Đặc điểm đột biến gen globin của các bệnh nhân thalassemia tại bệnh viện trung ương thái nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU PHƯƠNG ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN CỦA CÁC BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU PHƯƠNG ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN CỦA CÁC BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh Mã số: 8420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người hướng dẫn khoa học: TS BS Bùi Thị Thu Hương TS Nguyễn Thị Kim Cúc THÁI NGUYÊN - 2019 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Đảng ủy, Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo, thầy cô giáo Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái Nguyên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập hồn thành luận văn Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Bùi Thị Thu Hương TS Nguyễn Thị Kim Cúc tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức, kinh nghiệm quý báu, trực tiếp hướng dẫn khoa học tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đóng góp nhiều ý kiến q báu cho luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám Hiệu Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, Khoa Miễn dịch - Di truyền phân tử Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu thu thập số liệu cho luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp gia đình ln động viên chỗ dựa vững mặt cho tơi suốt q trình học tập nghiên cứu hoàn thành luận văn Thái Nguyên, tháng 11 năm 2019 Tác giả Nguyễn Thu Phương Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid mRNA Messenger Ribonucleic Acid (RNA thông tin) NST Nhiễm sắc thể Cd Codon Kb Kilo base bp Base pair dNTP deoxyribonucleoside triphosphate ddNTP dideoxyribonucleoside triphosphate PCR Polymerase Chain Reaction EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid Hb Hemoglobin HC Hồng cầu MCV Thể tích trung bình hồng cầu MCH Huyết sắc tố trung bình hồng cầu MCHC Nồng độ huyết sắc tố trung bình hồng cầu Nu Nucleotid WHO Tổ chức y tế giới Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI MỤC TIÊU ĐỀ TÀI NỘI DUNG THỰC HIỆN 3.1 Sàng lọc, phát hiện, phân loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA 3.2 Ứng dụng quy trình phát đột biến gen globin 3.3 Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược hemoglobin 1.1.1 Chuỗi globin thường 1.1.2 Các loại hemoglobin sinh lý 1.2 Khái niệm, phân loại bệnh thalassemia 1.3 Sinh lý bệnh thalassemia 1.4 Cơ chế di truyền 1.5 Bệnh học phân tử bệnh β-thalassemia 1.5.1 Gen globin đột biến 1.6 Một số kỹ thuật ứng dụng sinh học phân tử để phát đột biến gen 12 1.6.1 Phương pháp PCR cách đoạn (Gap-PCR) 13 1.6.2 Kỹ thuật khuếch đại nhiều đoạn đầu dò phụ thuộc kết nối (Multiplex ligation dependent probe amplification – MLPA) 13 1.6.3 Kỹ thuật dùng enzyme cắt giới hạn (Restriction endonuclease - RE) 14 1.6.4 Kỹ thuật khuếch đại alen đặc hiệu ARMS-PCR 14 1.6.5 Phương pháp lai ngược (Reverse Dot Blot) 15 1.6.6 Kỹ thuật lai phân tử (Reversehybridization - kit Strip Assay) 15 1.6.7 Kỹ thuật phân tích giải trình tự gen theo ngun lý Sanger 16 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng bệnh phẩm nghiên cứu 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3 Địa điểm thời gian nghiên cứu 18 2.4 Quy trình kỹ thuật nghiên cứu 18 2.4.1 Thu mẫu 18 2.4.2 Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu điện di huyết sắc tố 19 2.4.3 Tách chiết DNA 20 2.4.4 Kiểm tra nồng độ độ tinh sản phẩm DNA 20 2.4.5 Thiết kế mồi 21 2.4.6 Quy trình