm thiểu tối đa các rủi ro cho thai nhi cũng như sức khỏe và tâm lý của người mẹ

15

1.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A

1.2.1 Kỹ thuật chẩn đoán trước chuyển phôi

Để nâng cao tỷ lệ thành công và trẻ sinh sống khoẻ mạnh trong điều trị IVF thì việc chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimplantation Genetic Diagnosis - PGD) là một trong những yêu cầu quan trọng, cấp thiết và thực tiễn [21, 30] Cụ thể, trong suốt chu trình IVF, một hoặc một số tế bào được sinh thiết vào ngày thứ 3 hoặc thứ 5 DNA trong tế bào phôi được phân tích kiểu gen, đồng thời phòng thí nghiệm cũng phân tích DNA trong máu của bố, mẹ và một số thành viên gia đình khác để xác định kiểu gen gây bệnh và so sánh với phôi để kiểm tra phôi có bị bệnh không Sau khi hoàn thành các bước này, các phôi được sàng lọc để chỉ giữ lại phôi không mang bệnh PGD được báo cáo lần đầu tiên trên thế giới vào năm 1990, cho đến nay đã được sử dụng như một phương tiện chẩn đoán lâm sàng trong điều trị và áp dụng một cách rộng rãi Hàng năm số trường hợp PGD tăng gần gấp đôi, hàng chục ngàn trẻ ra đời từ các trung tâm IVF trên thế giới sau chẩn đoán PGD và chưa có công bố nào tìm thấy ảnh hưởng xấu của PGD ở trẻ ra đời bằng phương pháp này Hiện nay, thuật ngữ PGD được thay thế bằng PGT-M (đối với bệnh lý đơn gen); PGT-SR (đối với cấu trúc NST); PGT-A (đối với dị bội) Hiện nay ngoài kỹ thuật IVF truyền thống thì

kỹ thuật tiêm tinh trùng vào bào tương trứng (Intra-Cytoplasmic Sperm Injection - ICSI) cũng được thực hiện tạo nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản để tăng hiệu quả thụ tinh, vì trong IVF trứng được cấy với hàng trăm tinh trùng còn trong ICSI chỉ với một tinh trùng được lựa chọn là tốt nhất về mặt hình thái cũng như khả năng di động

Để có thể phân tích DNA từ mẫu phôi đơn bào, trước tiên cần tiến hành khuếch đại toàn hệ gen (Whole Genome Amplification – WGA) WGA là phương pháp khuếch đại toàn bộ hệ gen từ những mẫu có lượng DNA rất ít chỉ khoảng vài pg/µl Phương pháp này được áp dụng phổ biến trong lĩnh vực pháp y và nghiên cứu, chẩn đoán các bệnh di truyền [67, 80] Đây cũng là bước chuẩn bị cho các kỹ thuật tiếp theo như giải trình tự thế hệ mới [20, 64] và array CGH [35] Để tiến hành WGA, có thể sử dụng 1 trong 3 phương pháp: PCR bằng mồi thoái hóa (Degenerate Oligonucleotide Primed PCR – DOP PCR), khuếch đại thay thế đa điểm (Multiple

16

Displacement Amplification – MDA), và phương pháp lai (Hybrid methods) Việc lựa chọn kỹ thuật tùy thuộc vào mục đích sử dụng sản phẩm WGA, dựa trên các đặc điểm của từng kỹ thuật thể hiện trong hình 10 Trong PGD, phương pháp WGA được

sử dụng là MDA vì phương pháp này khắc phục được các hạn chế của các kỹ thuật WGA dựa trên PCR khác, như việc tạo các đoạn DNA tương đối ngắn, không đủ thông tin và nguy cơ xảy ra khuếch đại sai trong sản phẩm gây dương tính hoặc âm tính giả [60]

Hình 10 Sơ đồ nguyên lý 3 kỹ thuật khuếch đại toàn hệ gen [24]

1.2.2 Chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A

Có nhiều cách tiếp cận chẩn đoán trước chuyển phôi Hemophilia A Trong đó, cách tiếp cận đơn giản nhất là sàng lọc giới tính của phôi hoặc thai nhi Một số kỹ thuật được sử dụng cho hướng tiếp cận này là kỹ thuật kỹ thuật lai huỳnh quang tại

chỗ (Fluorescence in situ hybridization – FISH) sử dụng đầu dò Vysis [28, 29]; kỹ

thuật PCR khuếch đại các trình tự lặp lại đặc hiệu trên cánh dài nhiễm sắc thể Y [14,

