ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dạ dày (UTDD) là một bệnh lý ác tính, đứng thứ năm trong các ung thư thường gặp và là nguyên nhân gây tử vong thứ ba trong các bệnh lý ung thư. Cơ chế bệnh sinh của UTDD là một quá trình phức tạp, liên quan tới các yếu tố như nhiễm Helicobacter pylori (H.pylori), chế độ ăn uống, lối sống và gen di truyền. Trong các biến đổi ở mức độ di truyền này, Đa hình đơn nucleotid (Single Nucleotide Polymorphism: SNP) là một trong những dạng biến đổi gen thường gặp trong bộ gen người. Trong đó nghiên cứu về một số SNP thuộc MUC1 và PSCA khá phổ biến ở các quốc gia có tỷ lệ mắc UTDD cao như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc với nhiều kết quả hứa hẹn là những dấu ấn mới giúp sàng lọc nguy cơ UTDD. MUC1 mã hóa protein mucin-1, đóng vai trò như một hàng rào chống lại những tác động ngoại sinh tới tế bào trong điều kiện bình thường. Còn PSCA được chứng minh có liên quan tới nhiều ung thư trong đó có UTDD. Việt Nam là một quốc gia có tỷ lệ mắc UTDD cao tuy nhiên các nghiên cứu về biến đổi di truyền như các SNP trên bệnh nhân ung thư dạ dày ở Việt Nam, đặc biệt là sự kết hợp của các SNP này với các yếu tố nguy cơ của ung thư dạ dày vẫn hạn chế. Vì các lý do như trên, đề tài “Nghiên cứu đa hình thái đơn gen MUC1 và gen PSCA trên bệnh nhân ung thư dạ dày” được tiến hành nhằm các mục tiêu sau đây: 1) Xác định một số đa hình đơn của gen MUC1 và PSCA trên bệnh nhân ung thư dạ dày. 2) Đánh giá mối liên quan giữa các đa hình đơn gen MUC1 và PSCA với một số yếu tố nguy cơ của bệnh nhân ung thư dạ dày.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC LAN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH THÁI ĐƠN GEN MUC1 VÀ PSCA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ DẠ DÀY Chuyên ngành : Hóa Sinh Y học Mã số : 62720112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2020 ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư dày (UTDD) bệnh lý ác tính, đứng thứ năm ung thư thường gặp nguyên nhân gây tử vong thứ ba bệnh lý ung thư Cơ chế bệnh sinh UTDD trình phức tạp, liên quan tới yếu tố nhiễm Helicobacter pylori (H.pylori), chế độ ăn uống, lối sống gen di truyền Trong biến đổi mức độ di truyền này, Đa hình đơn nucleotid (Single Nucleotide Polymorphism: SNP) dạng biến đổi gen thường gặp gen người Trong nghiên cứu số SNP thuộc MUC1 PSCA phổ biến quốc gia có tỷ lệ mắc UTDD cao Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc với nhiều kết hứa hẹn dấu ấn giúp sàng lọc nguy UTDD MUC1 mã hóa protein mucin-1, đóng vai trò hàng rào chống lại tác động ngoại sinh tới tế bào điều kiện bình thường Còn PSCA chứng minh có liên quan tới nhiều ung thư đó có UTDD Việt Nam quốc gia có tỷ lệ mắc UTDD cao nhiên nghiên cứu biến đổi di truyền SNP bệnh nhân ung thư dày Việt Nam, đặc biệt sự kết hợp SNP với yếu tố nguy ung thư