multiplex PCR xác định đột biến gen thalassemia 23 2.5 Phân tích số liệu 24 2.6 Đạo đức nghiên cứu 24 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Kết tách chiết DNA 25 3.2 Kết quy trình multiplex-PCR 27 3.3 Đặc điểm đột biến gây bệnh Thalassemia Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên 31 KẾT LUẬN, KIẾN NGHỊ 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Phân bố kiểu gen đột biến bệnh nhân  - Thalassemia 31 Bảng 3.2 Đặc điểm phân bố alen đột biến bệnh nhân 32 Bảng 3.3 Phân bố kiểu gen giá trị trung bình số huyết học 34 Bảng 3.4 Đặc điểm đột biến gen alpha thalassemia 35 Bảng 3.5 Phân bố kiểu gen giá trị trung bình số huyết học 38 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn DANH MỤC HÌNH Hình1.1 Sinh tổng hợp globin giai đoạn phát triển khác phôi thai Hình 1.2 Hậu sản xuất dư thừa chuỗi α-thalassemia Hình 1.3 Cơ chế di truyền nhiễm sắc thể thường Hình 1.4 Cấu trúc gen β-globin Hình 1.5 Cấu trúc gen α-globin 10 Hình 2.1 Sơ đồ sàng lọc, chẩn đoán đột biến gen thalassemia 19 Hình 2.2 Vị trí primer xác định đột biến alpha globin gen 23 Hình 3.1 Kiểm tra nồng độ độ tinh mẫu sản phẩm DNA 25 Hình 3.2 Hình ảnh điện di DNA tổng số tách chiết từ máu ngoại vi đối tượng nghiên cứu 26 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 1) 28 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình beta 2) 28 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm multiplex PCR (quy trình alpha) 29 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn MỞ ĐẦU LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI Thalassemia tên loại bệnh thiếu máu di truyền Nguyên nhân đột biến gen globin làm giảm khả tổng hợp chuỗi globin phân tử hemoglobin Tùy theo thiếu hụt khả tổng hợp chuỗi globin mà bệnh thalassemia chia thành loại khác loại phổ biến α-thalassemia, β-thalassemia Hiện nay, có khoảng 500 đột biến liên quan đến thalassemia báo cáo toàn giới Tại Việt Nam, theo nhiều nghiên cứu tần số alen người Việt Nam cho thấy có loại đột biến gây bệnh β-thalassemia Cd41/42(-TCTT), Cd71/72(+A), CD17, IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), -28(AG), IVS2-654(C>T) Cd26(GAG>AAG) [3] Với alpha thalassemia số đột biến xoá đoạn lớn kiểu SEA, THAI; đột biến xoá đoạn nhỏ alpha 3.7 alpha 4.2;đột biến điểm HbCS HbQS Việc chẩn đoán thalassemia trước dựa chủ yếu vào triệu chứng lâm sàng xét nghiệm sinh hoá huyết học Tuy nhiên, chẩn đoán giúp sàng lọc xác định số thể thalassemia định Với đối tượng người lành mang gen thai nhi (trong chẩn đoán trước sinh) phương pháp khơng thể xác định thể bệnh Ngày nay, với tiến vượt bậc khoa học biệt khoa học ứng dụng y học giúp nhà nghiên cứu chẩn đoán bệnh thalassemia cấp độ phân tử, phát xác có mặt loại đột biến gây bệnh, mở hỗ trợ lớn cho cơng tác chẩn đốn trước sinh tư vấn di truyền phòng bệnh thalassemia Ở nước ta kỹ thuật giúp cho chẩn đoán đột biến gen nghiên cứu đạt số thành tựu định Tuy nhiên, phần lớn dịch vụ chẩn đoán tập trung Viện, bệnh viện tuyến Trung ương bệnh nhân thalassemia chủ yếu tập trung đồng bào dân tộc người khu vực vùng cao miền núi Khả Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn tiếp cận nhóm người tới tuyến Trung ương hạn chế Mặt khác thalassemia bệnh đặc trưng cho vùng miền tương ứng với nhóm chủng tộc Do triển khai dịch vụ chẩn đoán đột biến gen thalassemia, người ta phải thực nghiên cứu để xác định loại đột biến tần số allen nhằm thiết lập labo cách chuẩn xác tối ưu Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên bệnh viện tuyến Trung Ương tỉnh miền núi Đông Bắc, khu