17

40] hoặc đồng thời khuếch đại trình tự satellite alpha ở vùng tâm động của nhiễm sắc thể X và Y để kiểm soát việc kết luận nhầm giới tính do khuếch đại sai [79] Tuy nhiên, phương pháp này chỉ giúp lựa chọn được 50% số phôi có thể sử dụng cho chuyển phôi, 25% phôi nữ mang gen những không bị bệnh bị loại bỏ không cần thiết, đặc biệt là đối với những cặp vợ chồng có số phôi hạn chế thì đây là nhược điểm rất lớn Ngoài ra, các kỹ thuật này còn nhiều hạn chế như lai huỳnh quang đòi hỏi kỹ thuật phức tạp và giá thành cao

Cách tiếp cận khác sử dụng kỹ thuật nhận diện trực tiếp đột biến gen F8 gây

bệnh hemophilia khá phức tạp do trong tự nhiên có nhiều dạng dị hợp và các dạng đảo đoạn lớn Đặc biệt, hiện tượng ADO ( allele dropout - khuếch đại hỏng 1 trong 2 allele ở tế bào thể dị hợp) ảnh hưởng tới hơn 40% các ca chẩn đoán trước chuyển phôi, dẫn tới nhiều kết quả không chính xác [66] Khác với chẩn đoán thông thường dựa trên DNA tổng số với nhiều bản sao nên độ nhạy của các kỹ thuật không khiến kết quả bị ảnh hưởng quá nhiều nếu có một vài allele bị khuếch đại hỏng, mẫu DNA cho chẩn đoán trước chuyển phôi được cung cấp bởi chỉ 1-2 bản sao trong tế bào nên nếu có ADO, kết quả sẽ bị sai lệch hoàn toàn Có nhiều nguyên nhân ảnh hưởng tới chỉ số ADO như quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu, điều kiện PCR làm ảnh hưởng cấu trúc DNA hay lượng DNA đưa vào thí nghiệm không đủ do lỗi trong quá trình WGA hoặc tách chiết từ mẫu [62]

Ngoài nguy cơ ADO, vì đặc trưng của PCR trong PGT-M là cực nhạy nên rất

dễ nhiễm DNA ngoại lai [73, 76] Nguồn DNA ngoại lai rất phong phú nhưng chủ yếu thường xảy ra trong các giai đoạn trước bước tiến hành PCR đó là sinh thiết phôi

và rửa tế bào phôi [76]; DNA ngoại nhiễm có thể từ kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc DNA trong khu vực sinh thiết, rửa tế bào Mẫu giọt rửa làm đối chứng âm xuất hiện DNA cũng có thể do quá trình sinh thiết phôi không thành công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát DNA vào giọt rửa

Để khắc phục các nhược điểm của các hướng tiếp cận trên, nhiều nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật phân tích liên kết gen xác định gián tiếp đột biến qua các chỉ thị di truyền Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu chọn lọc chỉ thị là đoạn lặp

19

ống nghiệm Nhóm tác giả đã tiến hành sàng lọc bằng phương pháp xác định các STR

dị hợp tử sử dụng kỹ thật PCR đơn mồi để tìm các chỉ thị dị hợp tử trên mẫu DNA của mẹ và trẻ bị bệnh Do vậy, nhóm nghiên cứu phải tiến hành tối thiểu 14 phản ứng PCR mỗi mẫu nghiên cứu nhằm tìm được chỉ thị dị hợp tử trên mẫu máu mẹ; sau đó tiếp tục tiến hành những phản ứng PCR đơn mồi tiếp theo để xác định các STR dị hợp tự của mẹ trên con Trong báo cáo, không thấy nhóm nghiên cứu xác định các allele của các STR trên mẫu của bố, nhằm kiểu soát nhiễm, và tránh sự trùng lặp giữa các STR dị hợp tử của mẹ này có allele trùng với của mẫu bố

