Chương 2: Sắc ký khí

SẮC KÝ KHÍ Một chất tan có khả năng hóa hơi kém có thể được lưu giữa trong cột và tiếp tục rửa giải trong suốt quá trình phân tích các mẫu tiếp sau.. Chuẩn Chuẩn bị mẫu hóa hơi Cần thiế

Trang 1

NỘI DUNG

CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ

SẮC KÝ LỎNG HiỆU NĂNG CAO -HPLC

SẮC KÝ KHÍ - GC

Trang 3

Mobile phase Stationary phase

Mobile phase

CHƯƠNG 2 SẮC KÝ KHÍ

Trang 4

Cơ chế tách trong sắc ký khí

SẮC KÝ ĐỒ DẦU BẠC HÀ

1 α-Pinene 2 β-Pinene 3 Sabinene 4 Myrcene 5 Α- Terpinene 6

I-Limonene 7 1,8 – Cineole 8 Cis – Ocimene 9 Γ- Terpinene 10

Para-Cymene 11 Terpinene 10 para – Para-Cymene.11 Terpinolene 12

3-Octanol.13I-Octen-3-ol 14 Trans Sabinene hydrae 15 I-.Menthone 16

Menthonfuran 17d- Isomenthone 18 β- Bourbonene 19 Linalool 20

Trang 5

2.2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÁY

SẮC KÝ KHÍ

2.2.1 Pha động 2.2.2 Cột 2.2.3 Hệ tiêm mẫu 2.2.4 Chương trình nhiệt độ cột 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí

2.2.1 Pha động (khí mang) Nhiệm vụ

-Cung cấp nền mẫu phù hợp với đầu dò để đo

các thành phần mẫu

- Đưa mẫu đi qua cột

Độ tinh khiết: cao

Tốc độ

- Cột nhồi : 25-150ml/ phút

Trang 7

Typical example of a packed column for gas chromatography This

column is made from stainless steel and is 2 m long with an internal

diameter of 3.2 mm The packing material in this column has a particle

diameter of 149–177 µm

Cột mao quản

2.2.2 Cột

Cột mao quản sắc ký khí Chiều dài 30m, đường kính trong

247µm Bề mặt trong của cột mao quản được phủ một lớp pha

lỏng 0,25 µm

Trang 8

PLOT (porous-layer opentubularcolumn) chứa một lớp xốp chất hấpphụ rắn

SCOT (support - coated open tubularcolumn ) chứa một lớp hấp phụ làchất rắn (ví dụ như Celite) được phủbằng một pha lỏng

Ưu : số đĩa lý thuyết /m nhiều

hơn và cột dài hơn

Nhược : chỉ tiêm vào một thể tích

mẫu nhỏ, ít hơn 10-2µl do đường

kính bé hơn, lớp phim mỏng

Pha tĩnh cho GLC

2.2.2 Cột

Trang 9

hệ thống không được làm giảm chất lượngquátrình tách

Một chất tan có khả năng hóa hơi kém có thể được lưu giữa trong

cột và tiếp tục rửa giải trong suốt quá trình phân tích các mẫu tiếp

sau

Một chất khó hóa hơi sẽ ngưng tụ ở đầu cột, làm giảm hiệu năng

cột

2.2.3 Hệ tiêm mẫu

Điều kiện mẫu tiêm vào :

Các thành phần của mẫu phải được hóa hơi

Chuẩn Chuẩn bị mẫu hóa hơi

Cần thiết tách các chất phân tích dễ bay hơi của một

mẫu ra khỏi những thành phần không bay hơi

Trang 10

Vi chiết pha rắn

Purge-and trap (Sục và bẫy khí)

Chuyển đổi hóa học thành chất hóa hơi

Trang 12

Kỹ thuật chiết

Chuẩn Chuẩn bị mẫu hóa hơi

Môt sợi silica nung chảy (fused-silica) được đặt bên trong một kim tiêm Sợi này được phủ một lớp phim mỏng chất hấp phụ, như là polydimethyl siloxane Sợi được hạ xuống vào mẫu bằng cách ấn một pít tông và được tiếp xúc với các mẫu trong một thời gian định trước Sau khi rút sợi vào trong kim, nó được chuyển vào sắc ký khí để phân tích