dày hạn chế Vì lý trên, đề tài “Nghiên cứu đa hình thái đơn gen MUC1 và gen PSCA bệnh nhân ung thư dày” tiến hành nhằm mục tiêu sau đây: 1) 2) Xác định số đa hình đơn gen MUC1 PSCA bệnh nhân ung thư dày Đánh giá mối liên quan đa hình đơn gen MUC1 và PSCA với số yếu tố nguy bệnh nhân ung thư dày Tính cấp thiết Đa hình đơn nucleotid biến đổi gen thường gặp gen người Trong thời gian gần nghiên cứu vai trò SNP mối nguy với bệnh lý chủ đề nhiều nhà khoa học quan tâm đặc biệt bệnh lý ung thư, chuyển hóa… Trong UTDD nhiều SNP báo cáo liên quan tới bệnh lý này, đó có SNP gen MUC1 gen PSCA Sự phối hợp SNP với yếu tố nguy tình trạng nhiễm H.pylori, tiền sử uống rượu, hút thuốc lá… bước đầu nghiên cứu Nguy mắc bệnh lý nói chung bệnh UTDD nói riêng sự tổng hòa yếu tố nguy yếu tố di truyền Nghiên cứu SNP MUC1 PSCA đặc biệt sự phối hợp với yếu tố nguy UTDD chưa nghiên cứu Việt Nam Đây lý đề tài tiến hành nghiên cứu Những đóng góp luận án - Xác định SNP làm tăng nguy UTDD đó kiểu gen AA rs4072037 GG rs2070803 thuộc gen MUC1 - Các kiểu gen nhạy cảm MUC1 kết hợp với hầu hết yếu tố nguy khác làm tăng nguy mắc UTDD, đặc biệt kết hợp với tiền sử UTDD gia đình có thể làm tăng nguy UTDD lên gấp lần Khi kết hợp kiểu gen SNP với nhau, tổ hợp có kiểu gen nhạy cảm kể tren làm tăng nguy UTDD Xây dựng mơ hình tiên lượng UTDD dựa yếu tố tuổi, tiền sử bệnh lý dày cá nhân, tiền sử UTDD gia đình, tiền sử uống rượu đặc điểm kiểu gen rs4072037 Kết kiểm định mơ hình thu AUC=70%, độ xác = 0,63, số Brier=0,231 Bố cục luận án - Luận án trình bày 123 trang bao gồm: đặt vấn đề trang, tổng quan 29 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 17 trang, kết nghiên cứu 34 trang, bàn luận 40 trang, kết luận trang - Luận án có 27 bảng, 11 biểu đồ, 26 hình, gồm 231 tài liệu tham khảo xếp theo thứ tự xuất luận án Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương ung thư dày 1.1.1 Dịch tễ học của ung thư dày Trên giới: Theo Globocan năm 2018 có khoảng triệu ca UTDD mắc UTDD trở thành bệnh lý ác tính đứng thứ năm sau ung thư phổi, ung thư vú, ung thư đại tràng tiền liệt tuyến Hơn 70% số ca mắc nước phát triển, nửa số lượng mắc tồn giới Đơng Á (chủ yếu Trung Quốc) Tỷ lệ tử vong đứng thứ bệnh lý ác tính, sau ung thư phổi ung thư đại tràng Tỷ lệ mắc theo tuổi nam xấp xỉ gấp hai lần nữ Tần suất mắc UTDD thay đổi theo khu vực địa lý quốc gia vùng khác quốc gia Tỷ lệ mắc UTDD tăng theo tuổi với lứa tuổi mắc cao từ 50 - 70 Tại Việt Nam: Do nằm khu vực có tỷ lệ mắc UTDD cao, chưa có số liệu điều tra xác dịch tễ học phạm vi nước theo nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc UTDD cao cộng đồng Theo Globocan 2018, Việt Nam có khoảng 164,000 ca ung thư mắc hai giới, đó UTDD khoảng 17,000 ca chiếm tỷ lệ 10,6% đứng thứ ung thư thường gặp, sau ung thư gan ung thư phổi Theo mô bệnh học: Ung thư biểu mô thể mô bệnh học