vực mà tập trung hầu hết nhóm dân tộc người có dân số đơng nước Tỷ lệ người mang gen thalassemia khu vực báo cáo cao 10-30% Hàng năm, bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên tiếp nhận 300-500 lượt bệnh nhân thalassemia thể nặng vào truyền máu thải sắt Nhu cầu dự phòng bệnh thalassemia cho khu vực cấp thiết Để đáp ứng nhu cầu đó, bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên thành lập khoa Miễn Dịch - Di truyền phân tử nhằm cung cấp dịch vụ sang lọc chẩn đoán trước sinh bệnh thalassemia bệnh di truyền khác Để đánh giá kết bước đầu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử sàng lọc đột biến gen gây bệnh thalasemia nhóm nghiên cứu tiến hành đề tài nghiên cứu “Đặc điểm đột biến gen globin bệnh nhân thalassemia bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên” MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Ứng dụng kỹ thuật Multiplex -PCR sàng lọc xác định số đột biến phổ biến gây bệnh thalassemia NỘI DUNG THỰC HIỆN 3.1 Sàng lọc, phát hiện, phân loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA 3.2 Ứng dụng quy trình phát đột biến gen globin 3.3 Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Hóa chất Kit tách ADN thương mại hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối) Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời đột biếnmất đoạn; đồng thời cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control) Mồi Trình tự ( 5’ - 3’) SEA CF CTC TGT GTT CTC CAG TAT TGG AGG GAA GGA G SEA NR TGA AGA GCC TGC AGG ACC AGG TCA GTG ACC G SEA MR ATA TAT GGG TCT GGA AGT GTA TCC CTC CCA FIL MF AAG AGA ATA AAC CAC CCA ATT TTT AAA TGG GCA FIL MR GAG ATA ATA ACC TTT ATC TGC CAC ATG TAG CAA THAI MF CAC GAG TAA AAC ATC AAG TAC ACT CCA GCC THAI MR TGG ATC TGC ACC TCT TGG GTA GGT TCT CTA CC α2/3.7 F CCC CTC GCC AAG TCC ACC C 3.7/20.5R AAA GCA CTC TGA GGG TCC AGC G α2 R AGA CCA GGA AGG GCC GGT G 4.2 R CCC GTT GGA TCT TCT CAT TTC CC 4.2 F GGT TTA CCC ATG TGG TGC CTC Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Các bước thực quy trình Tách chiết ADN Tách chiết ADN từ máu ngoại vi Chuẩn bị phản ứng PCR STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ H2O 2X GoTaq Green MM DMSO 1,0 Hỗn hợp mồi 5,0 DNA 1,0 Tổng thể tích 5,5 12,5 25,0 Ly tâm nhẹ để thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn Đặt vào máy PCR Thực 35 chu kỳ gồm giai ñoạn duỗi xoắn 95oC Bấm start để máy chạy Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose Cân g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X ) vào bình, lắc Đun lần phút lò vi sóng đến agarose tan hồn toàn Để ấm đến 600 đổ vào khay cắm lược Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rút lược Điện di Lấy µl sản phẩm PCR + µl đệm tra mẫu + µl dH20 Trộn nhỏ vào giếng theo thứ tự Nhỏ µl marker ADN vào giếng Đặt gel vào máy điện di Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Đổ đệm điện di ngập gel chạy 100 V 20 phút Nhuộm gel với dung dịch ethidium bromide phút Nhận định kết Kết dương tính nhìn thấy vạch sáng đèn UVvà sản phẩm điện di từ mẫu có kích thước tương đương với chứng dương Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH XÉT NGHIỆM PHÁT HIỆN GEN BỆNH BETA THALASSEMIA BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP Nguyên lý Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) phản ứng cho phép nhân xác trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần Sử dụng phương pháp PCR thông thường với cặp mồi đặc trưng phát đột biến Để phát nhiều đột biến phải làm nhiều xét nghiệm PCR Có nhiều loại đột