phân tích mẫu GC LC IC

TỔNG QUÁT VỀ SẮC KÝ Động học trình sắc ký: Mỗi phân tử chất trình sắc ký không ngừng chuyển từ pha động vào pha tĩnh ngược lại Khi phân tử bị hấp phụ nằm lại Còn giải hấp phụ di chuyển tốc độ với pha động Quá trình hấp phụ – giải hấp phụ lặp lặp lại phân tử cách ngẫu nhiên Do có số phân tử chuyển động với tốc độ nhanh tốc độ trung bình, số khác chuyển động với tốc độ chậm kết chuyển động hỗn loạn làm cho vùng giãn rộng Tốc độ dòng lớn bé giảm độ hiệu cột Có nhiều cách phân loại gọi tên phương pháp sắc ký Ví dụ: – Theo chế trình phân tách: sắc ký hấp phụ (TLC, sắc ký giấy), sắc ký phân bố (GC, HPLC), sắc ký trao đổi ion (IC), sắc ký rây phân tử (lọc gel hay thấm gel), sắc ký lực điện di mao quản (CE) – Theo pha động, người ta phân thành: sắc ký lỏng (liquid chromatography, LC), sắc ký khí (gas chromatography, GC), sắc ký lỏng tới hạn (super – critical fluid chromatograyphy, SFC) – Theo hình dạng pha tĩnh người ta xếp phương pháp sắc ký vào nhóm sắc ký mặt phẳng (palar chromatography, PC) gồm sắc ký giấy, sắc ký lớp mỏng…; sắc ký cột (columm chromatography, CC) gồm sắc ký cột cổ điển, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí… – Theo phương pháp khai triển sắc ký, người ta phân phương pháp phân tích tuyến, phương pháp chỗ phân tích rửa giải – Trên thực tế, người ta thương gọi tên phương pháp sắc ký theo thói quen khơng gọi theo cách thống Ba loại sắc ký phổ biến gồm TLC, HPLC, GC Phân loại sắc ký dựa chế cân bằng:  Sắc ký hấp phụ (Adsorption): pha tĩnh chất rắn có khả hấp phụ giữ bề mặt, thường chất vô (SiO , Al2O3 , than hoạt tính…) Pha động lỏng khí  Sắc ký phân bố (Distribution): pha tĩnh chất lỏng khơng hồ lẫn với pha động, chất lỏng bao bề mặt chất rắn gọi giá hay chất mang phải chất trơ, không tham gia vào sắc ký Đây dạng sắc ký phổ biến gồm loại: pha động dạng lỏng (HPLC) khí (GC) Một số tài liệu xếp chung hấp phụ phân bố chung nhóm Sắc ký phân cực (Polarity)  Sắc ký rây phân tử SEC (Size Exclusion) gồm GPC (Gel Permeation) với pha động nước GFC (Gel Filtration) với pha động dung mơi hữu cơ: tách dựa kích thước phân tử, phân tử kích thước lớn kích thước lỗ pha tĩnh không khuếch tán, tương tác pha tĩnh khỏi cột Thường dùng cho giai đoạn clean-up mẫu sinh học sau chiết, giúp giảm cản nhiễu bảo vệ cột  Sắc ký ion IC: trao đổi (exchange), ghép cặp (pair), lùi ion hoá (exclusion) Được áp dụng phổ biến cho xác định anion Việc xác định cation giới hạn cho kim loại kiềm, kiềm thổ, NH 4+ nhiên không nhạy phương pháp khác (ICP-AES, GF-AAS, ) Các thông số sắc ký : * Độ phân giải Rs (resolution): đánh giá khoảng cách pic Rs = 2(t2 - t1)/(Wb1 + Wb2) Rs ≥1.5 đạt yêu cầu, Rs q lớn khơng tốt thời gian phân tích lâu * Hệ số dung lượng K’ (retention / capacity factor): Hệ số dung