Vi chiết pha rắn (SPME)(solid-phase microextraction

2.2.3 Hệ tiêm mẫu Chuẩn Chuẩn bị mẫu hóa hơi

(Sục và bẫy khí) Purge-and trap (Sục và bẫy khí)

Trang 13

Kỹ thuật chiết Headspace sampling

Headspace

Trang 14

Ưu điểm của phương pháp

• Thiết bị tương đối đơn giản Với headspace tĩnh, người sử dụng có

thể tự làm thí nghiệm.

• Có thể bơm tiếp lần 2, lần 3…

• Mẫu vào trong cột tương đối sạch, giảm công chuẩn bị mẫu.

• Có thể áp dụng cho những mẫu có nền mẫu phức tạp, thậm chí là

mẫu chất lỏng đặc, mẫu rắn,

Nhược điểm:

• Chỉ phân tích được những cấu tử nhẹ,

• Môi trường mẫu phải có độ bay hơi kém hơn chất phân tích

27

Kỹ thuật headspace tĩnh

Trang 15

Headspace

Ưu điểm của phương pháp

• Thiết bị tương đối đơn giản Với headspace tĩnh, người sử dụng có thể tự

làm thí nghiệm.

• Có thể bơm tiếp lần 2, lần 3…

• Mẫu vào trong cột tương đối sạch, giảm công chuẩn bị mẫu.

• Có thể áp dụng cho những mẫu có nền mẫu phức tạp, thậm chí là mẫu

chất lỏng đặc, mẫu rắn,

Nhược điểm:

• Chỉ phân tích được những cấu tử nhẹ,

• Môi trường mẫu phải có độ bay hơi kém hơn chất phân tích

Trang 16

Kỹ thuật bơm mẫu headspace dùng

syringe kín khí

31

Kỹ thuật headspace động học (P&T)

Trang 17

Nhằm phóng thích chất bay hơi ra khỏi chất rắn

Phân hủy nhiệt

Chuyển đổi hóa học thành chất hóa hơi

Chất cần phân tích phản ứng với thuốc thử để tạo thành chất

phân tích quá nhỏ

nồng độ chất phân tích quá nhỏ

không đủ có tín hiệu phù hợp

phải làm giàu mẫu trước khi tiêm vào

GC

Trang 18

Điều chỉnh nồng độ chất phân tích [2]

nồng độ chất phân tích quá lớn

quá tải cột, dẫn đến peak

đổ đầu và tách kém

Tiêm lượng mẫu ít hơn

nồng độ chất phân tích có thể vượt quá đáp ứng tuyến tính của đầu dò

pha loãng mẫu với dung môi dễ bay hơi như methylene chloride

Tiêm mẫu

Tiêm vào cột nhồi

Tiêm vào cột mao quản

Trang 19

Tiêm vào cột nhồi

2.2.3 Hệ tiêm mẫu Tiêm mẫu

Trang 20

Tiêm chia dòng (split injection) : Mẫu được tiêm qua một septum cao su bằng kim tiêm sắc ký khí Thay vì tiêm mẫu trực tiếp vào cột, mẫu được tiêm vào liner thủy tinh, trong đó mẫu được trộn lẫn với khí mang Ở chế độ chia dòng, một tỷ lệ nhỏ khí mang và mẫu đi vào cột mao quản và phần còn lại thoát ra ngoài theo van chia dòng Bằng cách kiểm soát tốc độ dòng khí mang đi vào

bộ tiêm mẫu, đi qua van làm sạch septum và van ra ngoài, có thể kiểm soát tỷ lệ mẫu đi vào cột mao quản, thường thường tỷ lệ là 0,1 -10%