biến gây bệnh Beta Thalassemia Trong trường hợp sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR giải pháp tối ưu Đây phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi phản ứng PCR Như cần phản ứng Multiplex PCR phát nhiều đột biến lúc Phương tiện - hóa chất xét nghiệm 2.1 Phương tiện Máy PCR hệ thống máy vi tính Bộ lưu điện Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụpảnh; Buồng vô trùng (biology cabinet); Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút); Máy vortex; Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl; Đầu có màng lọc; Ống eppendorf 1,5 ml vơ trùng, khơng có enzym nucleaza; Ống PCR 0,2 ml vơ trùng, khơng có enzym nucleaza; Tủ lạnh 4-80C, tủ âm sâu -200C; Găng tay Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn 2.2 Hóa chất Kit tách ADN thương mại hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ cơng ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối) Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời đột biến điểm đồng thời cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control) Theo bảng sau: Trình Tự Mồi (5’- 3’) Mồi 5’ β-URR—109 ACCTCACCCTGTGGAGCCAC 3’ βoDEL GAGTCAAGGCTGAGAGATGCAGGA 5’ βoDEL CAATGTATCATGCCTCTTTGCACC IVS I-5 M CTCCTTAAACCTGTCTTGTAACCTTGTTAG Cd 17 M CTCACCACCAACTTCATCCACGTTCAGCTA Cd 41-42 M GAGTGGACAGATCCCCAAAGGACTCAACCT 95M TCA GGA TCC ACG TGC AGC TTT Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN Thuốc nhuộm redsafe Tiến hành quy trình kỹ thuật Lấy bệnh phẩm ml máu ngoại vi đựng ống chống đông EDTA 3.2 Tiến hành kỹ thuật Tách chiết ADN - Xem quy trình “ Tách chiết ADN từ máu ngoại vi” Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Thực phản ứng Multiplex PCR phát đột biến bệnh beta thalassemia STT Sinh phẩm Thành phần (µl)/1 pứ H2 O 1,9 2X GoTaq Green MM 7,5 Primer 3’ β DEL 5’ β DEL 5’ β URR-109 1,5 IVS1-5 M 0,5 CD95 M 0,3 CD17 M 0,2 CD41/42 M 0,2 10 DNA 1,0 Tổng thể tích 15 (ul) + Ly tâm nhẹ để thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn + Đặt vào máy PCR + Chọn chu trình nhiệt: chu kỳ : 950C phút chu kỳ: 940C 20 giây chu kỳ: 620C 20 giây 35 chu kỳ: 720C 35 giây chu kỳ: 720C phút 150C mãi + Bấm start để máy chạy Điện di sản phẩm PCR Chuẩn bị gel agarose Cân g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X ) vào bình, lắc Đun lần phút lò vi sóng đến agarose tan hồn tồn Để ấm đến 600 nhỏ thuốc nhuộm vào sau đổ vào khay cắm lược Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đơng rút lược Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Điện di Lấy 6µl sản phẩm PCR nhỏ vào giếng theo thứ tự Nhỏ µl marker ADN vào giếng Đặt gel vào máy điện di Đổ đệm điện di ngập gel chạy 100 V 20 phút Nhận định kết Kết dương tính nhìn thấy vạch sáng đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thơng tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN Ở BỆNH NHÂN BETA-THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN Nguyễn Thu Phương1,Bùi Thị Thu Hương1, Nguyễn Thị Kim Cúc2 Mai Anh Tuấn1, Nguyễn Kiều Giang1, Mã Thị Ánh3, Nguyễn Quang Hảo3 Chịu trách nhiệm : Bùi Thị Thu Hương, Trường đại học Y Dược Thái Nguyên ĐT: 0912916863 Email: huongbuithithu@tnmc.edu.vn TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Xác định kiểu đột biến gen gây bệnh Thalassemia nhóm bệnh nhân điều trị thiếu máu tan máu Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 43 mẫu bệnh phẩm máu ngoại vi bệnh nhân - thalassemia sàng lọc đột biến gen HBB kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR Kết nghiên cứu:15 kiểu tổ hợp gen phát chia