Tuy sử dụng kỹ thuật phân tích di truyền liên kết nhưng nhóm nghiên cứu chưa sàng lọc tỷ lệ dị hợp tử quan sát trên đối tượng người Việt Nam Tiêu chuẩn lựa chọn chỉ thị STR phục vụ chẩn đoán cần có tỷ lệ dị hợp tử quan sát >50% [6] Nhiều nghiên cứu cho thấy, những chỉ thị được sử dụng trong nghiên cứu của nhóm tác giả có tỷ lệ

dị hợp tử quan sát rất thấp, thậm chí chỉ đạt 1,5% [6, 61]

Ưu điểm vượt trội của kỹ thuật phân tích di truyền liên kết sử dụng chỉ thị STR

là giúp hạn chế ảnh hưởng do tỷ lệ nhân gen thất bại, tỷ lệ ADO: khi có nhiều chỉ thị liên kết với gen cần xác định đột biến, việc mất thông tin từ một số chỉ thị có thể được khắc phục nhờ thông tin bổ sung từ các chỉ thị khác Tuy nhiên, kỹ thuật này vẫn được yêu cầu kiểm tra, đánh giá tỷ lệ ADO, tỷ lệ xác định kiểu gen thành công, thất bại trong thực hành, trước khi đưa vào chẩn đoán trước chuyển phôi Trong báo cáo của nhóm tác giả, kỹ thuật chưa được đánh giá những chỉ số này trên 1 tế bào, trước khi tiến hành chẩn đoán trên 1 tế bào phôi Đây là một trong những nhược điểm của nghiên cứu được nhóm tác giả thừa nhận trong phần bàn luận của công bố này [2]

1.3 Phân tích di truyền liên kết

1.3.1 Ứng dụng của phân tích di truyền liên kết

Phân tích di truyền liên kết là một công cụ hiệu quả trong chẩn đoán bệnh di truyền, nhằm phát hiện gián tiếp tổn thương gen thông qua nhóm gen liên kết Một nhóm gen được gọi là có liên kết khi chúng luôn được di truyền cùng nhau – hay không bị trao đổi chéo trong quá trình giảm phân Thông qua việc xác định các gen

20

liên kết với gen bệnh, có thể chẩn đoán các rối loạn đơn gen phức tạp và nhiều dạng như ở bệnh hemophilia A Quy trình phân tích bao gồm xác định kiểu gen của các thành viên trong gia đình nghi ngờ mang gen bệnh, sau đó thiết lập sơ đồ phả hệ nhằm xem xét sự di truyền của nhóm gen liên kết với gen bệnh

Trong việc sàng lọc chỉ thị cần chú ý tới vị trí locus chứa chúng để lựa chọn được các chỉ thị nội gen và ngoại gen nằm về cả 2 phía so với gen bệnh để tăng độ tin cậy của kết quả chẩn đoán Khoảng cách từ chỉ thị đó đến vị trí đột biến cũng là một yếu tố quan trọng, vì những chỉ thị ở xa gen sẽ có tần số tái tổ hợp tăng dần Tái

tổ hợp xảy ra trước lần giảm phân đầu tiên ở các tế bào mầm khi các NST kép trong mỗi cặp tương đồng xếp thẳng hàng nhau Lúc này, các trình tự DNA tương đồng trên NST từ bố và từ mẹ có thể trao đổi với nhau, quá trình này là hiện tượng trao đổi chéo Phạm vi tái tổ hợp rộng hay hẹp thay đổi ngẫu nhiên dọc theo chiều dài NST, chính vì thế 2 gen càng gần nhau thì khả năng trao đổi chéo của chúng sẽ càng giảm trong suốt quá trình giảm phân hay nói cách khác, tần số tái tổ hợp giữa 2 gen trên cùng NST càng thấp thì chúng càng liên kết chặt chẽ với nhau và càng ở gần nhau Tần số tái tổ hợp có thể tính từ số cá thể con xuất hiện kiểu hình khác với bố mẹ do quá trình trao đổi chéo các allele khác nhau trên gen