Thể tích hơi của 1 μl dung môi ở

nhiệt độ 220 ºC

Lựa chọn liner sao cho thể tích hơi không vượt quá 75%

thể tích liner tránh tình trạng thổi ngược mẫu (backflush)

Trang 21

Lựa chọn liner

Trang 22

Phần mềm tính toán thể tích hơi dung môi

43

Thường sử dụng cho phân tích lượng vết, vanchia dòng được đóng lại và để khí mang đi qualiner thủy tinh để vào cột Điều này cho phéphầu như toàn bộ mẫu đi vào cột

Tiêm không chia dòng

Trang 23

Tiêm vào đầu cột (on-column injection) : Áp dụng cho các mẫu dễ bị

phân hủy Mẫu được tiêm trực tiếp vào cột mà không gia nhiệt Sau đó

tăng nhiệt độ cột, hóa hơi mẫu ở nhiệt độ thấp nhất có thể

Các đặc điểm của buồng bơm mẫu

On-Column

Các đặc điểm của buồng bơm mẫu

On-Column

Ưu điểm:

• Loại bỏ hoàn toàn hiện tượng phân biệt đối xử

• Loại bỏ sự biến đổi mẫu trong Inlet (nhiệt độ thấp)

• Có thể tạo hiệu ứng dung môi cho cả những cấu tử rửa giải sớm

• Có độ chính xác phân tích cao

Nhược điểm

• Không đưa được thể tích mẫu lớn vào trong cột

• Những cấu tử rửa giải trước dung môi không có hiệu ứng hội tụ

Trang 24

2.2.4 Chương trình nhiệt độ cột

Kiểm soát nhiệt độ cột có tính quyết định để đạt được quá trình tách tốt

trong sắc ký khí Vì nguyên nhân này mà cột phải được đặt trong lò cột

Tách đẳng nhiệt: Duy trì cột ở nhiệt độ cố định

+ Đáp ứng tuyến tính trên một khoảng nồng độ chất phân tích

rộng để việc định lượng dễ dàng hơn

+ Nhạy với tất cả các chất phân tích hoặc chọn lọc với một loại

đặc biệt chất phân tích

+ Không bị ảnh hưởng khi thay đổi tốc độ dòng và nhiệt độ

Trang 25

2.2.5 Đầu dò sắc ký khí

Đầu dò dẫn nhiệt TCD ( thermal conductivity detector)

Sử dụng rộng rãi, đặc biệt cho cột nhồi và chất phân tích vô cơ

như H2O, CO, CO2 và H2

Nguyên tắc : TCD đo sự dẫn nhiệt của chất phân tích trong khí mang và

so sánh với độ dẫn nhiệt của khí mang tinh khiết

Trang 27

Đầu dò dẫn nhiệt TCD ( thermal conductivity detector)

Ưu điểm:

+ Bởi vì tất cả các chất phân tích đều ảnh hưởng đến độ dẫn nhiệt

của pha động, nên đầu dò TCD là đầu dò phổ quát,

+ Khoảng đáp ứng tuyến tính rộng

+ Không phân hủy chất phân tích

Nhược điểm : độ nhạy thấp với hầu hết chất phân tích

Độ dẫn nhiệt của các loại khí khác nhau tương đối

so với khí Helium

Trang 28

Các lưu ý khi sử dụng detector TCD

• Nhiệt độ detector càng cao, độ nhạy càng giảm -> cần duy trì nhiệt

độ thấp nhất, nhưng vẫn đảm bảo mẫu không bị ngưng tụ

• Sự thay đổi nhiệt độ ảnh hưởng mạnh đến kết quả đo

• Filament chỉ bật khi có khí

• Độ nhậy tỷ lệ nghịch với dòng khí mang + Ref (detector nhậy nồng

độ)