thành nhóm gồm đồng hợp tử 0 thalchiếm 27,9% (gồm 17/17; 41/42/41/42; 71/72/71/72); Dị hợp tử kép 0/0 và0/+ chiếm 60,5% (gồm 17/41/42; 71/72/IVS1.1; 41/42/IVS1.1; 17/cd26; 41/42/cd26; 41/42/-90; 71/72/cd26; -28/IVS2.654);dị hợp tử đơn chiếm 11,6% (gồm 41/42/;71/72/;cd26/;-28/) Đột biến đơn alen CD41/42 chiếm tỷ lệ cao 37,1%, alen CD17 22,1% CD26 (HbE) 19,8% Từ khoá: Beta -thalassemia, ARMS-PCR, đột biến gen SUMARY STUDY OF THE CHARACTERISTICS OF THE GLOBIN GENE MUTATION AMONG ΒETA-THALASSEMIA PATIENTS IN THAINGUYEN GENERAL HOSPITAL Objectives: To determine the beta-globin genotypes among thalassemia patients in Thai Nguyen National Hospital Subjects and Methods: 43 whole blood samples of  thalassemia patients were screened for mutation by Multiplex ARMS-PCR Results: 15 genotypes were divided into groups: homozygous 0 thal accounting for 27.9% (include: 17/17;41/42/41/42; 71/72/71/72); Double heterozygous 0/0 0/+ accounting for 60.5% (gồm 17/41/42; 71/72/IVS1.1; 41/42/IVS1.1; 17/cd26; 41/42/cd26; 41/42/-90; 71/72/cd26; -28/IVS2.654); single heterozygous accounting for 11.6% 41/42 71/72 ( /; /;cd26/;-28/) The proportion of single-allels mutation CD 41/42 is the highest, standing at 37.1%, this was follow by the figure for alell CD17 (22,1%) and CD26 (HbE) (19,8%) Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Key word: Beta -thalassemia, ARMS-PCR, gene mutation I ĐẶT VẤN ĐỀ Thalassemia số bệnh thiếu máu di truyền phổ biến giới, bệnh liên quan chặt chẽ với nguồn gốc dân tộc, phân bố khắp tồn cầu song có tính địa dư rõ rệt Beta thalassemia bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường đột biến gen hemoglobin beta (HBB) quy định Vùng gen gây đột biến beta thalassemia nằm cánh ngắn nhiễm sắc 11 (11p15.5), dài 1600bp, gồm exon intron Có khoảng 200 đột biến HBB tìm thấy phân thành nhóm: nhóm gây hồn tồn số lượng chuỗi β globin (β0 globin) nhóm làm giảm số lượng chuỗi β globin (β+ globin)[6] Các đột biến phân bố với tỷ lệ khác vùng địa lý nhóm dân tộc khác Tại Việt Nam, số nghiên cứu miền Trung miền Nam cho thấy có đột biến gây 95% trường hợp β thalassemia gồm CD17 (AAG-TAG), CD41/42(-TCTT), -28 (A>G), CD71/72(+A), IVS1-1(G>T), IVS1-5(G>C), IVS2-654(C>T) CD26 (GAG>AAG) [9], [10], [8] Tuy vậy, đặc điểm mang gen thalassemia khu vực Đơng Bắc có tỉnh Thái Ngun nghiên cứu Do tính đặc thù bệnh thalassemia với yếu tố địa dư dân tộc, việc nghiên cứu đặc điểm mang gen bệnh cần thiết việc xây dựng chiến lược sàng lọc dự phòng bệnh thalassemia Trong nghiên cứu kiểu gen đột biến, xét nghiệm di truyền phân tử cung cấp thông tin quan trọng chẩn đốn sớm, điều trị, tiên lượng dự phòng bệnh Đặc biệt, xét nghiệm gen điều kiện thiết yếu để thực chẩn đoán trước sinh với bệnh beta thalassemia Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên bệnh viện tuyến Trung ương tỉnh miền núi Đông Bắc Hàng năm, bệnh viện tiếp nhận hàng trăm lượt bệnh nhân thalassemia vào điều trị truyền máu thải sắt Phần lớn bệnh nhân người dân tộc thiểu số tỉnh khu vực miền núi phía Đơng Bắc Từ năm 2017, bệnh viện trang bị labo sinh học phân tử, đủ lực thực xét nghiệm xác định đột biến gen nhóm bệnh nhân thalassemia Do đó, lần đầu nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử thực đề tài với mục tiêu: Xác định kiểu đột biến gen gây bệnh β thalassemia kỹ thuật mutiplex ARMS-PCR II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 43 bệnh nhân chẩn đoán mắc bệnh -Thalassemia Khoa Huyết học lâm sàng Khoa Nhi tổng hợp, Bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên Dựa vào