ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH

Mục đích nghiên cứu Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định nguồn gốc, mối quan hệ di truyền của các giống/loài Sâm Lai Châu, phân biệt Sâm Lai Châu với với loài khác cù

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -

KHƯƠNG THỊ BÍCH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG

MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

HÀ NỘI - 2018

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-*** -

KHƯƠNG THỊ BÍCH

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ XÁC ĐỊNH MARKER PHÂN TỬ ĐẶC TRƯNG NHẬN DẠNG

MỘT SỐ MẪU SÂM LAI CHÂU

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mãsố: 8420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS KHUẤT HỮU TRUNG

HÀ NỘI - 2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận văn này là kết quả nghiên cứu của cá nhân

tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS.Khuất Hữu Trung Các số liệu và tài liệu

được trích dẫn trong luận văn là trung thực.Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ công trình nào đã được công bố trước đó

Tôi xin chịu trách nhiệm với lời cam đoan của mình

Hà Nội, tháng năm 2018

Tác giả

Khương Thị Bích

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Viện Di truyền Nông nghiêp, các thầy giáo, cô giáo đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi được học tập và hoàn thành khóa học này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Phó giáo sư - Tiến sĩ Khuất Hữu Trung - Phó viện trưởng - Viện Di truyền Nông nghiệp, người đã tận

tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi hoàn thành luận văn: “Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu Sâm Lai Châu.”

Tôi xin được cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Kĩ thuật Di truyền - Viện

Di truyền Nông nghiệp luôn động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi về

cơ sở vật chất - trang thiết bị để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới gia đình, đặc biệt là bố mẹtôi, những người luôn bên cạnh và hỗ trợ tôi về mọi mặt để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm vụ học tập của mình Nhân dịp này tôi cũng trân trọng cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp những người đã luôn bên cạnh, động viên, góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng năm 2018

Tác giả

Khương Thị Bích

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH ẢNH vii

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

PHẦN II: NỘI DUNG 4

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam 4

1.1.1 Tên gọi, phân loại và hình thái 4

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố 11

1.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế 14

1.1.4 Các thành phần hoạt chất ở chi Panax 16

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm 19

1.3 Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm 21

1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật 22

1.4.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái 22

1.4.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử 23

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.1 Vật liệu 30

2.2 Hóa chất 31

2.3 Phương pháp nghiên cứu 31

2.3.1 Tách chiết ADN tổng số 31

2.3.2 Chu trình PCR 32

2.3.3 Phương pháp điện di trên gel agarose 33

2.3.4 Phương pháp thôi gel theo kit Qiagen 34

2.3.5 Giải trình tự 34

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 35 3.2 Phân tích các sản phẩm khuếch đại của 25 mẫu nghiên cứu 36 3.3 Kết quả khảo sát trình tự vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2 ở các

mẫu nghiên cứu 36 3.4 Kết quả so sánh trình tự nucleotid vùng ITS1-5,8SrRNA-ITS2

của các mẫu nghiên cứu 40

3.5 Kết quả xây dựng cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên

cứu 45 3.6 Kết quả xác định Marker phân tử phân biệt 25 mẫu Sâm nghiên

cứu 51 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58 CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 PHỤ LỤC: TRÌNH TỰ 25 MẪU SÂM LAI CHÂU NGHIÊN CỨU 70

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism

cDNA Complementary deoxyribonucleic acid

CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide

DMSO Dimethyl sulfoxide(CH3)2SO

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxynucleoside triphosphates

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

EtBr Ethidium Bromide

ISSR Inter simple sequence repeat

ITS Internal Transcribed Spacer

PCR Polymerase chain reaction Phản ứng nhân theo chuỗi RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNA Ribonucleic acid

SCAR Sequence Characterised Amplification Regions

SSR Simple sequence repeats

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Danh sách 25 mẫu Sâm 30Bảng 2.2 Danh sách các mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu 31Bảng 3.1 Độ dài các trình tự thuộc 25 mẫu Sâm nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1 38