UTDD, chiếm tới 95% Do hình thái ung thư biểu mô dày phức tạp nên nhiều phân loại UTDD phân loại Lauren (1965) tổ chức y tế giới (WHO) sử dụng phổ biến Theo đó UTDD chia thành hai thể thể ruột thể lan tỏa, đó thể ruột chiếm ưu 1.1.2 Các yếu tố nguy ung thư dày Cơ chế bệnh sinh UTDD phức tạp sự kết hợp yếu tố nguy biến đổi di truyền Nhiễm H.pylori coi tác nhân loại I gây UTDD Bên cạnh đó thuốc yếu tố nguy 14 loại ung thư, đó có UTDD Theo Yhokisazu (2006), hút thuốc làm tăng nguy UTDD lên 1,56 lần Tổ chức nghiên cứu Ung thư Quốc tế (IARC) uống rượu có thể làm tăng nguy mắc UTDD Các yếu tố tiền sử bệnh lý dày cá nhân tiền sử UTDD gia đình cho liên quan đến nguy UTDD Loét dày, loét tá tràng UTDD có yếu tố chung nhiễm H.pylori Chen (2004) tìm thấy mối liên quan loét dày UTDD thể khơng tâm vị Ngồi hội chứng UTDD di truyền, nguy ung thư dày người có tiền sử UTDD gia đình tăng gấp lần so với người không có tiền sử, nguy chí cao ung thư mô mềm người trưởng thành, ngoại trừ ung thư buồng trứng 1.2.2 Cơ chế phân tử ung thư dày Nhiều nghiên cứu đã tranh toàn cảnh nguyên nhân phân tử có liên quan đến UTDD bao gồm: đột biến gen, biến đổi gen SNP Trong đó SNP biến đổi gen thường gặp người, với khoảng triệu vị trí SNP tìm thấy SNP đã bước đầu giải thích tượng cá thể bị tiếp xúc với điều kiện môi trường khả mắc bệnh lại khác Điều cho sự tương tác đặc điểm di truyền SNP với điều kiện mơi trường Trong UTDD có nhiều đa hình đơn chứng minh có liên quan đó SNP MUC1 PSCA tập trung nghiên cứu 1.3 Đa hình gen MUC1 gen PSCA Ở người, gen MUC1 nằm nhánh dài nhiễm sắc thể số 1, vùng 2, băng (1q22), kích thước 4407 bp, gồm exon intron Còn gen PSCA nằm NST số 8, băng q24.2 Chức MUC1 mã hóa protein đóng vai trò hàng rào chống lại tác nhân ngoại sinh tới tế bào Tuy nhiên tế bào ung thư, MUC1 coi protein sinh ung thư Còn chức PSCA giúp sự biệt hóa, cân bằng miễn dịch hoạt động tế bào T Gen PSCA biểu biểu mô dày nó giảm hoạt động phần mô dày bị dị sản ruột Theo liệu NCBI, đến đã phát khoảng nhiều SNP gen MUC1 gen PSCA liên quan tới nguy UTDD, đó rs2070803 rs4072037 thuộc gen MUC1 rs2976392 rs2294008 thuộc gen PSCA xác định có mối liên quan đáng kể với UTDD Các SNP gây thay đổi cấu trúc protein từ đó làm thay đổi chức protein bình thường Trong đó rs4072037 (MUC1) liên quan đến việc cắt nối exon từ đó tạo biến thể khác protein có chức khác nhau, điều có thể làm giảm chức bảo vệ niêm mạc protein MUC1 Còn rs2070803 (MUC1) biến thể gen nằm khu vực có liên quan đến UTDD Nghiên cứu in vitro cho thấy rs2294008 có thể làm giảm hoạt động chép gen PSCA nằm vị trí bắt đầu chép gen này, chức rs2976392 chưa rõ ràng Sự phối hợp SNP với đặc điểm mô bệnh học hay tiền sử nhiễm H.pylori , tiền sử uống rượu, hút thuốc hay tiền sử cá nhân gia đình UTDD đã bắt đầu tập trung nghiên cứu nhằm làm sáng tỏ tranh chế bệnh sinh vốn phức tạp UTDD