lượng chất cho biết khả phân bố chất hai pha cộng với sức chứa cột tức tỷ số lượng chất tan pha tĩnh lượng chất tan pha động thời điểm cân K’ = ( tR - t0)/ t0 Nếu K’ nhỏ tR nhỏ tách Nếu K’ lớn pic bị dỗng Trong thực tế K’ từ 1- tối ưu * Độ chọn lọc α (selectivity): α = K’1/ K’2 * Số đĩa lý thuyết (theoretical plate) hay đánh giá hiệu cột qua giá trị bề rộng pic, độ nhọn N = 5,54(t/Wb)2 t : thời gian lưu (giây) ; Wb bề rộng pic phân nửa chiều cao pic (giây) Với chất liệu nhồi cột, đường kính N lớn cột dài, đường kính hạt nhồi nhỏ + Sắc ký lỏng : N < 20.000 + Sắc ký khí : N vài trăm ngàn tới triệu * Hệ số kéo đuôi (tailing) hay đối xứng (assymetry factor): T=B/A B, A : khoảng cách từ (đường thẳng từ đỉnh pic vng góc với đáy) đến bên sườn pic độ cao 1/10 pic Trong thực tế chấp nhận T=0,8-1,2 * Chiều cao tương đương với đĩa lý thuyết HETP =L/N =0,1-1 mm với L: chiều dài cột Phân chia loại cột sắc ký: Sắc ký GC có hai loại là: - Cột nhồi (packed): pha tĩnh nhồi vào cột, cột có đường kính 24mm chiều dài vài m, chủ yếu dùng sắc ký điều chế - Cột mao quản (capillary, open tubular): pha tĩnh phủ lớp mỏng mặt (loại WCOT), cột có đường kính 0.1-0.5mm, độ dày film 0.1-5µm chiều dài 10-100m Cột mao quản chia thành nhiều loại theo đường kính (id): narrowbore (ống hẹp), wide-bore (ống rộng),… Đường kính id: phổ biến loại 0.25mm Đối với kỹ thuật GC-MS thường ưu tiên dùng id nhỏ (0.1-0.2mm) kết hợp tiêm chia dòng Độ dày film df: phổ biến từ 0.1-0.25µm phù hợp cho phân tích chất có nhiệt độ sôi>300 hàm lượng vết thuốc BVTV, PCB, FAME, phthalate ester, df từ 1-5µm phù hợp cho phân tích chất dễ bay VOC, khí Chiều dài cột L: phổ biến 30m vừa đủ đạt độ phân giải cần thiết, thời gian phân tích nhanh Nếu mẫu có nhiều thành phần phức tạp, sử dụng cột dài 60m Hai cột sau có hiệu nhau: 30m x 0.53mm x 0.50μm 30m x 0.25mm x 0.25μm Hiệu phân tách cột tỷ lệ thuận với chiều dài, tỷ lệ nghịch với đường kính Cấu tạo id L dp df Cột nhồi (GC) Thủy tinh không rỉ – mm vài cm – vài m 90 - 250 µm Cột mao quản (GC) thép Silica nung chảy (polyamid phủ mặt ngoài) 0.18 – 0.53 mm 10 – 100 m 0.1 – µm Sắc ký HPLC chủ yếu loại cột nhồi : + chiều dài 10-30cm HPLC, 3-5cm HPLC-MS + id~4-5mm (2-3 mm HPLC-MS tốc độ dòng cho đầu dò MS nhỏ nên phải dùng cột có id nhỏ) + cỡ hạt 5µm HPLC, 7-12µm IC, SEC Việc phân loại theo id HPLC khác với GC Loại cột mao quản cho HPLC (id10mm dùng để tinh hỗn hợp sắc ký điều chế; Cột có id 4.6mm loại thường sử dụng hai máy HPLC, IC Cột có id từ - 2mm thường dùng ứng dụng cần độ nhạy cao Cột có id 2µm, khí UHPLC >2µm Sự khác biệt chủ yếu HPLC UHPLC nằm chỗ UHPLC có nhiều ưu điểm so với HPLC Nhờ áp suất vận hành cao hơn, UHPLC giảm thời gian phân tích mẫu vài phút, giảm chi phí dung mơi tới 90% tín hiệu detector chất phân