Bảng 3.2 Thành phần bốn loại nucleotide của 25 mẫu nghiên cứu và

mẫu tham chiếu KJ418192.1 39

Bảng 3.3 Hệ số tương đồng di truyền giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu

tham chiếu KJ418192.1 vào trình tự vùng

ITS1-5,8SrRNA-ITS2 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí của

các mồi ITS (Embong et al., 2008) 29

Hình 3.1: Ảnh điện di ADN tổng số của 25 mẫu Sâm nghiên cứu 35Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1/ITS8 trên

25 mẫu Sâm với thang chuẩn Marker 100bp và mẫu đối

chứng trắng (H2O) 36Hình 3.3: Một đoạn giản đồ có các đỉnh với 4 màu sắc khác nhau tương

ứng với 4 loại nucleotide của mẫu Sâm PT7 37Hình 3.4: Kết quả gióng hàng, gióng cột 25 trình tự ITS1-5,8SrRNA-

ITS2 của 25 mẫu Sâm và mẫu tham chiếu KJ418192.1 44

Hình 3.5 Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa 25 mẫu nghiên

cứu 47 Hình 3.6 Cây quan hệ phát sinh giữa 25 mẫu nghiên cứu và mẫu tham

chiếu KJ418192.1 48

PHẦN I: MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Tại các nước châu Á, Nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầu trong các loại thuốc quý đông y (sâm, nhung, quế và phụ) Nhân sâm có tác dụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tác dụng ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp hồi phục sức lực làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước những bất lợi của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục

số hồng cầu, bạch cầu bị giảm; tác dụng tăng nội tiết tố sinh dục; tác dụng kháng viêm; tác dụng điều hoà hoạt động của tim; tác dụng hạ cholesterol máu, chống xơ vữa động mạch; tác dụng giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) có tên gọi khác là

Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng; Tam thất đen Năm 2013, loài cây này đã được công bố phát hiện tại Lai Châu và đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân hàng Genbank Tính đến năm 2016 thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất ít trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã

Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bố rải rác

Sâm Lai Châu có tác dụng tương tự như Nhân sâm: củ và thân rễ dùng làm thuốc bổ; tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, chống xơ vữa động mạch, giảm đường huyết và có thể dùng làm thuốc trị viêm họng

Hiện nay, tại Việt Nam, Sâm Lai Châu còn lại rất ít trong tự nhiên Chính vì vậy, việc bảo tồn và phát triển loại dược liệu quý báu này không chỉ

góp phần xoá đói giảm nghèo, tạo công ăn việc làm cho bà con vùng núi mà còn tạo nguồn dược liệu quý, sạch để cung cấp cho các công ty dược phẩm và người tiêu dùng Để góp phần nghiên cứu bảo tồn loài cây quý hiếm này, tôi

tiến hành thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền và xác định marker phân tử đặc trưng nhận dạng một số mẫu SâmLai Châu”.

2 Mục đích nghiên cứu

Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử để xác định nguồn gốc, mối quan hệ di truyền của các giống/loài Sâm Lai Châu, phân biệt Sâm Lai Châu với với loài khác cùng chi Panax; phục vụ cho công tác bảo tồn, chọn tạo giống và phát triển nguồn gốc dược liệu quý giá có giá trị kinh tế

Xác định được các chỉ thị/marker phân tử đặc trưng để nhận dạng một số nguồn gen Sâm Lai Châutrong tập đoàn nghiên cứu

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: 25 mẫu Sâm thu thập tại 5 địa điểm ở Lai Châu (Ka Lăng - Mường Tè, Pa Vệ Sử - Mường Tè, Thu Lũm - Mường Tè; Sìn Hồ; Tam Đường và Phong Thổ)