Mặt khác, chỉ thị càng liên kết tốt với gen có đột biến, khả năng xác định đột biến đó sẽ càng chính xác Khoảng cách tương ứng với 1% tần số tái tổ hợp là centimorgan (cM) Theo nghiên cứu của Harvey Lodish và cộng sự [46], dựa trên kết quả so sánh khoảng cách vật lý thực tế giữa các gen đã được xác định tần số tái tổ hợp bằng phân tích phân tử, thì trung bình 1 cM ở người tương ứng với khoảng 7,5.105

bp, hay xấp xỉ 1 Mbp Theo khuyến cáo của Hội sản khoa và Phôi học Châu Âu, khi sàng lọc chỉ thị chỉ nên tiến hành nghiên cứu trong phạm vi từ 1 đến 3 Mbps để đảm bảo độ liên kết giữa chỉ thị và gen cần xác định đột biến [32] Chính vì thế, trong thiết

kế bộ chỉ thị STR nhằm xác định gián tiếp đột biến trên F8, cần đảm bảo các chỉ thị

được lựa chọn nằm ở 2 bên gen này để nếu xảy ra hiện tượng trao đổi chéo dù với xác suất nhỏ, vẫn đảm bảo có các chỉ thị được di truyền cùng gen Ngoài ra, cần chú

ý lựa chọn nhiều chỉ thị khi phân tích nhằm hạn chế khả năng mất thông tin do ADO

21

hay do bản thân một chỉ thị nào đó không có thông tin trong gia đình được chẩn đoán

Với những đặc điểm trên, việc tiến hành nghiên cứu phát hiện gián tiếp đột

biến gen F8 thông qua các chỉ thị liên kết với gen này vừa giúp việc chẩn đoán dễ

dàng hơn, vừa hạn chế được hiện tượng ADO, đáp ứng yêu cầu của chẩn đoán trước làm tổ Hơn nữa, kỹ thuật này còn góp phần kiểm soát tình trạng nhiễm chéo và ngoại nhiễm trong chẩn đoán trước chuyển phôi hemophilia A

1.3.2 Chỉ thị phân tử STR

Phương pháp phân tích trình tự lặp kế tiếp (Short tandem repeat – STR) là một trong các công cụ sinh học phân tử hiệu quả nhất được sử dụng rộng rãi trong pháp y, xét nghiệm huyết thống và chẩn đoán bệnh di truyền

Cơ sở lý thuyết của phương pháp này là việc so sánh các loci đặc hiệu trong mẫu DNA từ 2 hay nhiều cá thể khác nhau Cụ thể, một STR là tập hợp 10 – 60 lần lặp lại đoạn trình tự khoảng 2 đến 6 bp, và sự đặc thù ở mỗi cá thể của các STR cho phép nhận biết DNA của từng cá thể hoặc phân tích di truyền liên kết giữa các thế hệ trong cùng một gia đình: thế hệ con sẽ nhận một allele từ bố và một allele từ mẹ; đối với các locus trên X thì con trai chỉ nhận từ mẹ [37] Sự đặc thù này thể hiện ở số lần lặp của đoạn trình tự, và được phát hiện thông qua phản ứng nhân gen PCR kết hợp điện di mao quản PCR giúp nhân bản thông tin từ một lượng nhỏ DNA có trong mẫu sinh phẩm Sản phẩm nhân STR có kích thước khoảng 100-500bp, và có thể tiến hành PCR đa mồi

để nhân bản cùng lúc nhiều đoạn STR, sử dụng các mồi được thiết kế gắn màu huỳnh quang khác nhau và nhân các sản phẩm có kích thước khác nhau

Mặc dù hệ gen người chứa hàng ngàn chỉ thị STR, nhưng chỉ có một số lượng nhỏ các loci được lựa chọn để sử dụng trong pháp y và các ứng dụng nhận dạng khác [10] Những loci này được gọi là loci hạt nhân (core loci), cho phép so sánh và nhận dạng di truyền giữa các cá thể Ngày nay có rất nhiều bộ kit thương mại cho phép tạo các hồ sơ DNA chứa những STR loci hạt nhân này và có hàng triệu hồ sơ STR được tạo trên toàn thế giới bởi các chính phủ, trường đại học, các phòng thí nghiệm nhằm tiến hành nhiều loại xét nghiệm nhận dạng khác nhau bao gồm tạo cơ sở dữ liệu DNA, pháp y, nhận dạng người mất tích hay nạn nhân trong các thảm họa/ đại dịch, hoặc

22

xét nghiệm huyết thống [11]