tích cao Bên cạnh kỹ thuật UHPLC tăng độ chọn lọc, độ nhạy, độ lặp lại độ tái lập, nên kết phân tích đáng tin cậy UHPLC đặc biệt thích hợp, phát huy ưu điểm kèm với đầu dò MS Trong HPLC khoảng 15 - 20 phút kết tách, UHPLC cần – 10 phút Nhờ UHPLC có suất phân tích, tiết kiệm dung môi tốt HPLC phí đầu tư ban đầu cao lâu dài lượng mẫu lớn tối ưu chi phí Các điểm khác HPLC UHPLC khơng dừng lại đó, nhiên điều quan trọng ta cần phải hiểu sâu hai kỹ thuật trước tiếp tục phân tích khác biệt HPLC sử dụng rộng rãi cho định lượng, định tính tách nhiều thành phần hỗn hợp HPLC đặc biệt sử dụng phân tích dược phẩm, thuốc trừ sâu nhiều chất khác HPLC id (mm) 4–5 df (µm) 4–5 L (cm) – 25 HPLC-MS 2–3 UHPLC 2–3 – 10 – 10 Trên thực tế, UHPLC cơng nghệ đăng kí nhãn hiệu thương mại Waters, nhiên dùng thuật ngữ chung để mô tả kỹ thuật Áp suất bơm cực mạnh yếu tố quan trọng hệ thống UHPLC vận hành hiệu Nói tóm lại, khác biệt HPLC UHPLC minh họa rõ ràng cho tốt cũ mặt Tuy nhiên , bất chấp ưu việt UHPLC, HPLC kĩ thuật sử dụng phổ biến phòng thí nghiệm SẮC KÍ ION (IC) Ion-exchange chromatography hay ion chromatography dùng cho phân tích anion, cation hợp chất mang điện tích amino acid, peptide, protein Pha tĩnh pha động phân cực Chia làm loại: - Sắc ký trao đổi ion (ion exchange): Tương tác chất cần phân tách pha tĩnh ion dấu Sắc ký đuổi ion (ion excusion) Sắc ký ghép cặp ion (ion pair): Tương tác chất cần phân tách pha tĩnh ion trái dấu a Pha tĩnh: nhựa trao đổi ion, công thức hoá học gồm phần: + Nền: Polystyren-divinylbenzen (DS-PVB), Polymethacrylat (MMA) -> phân cực -> hấp phụ Các polyme hữu kể có ưu điểm sử dụng môi trường pH khác nhau, sử dụng rộng rãi Do silica gel bền pH=2-7 eluent hệ anionit có pH kiềm nên sử dụng hệ cationit + Nhóm tạo khơng gian: alkyl + Nhóm chức có khả tương tác tĩnh điện với ion dung dịch Với cationit sulfonate -> cationit axit mạnh ->không ảnh hưởng pH, với cacboxylat sử dụng mơi trường pH cao Với anionit amin bậc trimethylamin (TMA), dimethylethanolamine (DMEA) -> anionit baz mạnh -> không ảnh hưởng pH b Pha động (eluent): Các ion dung dịch cạnh tranh với ion eluent vị trí nhóm chức trao đổi ion nói Cần xem xét, lựa chọn pha động nhiều khí cạnh: nồng độ, pH, đệm (ảnh hưởng đến lực rửa giải), độ dẫn, vùng hấp thu (ảnh hưởng đến việc phát đầu dò) Khái niệm eluent - dung dịch rửa giải dung mơi pha động có chứa chất phân tích sau khỏi cột + Pha động cho anion không dùng suppressor: nhân thơm gắn nhóm cacboxilic phthalic acid, salicyclic acid, p-hydroxybenzoic acid, borat/gluconat Pha động cho anion có suppressor: HCO3/CO3, KOH, NaOH, borat + Pha động cho cation: HNO3, HCl, MSA Các cation hoá trị II lực mạnh với pha tĩnh, axit HNO3 khơng thể rửa giải nên phải pha thêm baz hữu ethylendiamin (EDTA): nguyên