triệu chứng lâm sàng cận lâm sàng điển hình Tiêu chuẩn lựa chọn: Xét nghiệm điện di huyết sắc tố với tỷ lệ HbA2>3,5%, HbF tăng >5% và/hoặc kèm theo HbE Khám sàng có hội chứng thiếu máu tan máu mạn tính Thời gian địa điểm nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Thời gian: Từ tháng 6/2017 đến 4/2018 Khoa Miễn dịch – Di truyền phân tử, Bệnh viện đa khoa Trung ương Thái Nguyên Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp nghiên cứu: Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả cắt ngang 3.2 Các kỹ thuật sử dụng nghiên cứu Kỹ thuật tách chiết DNA + 3ml máu tĩnh mạch cánh tay bệnh nhân  thalassemia sử dụng để tách DNA Kỹ thuật tách DNA dựa kit thương mại QiaAmp DNA Mini Kit (Qiagen) + Kiểm tra nồng độ độ tinh DNA tách chiết phương pháp đo quang máy NanoDrop: nồng độ DNA 300-380ng/ml, đánh giá độ tinh tỷ lệ A260nm/A280nm = 1,8 Kỹ thuật phát đột biến gen gây bệnh beta thalassemia Kỹ thuật mutiplex ARMS-PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu alen (của hãng Sigma – Mỹ) khuyến cáo tài liệu Liên đoàn Thalassemia giới để ứng dụng nghiên cứu [7], phát dạng đột biến phổ biến quần thể người Việt Nam Quy trình xét nghiệm bao gồm quy trình Viện Huyết học truyền máu Trung ương chuẩn hóa chuyển giao kỹ thuật Nhận định kết sau: I - Đặc điểm băng sản phẩm PCR Quy trình 1: Multiplex Control + cd95 + cd41/42 + IVS1-5 + cd17 Sản phẩm Kích thước (bp) Nhận xét Control 861 Nội kiểm cho phản ứng PCR cd95 600 cd41/42 443 IVS1-5 285 cd17 240 Quy trình 2: Multiplex Control + IVS1-1 + cd26 + IVS2-654 Sản phẩm Kích thước (bp) Nhận xét Control 656 Nội kiểm cho phản ứng PCR IVS2-654 829 IVS1-1 281 cd26 258 Quy trình 3: Đột biến -28 + cd71/72 Sản phẩm Kích thước (bp) Nhận xét Control 861 Nội kiểm cho phản ứng PCR -28 649 cd71/72 238 II - Đọc kết beta thalassemia Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Các trường hợp Dương tính một đột biến dị hợp tử - Có băng control, có băng đột biến có băng normal tương ứng Dương tính một đột biến đờng hợp tử - Có băng control, có băng đột biến khơng có băng normal tương ứng Dương tính nhiều đột biến - Có băng control băng đột biến trùng với kích thước tính tốn Nhận xét + Dương tính … (tên đột biến) dị hợp tử + Dương tính … (tên đột biến) đồng hợp tử + Dương tính … (tên đột biến), … (tên đột biến) Các mẫu không phát đột biến phổ biến gửi tới Viện Huyết học truyền máu Trung ương để thực kỹ thuật giải trình tự gen (phương pháp Sanger) để phát đột biến gặp Trong nghiên cứu 100% mẫu phát đột biến gen Phương pháp xử lý số liệu Tần số tỷ lệ phần trăm (%) sử dụng cho thống kê mô tả với biến định lượng, giá trị trung bình độ lệch chuẩn dùng cho thống kê mô tả với biến định tính Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu Hội đồng xét duyệt đề cương nghiên cứu Bênh viện thơng qua Đối tượng tham gia hồn tồn tự nguyện Thơng tin cá nhân đối tượng mã hoá III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kiểu đột biến gen gây bệnh Beta - Thalassemia Bảng Phân bố kiểu gen đột biến bệnh nhân  - Thalassemia Kiểu tổ hợp Kiểu hình Kiểu gen  /17 41/42/41/42 71/72/71/72 17/41/42 71/72/IVS1.1 41/42/IVS1.1 17/cd26 41/42/cd26 71/72/cd26 41/42/-90 -28/IVS2.654 41/42/ 71/72/ cd26/ 17 Đồng hợp tử (n= 12) 0/0 0/0 Dị hợp tử kép (n= 26) Dị hợp tử đơn (n=5) 0/+ 0/ +/ Số lượng 8 1 1 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN Tỷ lệ % 7,0 18,6 2,3 11,6 2,3 4,7 18,6 14,0 4,7 2,3 2,3 4,7 2,3 2,3 http://lrc.tnu.edu.vn -28/ 2,3 Tổng 43 100 0 : đột biến gen HBB gây mất hoàn toàn chức tổng hợp chuỗi  globin + : đột