Việc sử dụng chỉ thị STR có nhiều ý nghĩa: với tính bảo thủ cao, được di truyền qua các thế hệ và mang tính đặc trưng cá thể (số lần các đoạn lặp có thể khác nhau rất nhiều giữa các cá thể khác nhau), việc kiểm soát nguồn ngoại nhiễm trở nên dễ dàng hơn; kích thước các đoạn lặp không quá lớn (dưới 500bp) nên chỉ thị STR có thể được nhân bản từ DNA đứt gãy, áp dụng được trên nhiều loại mẫu với chất lượng khác nhau, vì vậy quy trình vận chuyển, bảo quản mẫu cũng thuận lợi hơn so với chẩn đoán trực tiếp bằng các đoạn DNA có kích thước lớn khác [4]

1.3.3 Các chỉ số đa hình di truyền

Các chỉ số đa hình di truyền được tính toán dựa trên tần số allen thu được từ thực nghiệm, dùng để đánh giá lượng thông tin của một chỉ thị sử dụng trong các thử nghiệm phụ/mẫu hệ (parentage testing) Các chỉ số này bao gồm: tần số dị hợp tử quan sát (Observed Heterozygosity – Ho), tần số dị hợp tử lý thuyết (Expected Heterozygosity – He), và hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism Information Content – PIC) [56, 78] He và PIC càng cao (PIC > 50%) chứng tỏ chỉ thị càng đa hình và có giá trị Ho quyết định giá trị của chỉ thị đóng góp thông tin trong chẩn đoán Ho càng cao, giá trị trong chẩn đoán càng cao Khi Ho thấp, việc sử dụng các chỉ thị này trong sàng lọc sẽ gây lãng phí về kinh tế, thời gian và công lao động

Đến nay chưa có nhóm nghiên cứu nào xây hệ thống chỉ thị STR liên kết với

gen F8 đáp ứng các tiêu chuẩn về chỉ số đa hình PIC và các chỉ số dị hợp tử He, Ho

áp dụng cho chẩn đoán trước chuyển phôi bệnh hemophilia A trên quần thể người Việt Nam

1.4 Kỹ thuật PCR đa mồi

PCR đa mồi là kỹ thuật nhân gen được giới thiệu lần đầu vào năm 1988 trong một nghiên cứu phát hiện mất đoạn gen [13] Với kỹ thuật này, nhiều trình tự DNA

sẽ được khuếch đại cùng lúc, giúp tiết kiệm tối đa thời gian thao tác và chẩn đoán nói chung Tuy vậy việc thiết kế mồi và tối ưu hóa phản ứng cần được đặc biệt chú trọng

23

để đảm bảo hiệu suất khuếch đại cho từng đoạn DNA đích là tương đối đồng đều, phục vụ cho bước phân tích được hiệu quả

Phản ứng PCR đa mồi nói chung có thể chia làm 2 loại:

- PCR đa mồi sử dụng 1 loại khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng một khuôn DNA tổng số với nhiều cặp mồi xuôi và ngược để khuếch đại nhiều vùng đặc hiệu trong một khuôn đó

- PCR đa mồi sử dụng nhiều khuôn DNA: kỹ thuật này sử dụng nhiều khuôn DNA và nhiều bộ mồi trong cùng một ống phản ứng Sự tồn tại của nhiều mồi có thể dẫn tới bắt cặp chéo giữa các mồi với nhau và khả năng bắt cặp nhầm giữa mồi và khuôn của mồi khác

Trong việc thiết kết mồi cho PCR đa mồi cần đặc biệt lưu ý tới các thông số sau để đảm bảo hiệu suất phản ứng đạt mức cao nhất:

- Độ dài mồi: phản ứng PCR đa mồi cần số lượng lớn các mồi, vì vậy các mồi được thiết kế phải có độ dài phù hợp Thông thường, các mồi với kích thước ngắn, trong khoảng 18 – 22 bp sẽ được sử dụng

- Nhiệt độ nóng chảy: các mồi với Tm giống nhau, thích hợp nhất là 55°C-60°C thường được sử dụng Cho các trình tự với tỷ lệ GC cao, khuyến cáo sử dụng các mồi với Tm cao hơn (thường là 75°C-80°C) Khoảng chênh lệch chấp nhận được giữa các mồi trong cùng 1 ống phản ứng là vào khoảng 3°C-5° C

- Độ đặc hiệu: việc cân nhắc độ đặc hiệu của các mồi được thiết kế cho các trình tự đích là rất quan trọng khi chuẩn bị phản ứng PCR đa mồi, đặc biệt là do sự tồn tại cạnh tranh của các trình tự đích trong cùng 1 ống phản ứng