tử N nhóm amino có lực mạnh với proton, tương đương cation hoá trị II (HOOC-CH)2-NH⊕ -CH2-CH2-NH⊕ (CH2COOH)2 Với máy đời cón có EGC (Eluent Genarator Cartridge) sử dụng catridge mua sẵn điện phân nước cất để tạo pha động nồng độ xác: + Hệ EGC tạo KOH + Hệ EGC tạo NaOH + Hệ EGC tạo LiOH + Hệ EGC tạo K2CO3 + Hệ EGC tạo methanesulfonic acid (MSA) Ngoài phía sau phận bẫy anion CR-ATC (Continuously Regenerated Anion Trap Column) CR-CTC cho cation, loại bỏ ion tạp chất c Bộ triệt (suppressor): Là phận nằm cột tách detectơ độ dẫn, có nhiệm vụ lảm giảm độ dẫn ion pha động, nhờ tăng khả phát ion phân tích * Suppressor hố học cho hệ anion: giống cationit Na+ tất cation bị thay H + H+ trung hồ OH- HCO3- pha động, anion Cl- giữ nguyên Cationit cần phải hoạt hoá lại (tái sinh, regenerate), rửa nước cất trước chạy mẫu Suppress trao đổi cation Rửa nước cất Hoạt hóa H 2SO4 Khi dùng hệ supressor : tín hiệu lớn - lần, đường chuẩn khơng tuyến tính bậc mà theo dạng đường cong bậc hai Hạn chế nhỏ kỹ thuật suppressor anion axit yếu axetat, florua, bị proton hố có độ dẫn giảm đi, khó xác định, việc lựa chọn pha động bị giới hạn gồm: KOH, NaOH, HCO3/CO3, B4O7, amionoacid * Với supressor hệ không cần dùng H 2SO4 mà dùng phương pháp điện hoá (electronic): H+ sinh anod nhờ phản ứng điện phân nước Phương pháp có ưu điểm khơng tốn H2SO4, đường chuẩn tuyến tính bậc Vd: Hệ pha động mmol/L phthalic acid, 2% acetontril, pH=4,1 (cho TRIS chỉnh pH) có độ dẫn khoảng 400 µS/cm Hệ pha động dùng suppressor (50 mmol/L H2SO4) 2,4 mmol/L NaHCO3, 2,5 mmol/L Na2CO3, 2% aceton có độ dẫn sau suppressor 16 µS/cm d Đầu dò (detector) thơng dụng đầu dò độ dẫn dùng diện tích pic để định lượng, trừ trường hợp pic có kéo dài hay chồng lấn phải dùng chiều cao pic + Định tính: Thứ tự rửa giải cation Li,Na,K,Rb,Cs, Mg,Ca,Sr,Ba Thứ tự rửa giải anion F,HCO3,Cl,NO2,Br,NO3, HPO4,SO4 Thời gian để rửa giải hết anion 15 phút, cation 10 phút + Định lượng: Tín hiệu đo tổng ion pha động ion phân tích, nồng độ ion pha động lớn gấp nhiều lần F- Cl- NO2- Br- NO3- HPO42- Injector Column SO42- Water-Dip Suppressor-Einlauf Eluent Pump Suppressor Detector Pump Head: bơm đưa eluent vào hệ thống Pressure Transducer: đo áp suất Injection Valve: nạp mẫu từ loop vào hệ thống qua cột Detector Column Suppressor port valve Dual piston pump Purge valve Peristaltic pump (for Suppressor) Lưu ý : - Cần bật máy trước 2-3 để detector cột tách cột bảo vệ ổn định tới nhiệt độ cài đặt (tối thiểu lớn - 7oC so với nhiệt độ khơng khí, thơng thường 35oC) - Các hạt rắn chất hữu (như dầu khoáng, chất tẩy rửa axit humic) làm giảm tuổi thọ cột tách cần tách trước lọc pre-filter cột bảo vệ guard column (dạng pre-column catridge (lõi thay được) dạng precolumn (cột đóng sẵn cột tách) - Khoảng