Sàng lọc và biểu hiện gen mã hóa protein ức chế protease của vi sinh vật liên kết hải miên spheciospongia vesparium thu nhận tại vùng biển miền trung, việt nam tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Trần Thị Hồng SÀNG LỌC VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN ỨC CHẾ PROTEASE CỦA VI SINH VẬT LIÊN KẾT HẢI MIÊN Spheciospongia vesparium THU NHẬN TẠI VÙNG BIỂN MIỀN TRUNG, VIỆT NAM Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9420201 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ CƠNG NGHỆ SINH HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS.Phạm Việt Cường Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS.Nguyễn Thị Kim Cúc Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ Nguyen Thi Kim Cuc, Ton That Huu Dat, Tran Thi Hong, Pham Viet Cuong, Phylogenetic diversity of microorganisms asscociated with three marine sponges from Mien Trung sea of Viet Nam Journal of Science and Technology, 2017, 55(2), 168-177 Tran Thi Hong, Ton That Huu Dat, Pham Viet Cuong, Nguyen Thi Kim Cuc, Protease inhibitors from marine sponge and spongeassociated microorganisms Journal of Science and Technology (VAST), 2018, 56(4), 405-423 Trần Thị Hồng, Nguyễn Thị Kim Cúc, Tôn Thất Hữu Đạt, Phạm Việt Cường, Sàng lọc vi khuẩn ức chế protease liên kết với hải miên Đà Nẵng, Việt Nam Tuyển tập báo cáo hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc, 2018, 743-748 Nhà xuất Khoa học tự nhiên Công nghệ ISBN: 978-604-913-759-4 Trần Thị Hồng, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc, Sàng lọc gen ức chế protease từ metagenomics vi sinh vật liên kết với hải miên biển Quảng Trị (Việt Nam) Academia Journal of Biology, 2019, 41(2), 49-60 Tran Thi Hong, Ton That Huu Dat, Nguyen Phuong Hoa, Tran Thi Kim Dung, Vu Thi Thu Huyen, Le Minh Bui, Nguyen Thi Kim Cuc, Pham Viet Cuong, Expression and characterization of a new serine protease inhibitory protein in Escherichia coli Biomedical research and therapy, 2020, 7(2): 3633-3644 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Chất ức chế protease (PI), tác nhân làm cho protease khả thủy phân protein thành peptide ứng dụng nhiều lĩnh vực đặc biệt y dược như: điều trị kháng phân hủy sợi huyết (antifibrinolytic); ức chế angiotensin điều trị tăng huyết áp; ngăn chặn nhân lên số virus (HIV, viêm gan C… Ví dụ thuốc ức chế protease saquinavir (tên thương hiệu: Invirase) ritonavir (tên thương hiệu: Novir) sử dụng chủ yếu điều trị HIV/AIDS Chúng dùng phần loại cocktail đa thuốc chứng minh có khả làm giảm đáng kể mức độ virus HIV máu Vì vậy, việc sàng lọc phát phân tử protein có hoạt tính ức chế đặc hiệu protease đích khác nhau, liên quan đến loại bệnh hướng nghiên cứu quan tâm Hải miên vi sinh vật liên kết với hải miên xem nguồn để phát khai thác hợp chất có hoạt tính sinh học phục vụ chế tạo thuốc, peptide có hoạt tính ức chế protease số Tuy nhiên, phần lớn vi sinh vật liên kết hải miên thuộc loại không nuôi cấy nên hạn chế khả khai thác chúng Nhờ kỹ thuật metagenomic, với hỗ trợ thiết bị giải trình tự gen hiệu cao công cụ tin sinh cho phép phát gen, cụm gen có chức mã hóa cho PI, cho phép khai thác PI từ vi sinh vật chưa nuôi cấy Đến Việt Nam có nhiều nghiên cứu hải miên, từ việc phân lập vi sinh vật hải miên, đến tách chiết chất có hoạt tính sinh học từ nhóm vi sinh vật Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sử dụng cơng cụ metagenomics cơng nghệ giải trình tự gen hệ để phát hiện, sàng lọc gen có hoạt tính sinh học, có hoạt tính ức chế protease biểu gen hệ Escherichia coli nấm men Pichia pastoris Chính vậy, thực luận án với tên đề tài: “Sàng lọc biểu gen mã hóa protein ức chế protease vi sinh vật liên kết hải miên Spheciospongia vesparium thu nhận vùng biển Miền Trung, Việt Nam” Mục tiêu nghiên cứu luận án Phát sàng lọc gen liên quan đến sinh tổng hợp chất có hoạt tính ức chế protease từ vi sinh vật liên kết hải miên thu nhận từ biển Miền Trung, Việt Nam phương pháp metagenomics Sau biểu gen chọn lọc in vitro xác định hoạt tính Các nội dung nghiên cứu luận án  Tách DNA vi sinh vật liên kết với số mẫu hải miên, xác định nồng độ DNA độ tinh sạch, lựa chọn mẫu để giải trình tự metagenomics  Phân tích liệu metagenomics mẫu giải trình tự công cụ tin sinh học Đánh giá đa dạng sinh học vi sinh vật liên kết với hải miên Từ CSDL metagenomics khai thác gen liên quan đến sinh tổng hợp chất có hoạt tính ức chế protease  Nghiên cứu biểu gen mã hóa protein ức chế protease hệ biểu Escherichia