- Tránh tạo primer dimer (sản phẩm do các mồi bắt cặp với nhau tạo thành): các mồi được thiết kế phải được kiểm tra việc tạo primer dimer, với tất cả các mồi tồn tại trong cùng hỗn hợp phản ứng Việc tạo primer dimer sẽ dẫn tới khuếch đại không đặc hiệu

Ngoài các thông số trên, những yếu tố khác về cơ bản giống với thiết kế mồi cho PCR thông thường Với kỹ thuật PCR đa mồi, kỹ thuật viên có thể tiến hành khuếch đại đồng thời các chứng nội để hạn chế âm tính giả, đồng thời tiết kiệm chi

24

phí hóa chất cũng như thời gian làm thí nghiệm so với việc sử dụng nhiều phản ứng PCR đơn lẻ Ngoài ra, PCR đa mồi còn cho phép tiến hành xét nghiệm với lượng DNA đầu vào không quá nhiều (có thể chỉ cần 1 ng hay ít hơn [11]) Với những ưu điểm này, PCR đa mồi được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: phát hiện nguồn bệnh, xác định kiểu gen SNP, phân tích đột biến, phân tích mất gen, định lượng mẫu, phân tích di truyền liên kết, phát hiện RNA, hay lĩnh vực pháp y

1.5 Kỹ thuật điện di mao quản

Sản phẩm PCR đa mồi có thể phân tích bằng điện di gel agarose hoặc điện di mao quản Trong ứng dụng để phân tích di truyền liên kết, thường sử dụng điện di mao quản vì với phương pháp này có độ phân giải cao hơn (1 bp) so với điện di gel agarose (khoảng 5 bp)

Hình 11 Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo của hệ điện di mao quản

Nguyên lý của phương pháp là dùng máy điện di có 2 cực: 1 cực âm và 1 cực dương Sợi DNA mang điện tích âm khi điện di chạy về cực dương, các đoạn DNA

có kích thước khác nhau sẽ phân tách thành các băng vạch khác nhau Các cặp mồi

để PCR phân tích bằng điện di mao quản được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh quang khác nhau gắn vào mồi xuôi (F) hoặc ngược (R), vì vậy sau quá trình PCR sẽ tạo ra các đoạn DNA được gắn các chất phát huỳnh quang tương ứng Các DNA này sau đó được xác định bằng kỹ thuật hiện màu huỳnh quang: các hạt huỳnh quang hấp

25

thụ năng lượng từ nguồn sáng laser sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn) và được camera hay bộ cảm biến ghi lại Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó

Phương pháp điện di mao quản có nhiều ưu điểm giúp khắc phục những hạn chế của phương pháp điện di thông thường trong phân tích các chỉ thị STR:

- Thứ nhất: phương pháp điện di mao quản có độ phân giải đến 1 nucleotide

Do vậy, các allele của các STR chỉ cần khác nhau 1 nucleotide cũng có thể phân biệt được

- Thứ hai: trong phân tích STR, có nhiều STR có kích thước vật lý của các allele (bp) chồng lấn lên nhau Để phân biệt các STR này, các mồi được gắn huỳnh quang với màu sắc khác nhau ở đầu 5’ của mồi xuôi Nhờ vậy, sẽ phân biệt được các STR có kích thước các allele chồng lấn Bằng việc kết hợp phân biệt sản phẩm bằng

sự khác nhau về kích thước và màu sắc, kỹ thuật PCR đa mồi có thể được tiến hành với hàng chục cặp mồi trong cùng 1 ống

- Thứ ba: tín hiệu huỳnh quang được khuếch đại khi bị ánh sáng kích thích, kết hợp hệ thống khuếch đại tín hiệu giúp độ nhạy của phương pháp này rất cao Yếu

tố này giúp quá trình nhân gen ở các mẫu có nồng độ thấp, đặc biệt trên mẫu chỉ có 1 bản sao (mẫu một tế bào) không đòi hỏi số chu kỳ quá lớn, cũng như không cần tiến hành phản ứng PCR lồng (nested PCR) có nhiều nguy cơ nhiễm chéo