biến gen HBB gây giảm một phần chức tổng hợp chuỗi  globin  : kiểu gen bình thường Nhận xét: 41/43 bệnh nhân tham gia nghiên cứu phát thấy đột biến gen quy trình AMMS-PCR, 2/43 trường hợp phát thêm đột biến alen giải trình tự gen Có nhóm tổ hợp kiểu gen gồm trường hợp mang kiểu gen dị hợp tử đơn (11,6%), 12 trường hợp mang kiểu gen đồng hợp tử (27,9%) 26 trường hợp có kiểu gen dị hợp tử kép (60,5%) Trong số dị hợp tử kép, 16 trường hợp cớ phối hợp đột biến  thalassemia với HbE (37,2%) Bảng Đặc điểm phân bố alen đột biến bệnh nhân Kiểu hình Alen đột biến Số lượng Tỷ lệ %  - Thalassemia +- Thalassemia cd17 (A  T) 19 22,1 cd 41/42 (-TTCT) 32 37,1 cd 71/72 (+A) 7,0 IVS 1.1 (G T) 3,5 cd 26 (GA) HbE 17 19,8 -28 (A G) 2,3 - 90 (C T) 1,2 IVS 2.654 (C T) Không phát đột biến alen 1,2 5,8 86 100 Tổng Nhận xét: Trong 86 alen 43 bệnh nhân β - thalassemia, có loại đột biến loại alen đột biến panel sàng lọc, bao gồm: - đột biến thuộc nhóm 0 thalassemia (cd17, IVS 1.1, cd 41/42, cd71/72) đột biến thuộc nhóm + thalassemia (cd26-HbE), -28, IVS 2.654 (C T)) - đột biến khác panel sàng lọc cd -90 phát phương pháp giải trình tự gen Số hóa Trung tâm Học liệu Cơng nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Trong số alen đột biến, CD 41/42 (-TTCT) chiếm tỷ lệ cao (37,1%), CD17 (A  T) chiếm 22,1% CD26(HbE) 19,8% IV BÀN LUẬN Bước đầu áp dụng kỹ thuật ARMS PCR cho 43 trường hợp bệnh nhân điều trị -thalassmia bệnh viện Trung ương Thái Nguyên, phát 15 kiều tổ hợp gen biểu nhóm kiểu hình chiếm tỷ lệ cao dị hợp tử kép (60,5%) tiếp đến nhóm đồng hợp tử (27,9%) dị hợp tử đơn chiếm (11,6%).Trong số kiểu gen, kiểu đồng hợp tử 41/42/41/42 dị hợp tử kép 17/cd26 hay - thalassemia - HbE chiếm tỷ lệ cao (18,6%) Điều phù hợp với tình trạng mang gen khu vực Theo nghiên cứu Nguyễn Kiều Giang cộng cho thấy tần xuất đột biến alen CD41/42, CD17 CD26 đứng đầu nhóm đột biến gây  thalassemia khu vực Thái Nguyên [1] Nghiên cứu khác nhóm quần thể Việt Nam cho thấy tần xuất CD41/42 đứng đầu với tỷ lệ 35%, tiếp đến CD17 chiếm 25% [10] Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật multiplex ARMS PCR cho loại đột biến thông thường phần lớn phát tối thiểu đột biến gen tất trường hợp Tuy nhiên có trường hợp chúng tơi phát đột biến đơn alen CD41/42 kiểu hình lâm sàng khơng tương xứng với tình trạng mang gen Trường hợp gửi làm giải trình tự gen với kết xác định đột biến alen lại CD-90 Đây đột biến gặp cộng đồng người Việt Nam thuộc nhóm + thalassemia, nhiên phối hợp với đột biến 0, + E gây lên hội chứng thalassemia Kết cho thấy diện đột biến gặp gợi ý cho việc thiết lập thêm mồi cho đột biến để sẵn sàng chẩn đoán trường hợp kỹ thuật PCR chưa trang bị thêm phương tiện chẩn đoán khác Trong 86 alen khảo sát, alen đột biến CD41/42 chiếm tỷ lệ cao (37,1%) tiếp đến CD17 (22,1%), loại đột biến khác chiếm tỷ lệ Có 17 bệnh nhân (19,8 %) phát mang gen đột biến CD26 (HbE) trường hợp kết hợp với gen β0 β+ tạo nên bệnh β thalassemia/HbE trường hợp β0/βE thể tình trạng thiếu máu nặng huyết đồ Kiểu alen CD95 (+A) phát số nghiên cứu trước xem loại đột biến người Việt Nam Bạch Quốc Khánh cộng nghiên cứu 324 bệnh nhân beta thalassemia/HbE cho thấy tỷ lệ kết hợp CD95-CD26 (HbE) 1,9% nghiên cứu Nguyễn Thuỳ Trang 0,7% [3],[4] Tuy nhiên nghiên cứu không phát trường hợp mang alen đột biến CD95 Có thể phân bố dân tộc nhóm bệnh nhân thalassemia hầu hết người dân tộc thiểu số CD95 (+A) chủ yếu phát nhóm người Kinh [5], [10] Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn Kỹ thuật multiplex PCR cho loại đột biến phổ biến