coli hệ biểu nấm men Pichia pasroris  Đánh giá hoạt tính ức chế protease protein tái tổ hợp Những đóng góp luận án  Đã xây dựng sở liệu DNA metagenome vi sinh vật liên kết hải miên mẫu hải miên QT2 thu nhận vùng biển Quảng Trị (Miền Trung), Việt Nam Cơ sở liệu thu có ý nghĩa mặt khoa học góp phần bảo tồn nguồn gen vi sinh vật biển Việt Nam có tiềm khai thác nguồn gen để ứng dụng vào thực tiễn  Thu nhận gen PI-QT mã hóa cho PIs biểu thành cơng E coli P pastoris Hoạt tính ức chế protease protein biểu đánh giá kết thu cho thấy protein PIQT tái tổ hợp từ E coli có hoạt tính ức chế trypsin, ức chế ɑchymotrypsin protein từ P pastoris thể hoạt tính ức chế trypsin, ɑ-chymotrypsin thermolysin CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Hải miên vi sinh vật liên kết hải miên 1.1.1 Giới thiệu hải miên 1.1.2 Vi sinh vật liên kết hải miên 1.2 Sơ lược metagenomics 1.3 Chất ức chế protease (PIs) 1.3.1 Sơ lược protease 1.3.2 Chất ức chế protease phân loại 1.3.3 Cơ chế hoạt động PIs 1.3.4 Ứng dụng chất ức chế protease 1.3.5 Tình hình nghiên cứu PIs từ vi sinh vật liên kết hải miên nước 1.4 Hệ biểu gen ngoại lai Escherichia coli Pichia pastoris CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu Các mẫu hải miên thu thập biển Quảng Trị, Việt Nam số vật liệu khác sử dụng nghiên cứu 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Vi sinh vật liên kết với hải miên 2.1.3 Hóa chất Các hóa chất dùng nghiên cứu mua chủ yếu từ hãng uy tín Merck (Đức), Sigma (Mỹ), Himedia (Ấn Độ) 2.1.4 Máy móc thiết bị Sử dụng máy móc thiết bị Trung tâm Sinh học phân tử Nghĩa Đô, Viện NCKH Miền Trung, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam số máy móc Viện Hóa Sinh biển, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam 2.1.5 Dung dịch môi trường sử dụng Môi trường sử dụng nuôi cấy biểu gen E coli: Luria-Bertani (LB) Môi trường sử dụng biến nạp biểu gen ngoại lai nấm men P pastoris (theohướng dẫn Pichia Expression Kit) Dung dịch sử dụng điện di DNA: TAE 1X, loading dye 6X, ethidium bromide (EtBr) 0,5 µg/ml Dung dịch sử dụng điện di SDS-PAGE: Bis-acrylamide 30%; Đệm Tris HCl 1,5M pH 8,8; Đệm Tris HCl 1M pH 6,8; Đệm Tris HCl 0.5M pH 6,8; SDS 10%; APS 10%; TEMED… 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp tách DNA metagenome vi sinh vật liên kết hải miên Tách chiết DNA tổng số VSV liên kết với hải miên theo phương pháp Abe cộng (2014) với số cải tiến nhỏ cho phù hợp với điều kiện Việt Nam 2.2.2 Định danh hải miên sinh học phân tử (Medlin et al., 1988) 2.2.3 Phân tích liệu metagenomics Giải trình tự DNA metagenome hệ thống Illumina HiSeq2500(BaseClear - Hà Lan) Dữ liệu thu phân tích phần mềm tin sinh học 2.2.4 Tổng hợp gen PIs từ CSDL metagenomics hải miên thiết kế plasmid mang gen PIs Gen PI-QT tổng hợp dựa trình tự gen contig 000046 từ CSDL metagenomics QT2, tách dòng vào vectơ pUC57, có thiêt kế trình tự enzyme giới hạn EcoRI NotI đầu gen (GenScipt, Mỹ) Tiếp theo, vectơ pUC57 (Thermo, Mỹ) có chứa gen PI-QT vectơ biểu pET-32a (+) (Invitrogen, Mỹ) cắt enzyme giới hạnEcoRI NotI (Fermentas, Lithuania) Sau đó, gen PI-QT tinh đưa vào vectơ biểu pET-32a(+) (biểu E coli) pPIC9 (biểu P pastoris) cách sử dụng enzyme T4 ligase (Thermo, Mỹ) 2.2.5 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp hệ biểu E coli BL21(DE3) Phương pháp biến nạp, biểu tối ưu hóa q trình biểu gen tế bào E coli (Đỗ Thị Huyền et al., 2008; Nguyễn Thị Quý et al., 2013) Phản ứng lai kháng thể (Western blot) (theo hướng dẫn hãng Invitrogen) Tinh protein PIs tái tổ hợp: Protein tái tổ hợp PIs tinh theo hướng dẫn Ni-NTA Purification System (Novex by life technologies) với số cải biến nhỏ Loại bỏ đuôi peptide TRx-His-tag khỏi protein tái tổ hợp (Theo hướng dẫn Novagen) Nhận diện phân tích protein phương pháp proteomics/ tin sinh học 2.2.6 Các phương pháp sử dụng để thu hồi protein PIs tái tổ hợp hệ biểu nấm men Pichia pastoris Theo hướng dẫn Pichia expression kit – Invitrogen với số thay đổi nhỏ phù hợp cho trình biểu 2.2.7 Phương pháp xác định hoạt tính ức chế protease(Sapna., 2013; Jiang et al., 2011) 2.2.8 Phương pháp xác định ảnh hưởng số yếu tố đến protein PIs tái tổ hợp(Sapna., 2013) 2.2.9 Phân tích thống kê Các thí nghiệm thực ba lần biểu thị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (SEM) Phân tích thống kê phân tích phương sai chiều thực phần mềm ANOVA, sau thử nghiệm so sánh nhiều lần phần mềm SPSS v.22 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA) Kết coi có ý nghĩa P