• Khí ô xy, các acid, halogenated làm giảm tuổi thọ của filament

• Tránh luyện cột khi đang nối vào detector

• Khi mới khởi động máy GC, tăng nhiệt độ của detector trước khi

tăng nhiệt độ lò

• Khi tháo cột, nhất thiết phải tắt detector và chờ nguội

• Nếu đầu thoát của TCD được nối dài, phải chú ý tránh bị tắc

Đầu dò ion hóa ngọn lửa FID (flame ionization detector)

Nguyên tắc : Đốt cháy một hợp chất hữu cơ trong ngọn lửa air / H2sẽ

tạo ra ngọn lửa chứa e và các cation hữu cơ như CHO+ Áp một điện thế

chừng 300 volt qua ngọn lửa tạo ra một dòng nhỏ chừng 10–9 to 10–12

amps Khuếch đại tín hiệu, dòng điện này sẽ cho một tín hiệu phân tích

Trang 29

Đầu dò ion hóa ngọn lửa FID (flame ionization detector)

Ưu điểm

+ Hầu hết các nguyên tử Cacbon, ngoại trừ C trong nhóm carbonyl và

carboxylic, đều tạo ra tín hiệu, nên đầu dò FID là đầu dò phổ biến đối

với hợp chất hữu cơ

+ Hầu hết các chất vô cơ và nhiều khí như H2O; CO2 đều không phát

hiện được với đầu dò FID nên FID là đầu dò hữu hiệu khi phân tích các

mẫu môi trường khí và nước

+ Rất nhạy, Giới hạn phát hiện nhỏ 10-11g ( 50ppb) và đáp ứng tuyến

+ Tín hiệu của detector sẽ bị ảnh hưởng bởi các dị nguyên tố như O, S

và halogen có mặt trong hydrocacbon

Trang 30

Đầu dò bắt điện tử (electron capture detector (ECD)

Khi chất tan có độ âm điện cao rửa giải khỏi cột, nó sẽ bắt các e và dòng

sẽ giảm, sinh ra tín hiệu

Đầu dò bắt điện tử (electron capture detector (ECD)

Ưu và nhược điểm

- ECD chọn lọc với các chất tancó nhóm chức có độ âm điện cao, như là

halogien và nhóm nitro, và cũng tương đối nhạy đối với amines,

alcohols, and hydrocarbons

- giới hạn phát hiện xuất sắc,

- Khoảng tuyến tính của đầu dò ECD không rộng, its linear range

extends over only about two orders of magnitude

Trang 31

Phổ khối lượng

Một máy phổ khối là một thiết bị ion hóa các phân tử khí, và phân mảnh

chúng thành các ion nhỏ hơn Bởi vì các ion này có tỷ lệ khối lượng/

điện tích khác nhau nên có thể tách chúng ra khỏi nhau bằng điện trường

hoặc từ trường Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được thể hiện bằng

một số vạch (peak) có cường độ khác nhau tập hợp thành một đồ thị gọi

là phổ khối Phổ khối chứa các thông tin định tính và định lượng về chất

phân tích

Phổ khối của toluen Ion phân tử đánh dấu màu xanh lục (m/z= 92), và 2

ion mảnh là xanh dương (m/z= 91) và đỏ (m/z= 65) Chiều cao của bất

kỳ peak nào trong phổ khối cũng tỷ lệ với lượng toluen trong máy quang

Trang 32

Một đầu dò đếm ion và thể hiện phổ khối.

Sơ đồ khối của một thiết bị sắc ký khí kết nối khối phổ (GC–MS)

Phương pháp phổ biến nhất là quét liên tục toàn bộ phổ khối và báo cáo

tín hiệu tổng đối với tất cả ion đến được detector trong mỗi lần quét

Việc quét cung cấp sự phát hiện cho tất cả các chất phân tích

một số chọn lựa để tạo ra một sắc ký đồ khi sử dụng máy phổ khối như

một đầu dò:

Có thể đạt được một mức độ chọn lọc bằng cách kiểm soát chỉ một số tỷ

lệ m/z đặc trưng Quá trình này được gọi là kiểm soát ion chọn lọc

Trang 33

+ Giới hạn phát hiện xuất sắc, 25fg đến 100pg, (1 femtogram = 0.001

picogram, 1pg=10-12 g) với khoảng tuyến tính 105 orders of magnitude

+ Bởi vì phổ khối của chất rửa giải của cột được ghi liên tục, nên có thể

kiểm tra phổ khối của bất kỳ thời điểm Đây là một ưu điểm đặc biệt của

- So sánh thời gian lưu tR của chất phân tích với tR của chất chuẩn đối

chiếu trong điều kiện sắc ký

- So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu phân tích

đã cho thêm vào chuẩn đối chiếu Peak ứng với chất cho thêm vào sẽ

có chiều cao peak tăng lên

Xác định thành phần của một hổn hợp bằng sắc ký

- Dựa và thời gian lưu của các chất được tách ra bằng sắc ký khí để định

tính thường không cho kết quả tin cậy Để có kết quả chính xác hơn cần

phải kết nối máy sắc ký khí với máy quang phổ hồng ngoại hoắc khối

phổ Dựa vào thư viện phổ lưu ở máy IR hoặc MS để so sánh nhận diện

chất phân tích

Trang 34

Diện tích peak được xác định bằng tay hoặc tự động bằng phần mềm

2.3.2.1 Chuẩn hóa diện tích

2.3.2.2 Chuẩn hóa diện tích với hệ số đáp ứng

2.3.2.1 Chuẩn hóa diện tích

Chuẩn hóa diện tích là một phép tính % với giả định rằng % diện tích

peak bằng với % khối lượng

Hàm lượng % X của một chất phân tích cũng là % Diện tích X

% 𝐷𝑖ệ𝑛 𝑡í𝑐ℎ 𝑋 = [ 𝐴

∑ 𝐴 ] × 100

Trang 35

Khi tiêm vào máy sắc ký các mẫu chưa biết, mỗi diện tích peak

được đo và nhân hệ số của nó Sau đó, tỷ lệ phần trăm được tính

Trang 36

Dựng một dãy chuẩn, tiêm vào máy sắc ký có các diện tích peak Si tương

ứng với nồng độ Ci của chất phân tích trong mẫu thứ i Thiết lập mối

tương quan S=f(Ci) bằng phương trình hồi quy tuyến tính Thực hiện

tương tự trên mẫu , có tín hiệu Sx Thế giá trị Sx vào phương trình hồi

quy Cx

2.3 ỨNG DỤNG

2.3.2 Định lượng

2.3.2.4 Kỹ thuật nội chuẩn

Nội chuẩn một chuẩn

cho vào mẫu và chuẩn một chất chuẩn khác, chất chuẩn này được gọi là

nội chuẩn

tỷ lệ giữa tín hiệu của chất phân tích và tín hiệu nội chuẩn sẽ không bị

ảnh hưởng khi có bất kỳ sai số nào trong quá trình (ví dụ như định mức

không chính xác, hay số ml mẫu lấy không lặp lại)

Trang 37

Cx

2.3 ỨNG DỤNG

Yêu cầu của nội chuẩn

- Được rửa giải ở gần các peak của các chất phân tích

- Phân giải tốt với các peak của chất phân tích

- Tương tự về mặt hoá học với chất phân tích, nhưng không phải

chất phân tích và không phản ứng với bất kỳ thành phần nào trong nền

mẫu

- Giống như chuẩn, phải có độ tinh khiết cao

- Nội chuẩn được thêm vào mẫu với nồng độ tương tự nồng độ

chất phân tích và trước lúc tạo dẫn xuất hoá học cũng như trước các

phản ứng, cũng có trường hợp thêm nội chuẩn vào trước khi đo mẫu

Trang 38

2.3 ỨNG DỤNG 2.3.2 Định lượng

2.3.2.4 Kỹ thuật thêm chuẩn So sánh thêm chuẩn

𝐶 ×𝑉𝑉

𝑉𝑉

phân tích

Định dạng
Số trang	38
Dung lượng	3,36 MB