gen HBB Việt Nam chẩn đốn xác kiểu gen cho 41/43 trường hợp trẻ bệnh  thalassemia điều trị Thái Nguyên Kết nghiên cứu cho thấy đa dạng kiểu gen đột biến nhóm quần thể nghiên cứu, điều cho thấy cần thiết phải việc ứng dụng kỹ thuật kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán Việc bước có ý nghĩa hỗ trợ thơng tin cần thiết cho bác sỹ lâm sàng chẩn đoán bệnh, tư vấn di truyền bước đệm cho xây dựng quy trình chẩn đốn trước sinh – quy trình quan trọng việc dự phòng trường hợp mắc bệnh thalassemia quần thể V KẾT LUẬN - Bước đầu áp dụng thành công kỹ thuật ARMS PCR xác định đột biến gen gây bệnh thalassemia cho 43 bệnh nhân điều trị khoa Nhi bệnh viện Trung ương Thái Nguyên 15 kiểu tổ hợp gen phát chia thành nhóm gồm đồng hợp tử 0 thal chiếm 27,9% (gồm 17/17;41/42/41/42; 71/72/71/72); Dị hợp tử kép 0/0 và0/+ chiếm 60,5% (gồm 17/41/42; 71/72/IVS1.1; 41/42/IVS1.1; 17/cd26;41/42/cd26;41/42/-90;71/72/cd26; -28/IVS2.654); dị hợp tử đơn chiếm 11,6% (gồm 41/42/;71/72/;cd26/;-28/) Đột biến đơn alen CD41/42 chiếm tỷ lệ cao (37,1%), alen CD17 (22,1%) CD26 (HbE)(19,8%) LỜI CẢM ƠN Xin trân trọng cảm ơn Ban Giám đốc, Khoa Huyết học lâm sàng, Khoa Nhi, Bệnh viện Trung ương Thái Nguyên giúp chúng tơi hồn thành nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 Nguyễn Tiến Dũng Nguyễn Kiều Giang, "Thực trạng mang gen bệnh tan máu bẩm sinh phụ nữ người dân tộc Tày huyện Định Hóa, Tỉnh Thái Ngun.", Tạp chí Y Học Việt Nam, 2016, 448, tr 13-20 Vũ Thị Bích Hường, "Cơ sở phân tử bệnh alpha thalaasemia số điểm cần lưu ý chẩn đoán người mang gen ", Kỷ yếu hội nghị khoa học Thalassemia toàn quốc lần thứ I, 2015, tr 10-18 Bạch Quốc Khánh, "Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, xét nghiệm đột biến gen bệnh nhân beta Thalassemia/HbE", Kỷ yếu hội nghị khoa học Thalassemia toàn quốc lần thứ I, 2015, tr 150-156 Nguyễn Thị Thùy Trang, "Xác định tỷ lệ số đột biến phổ biến bệnh nhân Thalassemia khám điều trị viện huyết học – truyền máu TW", Tạp chí Y Học Việt Nam, 2014, 10, tr 355-359 Cai S Chehab F F., "New frameshift mutation, insertion of A, at codon 95 of the beta-globin gene causes beta-thalassemia in two Vietnamese families", Hum Mutat, 1996, 8(3), tr 293-4 Galanello R Origa R., "Beta-thalassemia", Orphanet J Rare Dis, 2010, 5, tr H V Nguyen et al, "Thalassemia and hemoglobinopathies in Thua Thien Hue Province, Central Vietnam", Hemoglobin, 2013, 37(4), tr 333-42 John Old, Cornelis L., Harteveld Joanne, et al (2012) Prevention of thalassemia and other haemoglobin disorders, Volume II (2012), Thalassemia International Ferderation, 2nd edition O'Riordan S cộng sự, "Large scale screening for haemoglobin disorders in southern Vietnam: implications for avoidance and management", Br J Haematol, 2010, 150(3), tr 359-64 Svasti S et al, "Molecular analysis of beta-thalassemia in South Vietnam", Am J Hematol , 2002, 71(2), tr 85-8 Số hóa Trung tâm Học liệu Công nghệ thông tin – ĐHTN http://lrc.tnu.edu.vn ...ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THU PHƯƠNG ĐẶC ĐIỂM ĐỘT BIẾN GEN GLOBIN CỦA CÁC BỆNH NHÂN THALASSEMIA TẠI BỆNH VIỆN TRUNG ƯƠNG THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công... loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA 3.2 Ứng dụng quy trình phát đột biến gen globin 3.3 Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên Số hóa Trung. .. loại bệnh nhân, thu thập mẫu máu tách chiết DNA 3.2 Ứng dụng quy trình phát đột biến gen globin 3.3 Phân tích đặc điểm đột biến gen gây bệnh Thalassemia Bệnh viện Trung Ương Thái Nguyên