Sau khi khuếch đại các chỉ thị STR tạo ra các sản phẩm huỳnh quang, việc phân biệt sản phẩm (allele) của các loci (STR) dựa vào màu sắc và kích thước của đỉnh tín hiệu huỳnh quang Kích thước của các đỉnh tín hiệu dựa trên kết quả so sánh với kích thước của thang chuẩn Chiều cao của các đỉnh tín hiệu thể hiện độ mạnh của tín hiệu huỳnh quang Trường hợp dị hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 2 allele tương ứng với 2 đỉnh tín hiệu Trường hợp đồng hợp tử, 1 locus (STR) sẽ có 1 allele, tương ứng với 1 đỉnh tín hiệu trên hình ảnh phân tích kết quả điện di

26

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Đa hình của các STR được nghiên cứu trên 103 mẫu máu của phụ nữ mang gen bệnh tình nguyện cung cấp cho Trung tâm Hemophilia, Viện Huyết học – Truyền máu TW từ tháng 9 năm 2018 đến tháng 6 năm 2019 và 50 mẫu máu của phụ nữ không mang gen bệnh thu thập từ các nghiên cứu khác thực hiện tại Phòng Phân tích DNA, Bộ môn Giải Phẫu, Học viện Quân Y

- Thiết lập và tối ưu hóa quy trình phân tích đa STR được thực hiện trên một

tế bào từ 05 mẫu phôi dư do Viện mô phôi lâm sàng quân đội, Học viện Quân Y cung cấp

- Quy trình PGT Hemophilia A được ứng dụng cho 01 cặp vợ chồng mang gen bệnh hemophilia A tình nguyện, thỏa mãn các tiêu chí sau:

+ Cơ quan sinh sản bình thường

+ Chức năng sinh sản bình thường, thông qua xét nghiệm đánh giá chất lượng tinh trùng, xét nghiệm chức năng buồng trứng

Các đối tượng sau sẽ bị loại trừ khỏi nhóm theo dõi để đánh giá hiệu quả của phương pháp sàng lọc:

+ Có hai buồng trứng hoặc tử cung bất thường

+ Không thực hiện theo các hướng dẫn của bác sĩ và nghiên cứu

+ Bệnh nhân bị lạc nội mạc tử cung;

+ Không đủ hồ sơ nghiên cứu hỗ trợ sinh sản

Mẫu phôi cung cấp cho quy trình PGT được sinh thiết tại Bệnh viện Nam học

và Hiếm muộn Hà Nội

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang có phân tích

27

2.2.2 Công thức tính cỡ mẫu trong nghiên cứu đa hình gen

Công thức tính cỡ mẫu xác định tỷ lệ dị hợp tử được lấy theo phần mềm Sample Size của Tổ chức Y tế thế giới WHO như sau:

Trong đó:

+ n: cỡ mẫu cần thiết

+ α là độ tin cậy của nghiên cứu

+ Z là giá trị biểu thị độ tin cậy thu được từ bảng Z tương ứng với α

+ p: tỷ lệ theo mục tiêu các mẫu đạt tiêu chuẩn nghiên cứu

+ Δ: tỷ lệ sai lệch giữa quần thể mẫu nghiên cứu và quẩn thể thực Để có ý nghĩa thống kê, tỷ lệ này chỉ giới hạn từ 0,01% tới 10%

Trong nghiên cứu này, tôi lựa chọn các thông số như sau:

+ Độ tin cậy của nghiên cứu là 95%, tương ứng với α = 0,05 và Z(1-α/2) = 1,96 + Tỷ lệ mẫu không có thông tin cho chỉ thị STR bất kỳ (đồng hợp tử) thấp nhất là 45%, tương ứng với p = 0,45

+ Tỷ lệ sai lệch so với quần thể thực là 10% tương ứng Δ = 0,1

Áp dụng vào công thức, cỡ mẫu tối thiểu thu được là 95 mẫu

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng 153 mẫu máu từ các nguồn cung cấp đối tượng nghiên cứu nêu trên

28

2.2.3 Sơ đồ nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành theo 2 giai đoạn: giai đoạn đầu nhằm xác định tính

đa hình của các STR trong bộ chỉ thị thiết kế được Giai đoạn thứ 2 nhằm tối ưu hóa các bước thực hiện để xây dựng quy trình PGT hemophilia A áp dụng quy trình xây dựng được cho gia đình bệnh nhân