Chương ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Tiêu chuẩn lựa chọn nhóm bệnh: Tất bệnh nhân ung thư biểu mô dày khám lâm sàng, làm xét nghiệm cận lâm sàng chẩn đốn hình ảnh chẩn đốn xác định bằng tiêu chuẩn mơ bệnh học Loại trừ bệnh nhân gia đình bệnh nhân không đồng ý tham gia nghiên cứu kết hợp bệnh lý ung thư khác - Tiêu chuẩn lựa chọn nhóm chứng: Những cá thể khơng mắc ung thư dày xác định qua khám lâm sàng nội soi dày với kết nội soi dày bình thường viêm trợt cấp tính, ghép cặp với nhóm ung thư dày theo tuổi, giới 2.2 Thiết kế nghiên cứu: bệnh – chứng, với cỡ mẫu nghiên cứu tính tốn dựa phần mềm OpenEpi dựa kêt Fangli cs (2012) nghiên cứu đa hình gen MUC1 gen PSCA bệnh nhân UTDD Kết hợp liệu từ nghiên cứu phần mềm tính tốn chúng tơi thu cỡ mẫu tối thiểu cần thiết cho nghiên cứu 139 bệnh 139 chứng Trong trình nghiên cứu, chúng tơi lựa chọn 302 bệnh nhân 304 nhóm chứng với tiêu chuẩn lựa chọn loại trừ kể 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: Từ 1/2016 đến 8/2019 - Địa điểm nghiên cứu: Địa điểm lấy mẫu Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, Bệnh viện K, Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Mẫu phân tích Trung tâm Kiểm chuẩn Đảm bảo chất lượng Xét nghiệm – Đại học Y Hà Nội Khoa sinh học ứng dụng (Viện công nghệ Kyoto, Nhật Bản) bằng phương pháp 10% số lượng mẫu phân tích hai Trung tâm để đảm bảo độ xác kết Thực Định lượng IgG H.pylori bằng phương pháp ELISA Trung tâm nghiên cứu Gen – Protein Bộ môn Hóa sinh – Trường Đại học Y Hà Nội Thực định lượng Pepsinogen I, II hệ thống hệ thống máy miễn dịch tự động Khoa xét nghiệm – Bệnh viện Đại học Y Hà Nội 2.4 Các nội dung biến số nghiên cứu ❖ Nội dung các biến số nghiên cứu Tình trạng hút thuốc lá: chia thành nhóm nhóm đối tượng có hút thuốc nhóm đối tượng không hút thuốc Theo khái niệm Trung tâm y học dự phòng Hoa Kỳ CDC (Centers for Disease Control and Prevention), người hút thuốc người đã hút 100 điếu thuốc đời Còn người khơng hút thuốc lá: người chưa hút thuốc hút 100 điếu thuốc đời Tình trạng sử dụng rượu đánh giá dựa tiêu chuẩn WHO Trong đó WHO đưa đơn vị uống chứa 10 gam cồn đơn vị rượu chuẩn Một đơn vị chuẩn tương đương với chén rượu mạnh/Whisky (40 độ, 30 ml); ly rượu vang (13,5 độ, 120 ml); 2/3 chai lon bia (330 ml) (phụ lục 3) Bộ câu hỏi nghiên cứu xây dựng dựa theo Test Audit C tổ chức y tế giới WHO với người uống rượu đến mức có hại tổng điểm câu hỏi nam giới ≥ điểm nữ giới ≥ điểm Người uống rượu đến mức có hại nghiên cứu gọi có tiền sử uống rượu Còn lại bệnh nhân khơng uống rượu uống rượu mức độ thấp gọi không có tiền sử uống rượu Tiền sử bệnh lý dày cá nhân: Thu thập dựa câu hỏi vấn tiền sử bệnh lý dày mà bệnh nhân đã bác sỹ chẩn đốn Tiền sử UTDD gia đình: Thu thập dưạ câu hỏi vấn, đó người có tiền sử UTDD gia đình thành viên huyết thống khác có tiền sử bị UTDD (được chẩn đoán bệnh viện) Tiền sử nhiễm H.pylori đánh giá dựa khai thác tiền sử chẩn đoán nhiễm H.pylori bệnh nhân, thông tin thu thập từ hồ sơ bệnh án kết xét nghiệm định lượng IgG H.pylori Bệnh nhân có tiền sử nhiễm H.pylori kết dương tính Bệnh nhân không có tiền sử nhiễm H.pylori kết âm tính 7 2.5 Phương tiện, hóa chất: Sử dụng trang thiết bị máy móc hóa chất nhà sản xuất uy tín: Gene All (Hàn Quốc), NEB (Anh), Sequencing kit (Mỹ), định lượng Pepsinogen (Abbott – Mỹ), định lượng IgG H.pylori (Đức) 2.6 Kỹ thuật nghiên cứu Tách chiết DNA DNA tách chiết từ mẫu máu theo phương pháp sử dụng kít Exgene™ Blood SV Kit (Gene All, Korea) Phản ứng PCR nhân đoạn vùng gen chứa SNP rs4072037, rs2070803, rs2294008 rs2976392 với cặp mồi đặc hiệu: Gen Rs4072037 Rs2070803 Rs2294008 RS2976392 Trình tự mời 5’-AACCCAGGGGTTACTGAGGCTG-3’ 5’-AGTACGCTGCTGGTCATACTCAC-3’ (mồi ngược) 5’-CTTAGCTGTCCGGGTGTGAAGT-3’ 5’-TGTGGTTCTAGGCAGGAGCAAC-3’ (mồi ngược) 5’-TAGGCTCTGTCCTCCAGAG-3’ 5’-TCTGTCTACCTGCCCCCTAG-3’ (mồi ngược) 5’-CTGGCCATCTGTCCGCAGCT-3’ 5’-CAGATGGAGGAGGATGGCTGGA-3’ (mồi ngược) Kích thước đoạn DNA 332 bp 442 bp 545 bp 117 bp Thực phản ứng enzym cắt giới hạn: Các sản phẩm PCR đạt tiêu chuẩn ủ với enzym cắt đặc hiệu tương ứng gồm AlwNI cho rs4072037, TaqaI cho rs2070803, NlaIII cho rs2294008 PvuII cho rs2976392 Các sản phẩm sau cắt điện di gel agarose có nồng độ phù hợp nhằm phân tách kết sau cắt Đọc kết SNP bằng quan sát số lượng kích thước vạch DNA sản phẩm điện di sau cắt bằng enzym Kiểm tra chất lượng: 10% số lượng mẫu chạy lặp lại hai địa điểm phân tích giải trình tự gen trực tiếp 8 2.7 Xử lý số liệu Nghiên cứu sử dụng phần mềm phân tích số liệu Stata 12.0 phần mềm R 3.6.2 tính toán tỷ số OR (odds ratio) bằng thuật toán OR với khoảng tin cậy 95%CI; so sánh tỷ lệ bằng thuật tốn Chi bình phương; so sánh trung bình bằng test t-student; đánh giá mối liên quan yếu tố nguy với UTDD theo mơ hình hồi quy đơn biến đa biến Đặc biệt nghiên cứu sử dụng thuật toán phần mềm R để xây dựng mơ hình tiên lượng UTDD 2.8 Đạo đức nghiên cứu Đề tài đã thông qua hội đồng đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Đặc điểm nhóm đối tượng nghiên cứu Bảng 3.1 Đặc điểm phân bố theo nhóm tuổi nhóm nghiên cứu Nhóm chứng Nhóm bệnh Tuổi (năm) Tổng n % n % n % < 60 tuổi 148 49,1 152 50,0 300 49,5 ≥ 60 tuổi 154 50,9 152 50,0 306 50,5 p 0,81 Bảng 3.1 mô tả đặc điểm phân bố hai nhóm tuổi 0,05) Bảng 3.2: Đặc điểm giới nhóm nghiên cứu Giới Nhóm bênh Nhóm chứng Tổng n % n % n % Nam 210 69,5 195 64,1 405 66,8 Nữ 92 30,5 109 35,9 201 33,2 p 0,16 Bảng 3.2 Sự khác biệt phân bố giới tính hai nhóm bệnh chứng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Tỷ lệ nam giới (69,5%) mắc bệnh cao gấp 2,28 lần so với nữ giới (30,5%) Một số đặc điểm tiền sử nhóm nghiên cứu tiền sử uống rượu nhóm bệnh (41,7%) cao nhóm chứng (31,6%) với p