làm việc bị giới hạn dung lượng trao đổi cột Khi nồng độ cao, cột bị tải với biểu hiện: pic dạng đuôi cá, xén ngang đỉnh, pic bất đối xứng, chồng lấn pic phía sau - Chênh lệch nồng độ lớn anion Cl dẫn tới cản trở qua lại lẫn chúng tách không đủ - pH pha động định dạng PO4 chiếm ưu thế, làm thay đổi độ dẫn (chiều cao pic) thời gian lưu H 2PO4- có độ dẫn tương đương Λµ = 33 S.cm2/moltrong HPO42- có độ dẫn tương đương Λµ = 57 S.cm2/mol - Khi pH tăng, lực rửa giải OH - CO32- nên thời gian lưu anion ngắn - Nồng độ pha động làm thay đổi lực rửa giải, thời gian lưu, đặc biệt ion hố trị II SO42- - Nếu khơng dùng tuần, phải tháo cột tách rửa toàn hệ thống hỗn hợp H2O:methanol (1:4) Bảo quản cột pha động 15 – 35 oC, không lạnh, không bảo quản nước hay methanol - Đầu dò UV dùng với ion: F, NO2, NO3 - Đầu dò VA (amperometric): carbonhydrat, alcohol, sugar alcohol Hệ thống RFIC Reagent Free Ion Chromatography hãng Thermo Dionex khơng cần mua, pha hóa chất gồm EG (sinh pha động), SRS (triệt nền) có thêm ER (eluent regeneration - tái sinh pha động trở lại cho EG) Kích thước (mm) Cỡ hạt Hiệu (Số đĩa) Thể tích loop Áp suất tối đa (Mpa) Tốc độ dòng (mL/ph) Cột thường Anion 4,6 x 50 10 µm 800 100 µL 6,7 1,2 Cột thường Cation 4,6 x 50 10 µm 1.100 100 µL 6,7 1,2 Cột Anion dung lượng cao (high capcity HC) Cột Anion phân giải cao (high resolution HR) 4,6 x 150 10 µm 1.500 100 µL 13 2,0 4,6 x 75 µm 2.500 100 µL 20 1,2 KIT ELISA: Đối tượng phân tích: dư lượng kháng sinh, độc tố, BVTV: Chloramphenicol, Trifluralin, Melamine, Histamin,… Ưu điểm: - Nhanh - Thao tác đơn giản, dễ thực - Khơng đòi hỏi thiết bị đắt tiền - Không cần nhân viên chuyên môn cao Enrofloxacin, - Chi phí kiểm mẫu thấp kiểm đồng thời số lượng mẫu lớn Một kit phân tích 50-80 mẫu Nhựợc điểm: - Là sinh phẩm nên số hoá chất phải bảo quản lạnh có hạn sử dụng định - Có độ xác khơng cao phương pháp hoá lý phương pháp sắc ký Do thích hợp với phân tính sàng lọc phân tích định lượng ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE) Nguyên lý: Tách chất dung dịch lỏng dựa di chuyển khác phân tử chất (mang điện tích) cột mao quản ảnh hưởng điện trường tạo điện áp cao (15 – 30 kV) đặt vào hai đầu mao quản (xem hình 1) Một hệ thiết bị CE bao gồm phận sau: • Mao quản tách: thường làm vật liệu silic (gọi mao quản silica, loại mao quản phổ biến nhất), teflon, PEEK, với đường kính ngồi (OD) 365 μm, đường kính (ID) từ 10 đến 150 μm (phổ biến 50 μm) Tổng chiều dài mao quản từ 10 đến 100 cm (thường 60 cm) Chiều dài hiệu dụng (là chiều dài tính từ đầu bơm mẫu mao quản đến vị trí đặt detector) thường dao động từ 25 – 50 cm mao quản dài 60 cm Trong trình điện di, mao quản nạp đầy dung dịch đệm điện di • Dung dịch đệm điện di: dùng để tạo mơi trường cho q trình điện di xảy áp