Thực hiện PGT trên gia đình mang gen

Chuyển phôi và theo dõi mang thai

Chẩn đoán trước sinh kiểm tra kết quả

Xây dựng và áp dụng quy trình PGT hemophilia A

29

2.3 Hóa chất và dụng cụ, thiết bị nghiên cứu

*Hóa chất dùng để tách chiết DNA: QIAGEN blood Minikit; cồn tuyệt đối dùng trong

thí nghiệm sinh học phân tử Merk

*Hóa chất dùng để khuếch đại toàn hệ gen tế bào: REPLI-g Single Cell Kit QIAGEN

*Hóa chất để thực hiện kỹ thuật PCR: QIAGEN Multiplex PCR 2X Mastermix;

QIAGEN Q-Solution; Các cặp mồi (IDT)

*Hóa chất để điện di agarose sản phẩm PCR: Bột Agarose LE (Roche); TBE Buffer

10X (Serva); Agarose gel loading dye 6x (Intron); 100bp Ladder (Norgen); RedSafe Nucleic Acid staining solution (Intron)

*Hóa chất để điện di mao quản sản phẩm PCR: CE Running buffer 10X (MCLAB),

Nano POP4 dùng cho máy ABI3130/3130XL (MCLAB), Size standard Genscan 500LIZ (Thermo Fisher Scientific), Hi-Di Formamide (Thermo Fisher Scientific)

*Dụng cụ: Ống Eppendorf 1,5 ml - 0,5 ml - 0,2 ml; Ống lấy máu chống đông EDTA;

Găng tay vô khuẩn; Khẩu trang y tế; Hộp giữ mẫu; Pipet, đầu tips các loại dùng cho

kỹ thuật sinh học phân tử

*Thiết bị: Máy Proflex PCR System (Thermo Fisher Scientific); Máy đo NanoDrop

One (Thermo Fisher Scientific); Máy đo Qubit 3.0 Fluorometric Quantitation (Life Technologies); Bộ điện di NANOPAC 300P (Cleaver); Tủ lạnh sâu: -20oC, -80oC (Panasonic); Máy ly tâm lạnh Hitech và ly tâm để bàn Boeco; Máy giải trình tự gen

ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer (Thermo Fisher Scientific); Tủ an toàn sinh

học cấp II dùng trong sinh học phân tử; Máy ủ nhiệt và lắc MTH – 100 (Holdwell);

Máy lắc MS3 basic (IKA); Cân điện tử Practum (Sartorius)

30

2009 [47], sử dụng trình tự tham chiếu cho NST X của người trên NCBI với mã truy cập NC_000023: cài đặt thông số align bao gồm Match: 2, Mismatch: 2, Indels: 7; vị

trí tìm kiếm cách 1Mbp về phía trước, sau gen F8 và trong gen; tiêu chí chọn lọc: số

lần lặp trình tự từ 2 đến 6 với điểm Align thấp nhất với trình tự trên NST X tương

ứng là 54, 80, 66, 52 (là điểm thấp nhất của các chỉ thị nội gen F8 có số lần lặp như

vậy và được đánh giá là có giá trị đa hình di truyền thông qua xác định kiểu gen trực tiếp), % Match ≥ 80

Hình 13 Phần mềm Tandem Repeat Finder và các chỉ số thiết đặt để sàng lọc

Để lựa chọn hệ thống chỉ thị STR có thể sử dụng trên quần thể người Việt Nam: từ những STR đã sàng lọc được từ phần mềm TRF, dựa trên dữ liệu được báo cáo từ các nghiên cứu đã tiến hành trên quần thể người Brazil [47, 50], New Zealand [42], Trung Quốc [17, 72], tiếp tục chọn ra các chỉ thị STR có các chỉ số PIC, H(exp),

H(ob) > 0,5 và có mồi khuếch đại đáp ứng yêu cầu khuyến cáo của QIAGEN bao gồm: kích thước 20 – 30 nucleotide, nhiệt độ Tm ≥ 60oC, có không quá 3 nucleotide G hoặc

C ở đầu 3’ và 2 mồi không bắt cặp nhau ở đầu 3’ Tiếp tục chọn lọc theo kích thước sản phẩm khuếch đại sao cho các sản phẩm cách nhau khoảng 10 nucleotide, từ đó xác định kích thước sản phẩm nhỏ nhất và chia làm các nhóm với khoảng cách sản