cao vào hai đầu mao quản Trong trình điện di, hai đầu mao quản được đặt hai bình chứa dung dịch đệm điện di Lưu ý: Hai lọ đựng dung dịch đệm hai đầu mao quản phải độ cao ngang • Nguồn điện cao: thường dao động từ đến 30 kV, dùng để áp vào hai đầu mao quản nhằm sinh điện trường lớn cho trình điện di xảy Để phân tích cation cực áp cực dương vào đầu bơm mẫu mao quản ngược lại để phân tích anion áp cực âm vào đầu bơm mẫu mao quản • Detector (cảm biến): hấp thụ phân tử (UV-Vis), huỳnh quang phân tử, phát xạ hấp thụ nguyên tử, khối phổ, đo dòng, đo đo độ dẫn • Bộ phận điều khiển: máy tính sử dụng phần mềm chuyên dụng So sánh với sắc ký lỏng cao áp (HPLC) - Khả phân tách chất CE thường tốt HPLC - Lượng dung môi mẫu dùng cho CE không đáng kể so với HPLC Các hoá chất dùng làm pha động CE thông dụng giá thành thấp so với dung môi dùng HPLC - Nguyên lý vận hành đơn giản so sới HPLC - Linh kiện thay CE (linh kiện điện tử) rẻ tự chế tạo Việt Nam, linh kiện HPLC (linh kiện khí xác chịu áp) thường đắt phải nhập ngoại - CE phát triển thành thiết bị phân tích xách tay trường - Giá thành đầu tư thiết bị, vận hành giá thành cho lần phân tích CE thấp hẳn so với HPLC - Độ nhạy (với detector đo quang) CE so với HPLC Với cảm biến đo độ dẫn không tiếp xúc, độ nhậy tương đương CE HPLC - Với CE, thời gian di chuyển chất cần phân tích (thơng số định tính) sử dụng mao quản silica nhiều trường hợp không ổn định, thường phải sử dụng thêm chất nội chuẩn - CE sử dụng để phân tích chất khơng mang điện, HPLC Ứng dụng: Kỹ thuật chủ yếu sử dụng phân tích đại phân tử (protein, polysaccarid, vật liệu di truyền ) sinh hóa, lâm sàng lĩnh vực liên quan - Phân tích dược phẩm dược liệu: β-lactam, Sunfonamides, Taxol, Cimetidine, Salicylic acid, Acetaminophene salicilyic acid - Phân tích thực phẩm: Đường: glucose, fructose, maltose; Chất bảo quản: Dulcin, sorbic acid, benzoic acid; Chất chống oxi hóa: PG, TBHQ, BHA, BHT; Các chất màu thực phẩm: Green S, Briliant blue, Erythrosine B, Sunset yellow, Tatrazine; Đường hóa học: Saccharin, acesultamine-K, aspartame - Nghiên cứu sinh học phân tử: tách protein có khối lượng phân tử lớn, phân đoạn DNA, nucleotid, peptide, polymer ... 10-30cm HPLC, 3-5cm HPLC-MS + id~4-5mm (2-3 mm HPLC-MS tốc độ dòng cho đầu dò MS nhỏ nên phải dùng cột có id nhỏ) + cỡ hạt 5µm HPLC, 7-12µm IC, SEC Việc phân loại theo id HPLC khác với GC Loại... df Cột nhồi (GC) Thủy tinh không rỉ – mm vài cm – vài m 90 - 250 µm Cột mao quản (GC) thép Silica nung chảy (polyamid phủ mặt ngoài) 0.18 – 0.53 mm 10 – 100 m 0.1 – µm Sắc ký HPLC chủ yếu loại... Nếu K’ lớn pic bị dỗng Trong thực tế K’ từ 1- tối ưu * Độ chọn lọc α (selectivity): α = K’1/ K’2 * Số đĩa lý thuyết (theoretical plate) hay đánh giá hiệu cột qua giá trị bề rộng pic, độ nhọn