- Thời gian thu mẫu: tháng 5 - 6/2017

- Thời gian nghiên cứu: từ tháng 6/2017 đến tháng 8/2018

- Địa điểm nghiên cứu: thực hiện các thí nghiệm phân tử tại Bộ môn Kỹ

thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp

4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học

Hiểu biết về đa dạng di truyền ở mức phân tử của các mẫu Sâm Lai Châu thu được, là cơ sở để phân loại, tuyển chọn những nguồn gen ưu tú phục vụ cho công tác chọn và lai tạo giống mới Các marker phân tử nhận biết chính xác một số nguồn gen Sâm bản địa quý được sử dụng để xác

định tính đúng giống phục vụ công tác nhân giống và kiểm soát cây con giống ở giai đoạn sớm

Kết quả của đề tài rất có ý nghĩa trong việc xây dựng và tiêu chuẩn hoá phương pháp đánh giá nguồn gen làm cơ sở cho việc đăng kí bản quyền ở Ngân hàng gen thế giới, khẳng định chủ quyền Quốc gia về nguồn tài nguyên thực vật bản địa

Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài góp phần thu thập các nguồn gen Sâm thu thập tại Lai Châu

Kết quả đề tài góp phần bảo tồn và sử dụng hợp lí nguồn gen Sâm Lai Châu của Việt Nam, phục vụ cho công tác chọn tạo giống mới, chuẩn hóa nguồn cây giống dược liệu góp phần nâng cao thương hiệu cho sản phẩm Sâm Lai Châu của Việt Nam ở khu vực và trên thế giới

PHẦN II: NỘI DUNG Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu cây Sâm Lai Châu trên Thế giới và ở Việt Nam

1.1.1 Tên gọi, phân loại và hình thái

v Tên gọi

Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu,

S.Zhu & S.Q.Cai) là cây thân thảo, củ và rễ được sử dụng làm thuốc từ rất

lâu đời thuộc chi Nhân sâm (Panax L.), họ Ngũ gia bì (Araliaceae)

Các loài Nhân sâm được phân biệt dựa vào hình thái, màu sắc và được gọi theo tên địa phương; ví dụ một số loài Sâm chính như sau:

- Panax vietnamensis Ha et Grushv.: sâm Việt Nam, sâm Ngọc Linh, sâm Nga

Mi, mọc hoang dại, được trồng chủ yếu ở Kon Tum và Quảng Nam

- Panax stipuleanatus H.Tsai et K.M Feng: mọc hoang dại ở miền Nam

Trung Quốc và Bắc Việt Nam

- Panax ginseng C.A Meyer: sâm Triều Tiên, sâm Cao ly, nhân sâm, hồng

sâm, là loài hoang dại, hiện nay rất hiếm, được trồng ở Đông Bắc, Châu Á

- Panax quinquefolius L.: sâm Mỹ, sâm Tây Dương, mọc hoang, được trồng ở

vùng Bắc Mỹ

- Panax notoginseng F.H Chen ex C.Y Wu et K.M Feng: sâm Trung Quốc,

tam thất, điền thất, phân bố loài hoang dại chưa rõ, được trồng ở Vân Nam Trung Quốc

- Panax japonicus C.A Meyer: sâm Nhật Bản, sâm lá tô, sâm đốt tre, mọc

hoang dại ở Nhật Bản và Nam Trung Quốc

v Phân loại

Phân loại Sâm Lai Châu:

Giới : Plantae (Thực vật) Ngành : Magnoliophyta (Ngọc Lan)

Lớp : Magnoliopsida (Ngọc Lan)

Bộ : Araliales (Nhân sâm)

Họ : Araliaceae (Nhân sâm) Chi : Panax (Sâm)

Loài :Panax vietnamensis

Thứ loài: (Panax vietnamensis var fuscidiscus K.Komatsu,

S.Zhu & S.Q.Cai)

Theo Nguyễn Huy Sơn (2016) Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var

fuscidiscus) có tên gọi khác là Tam thất hoang Mường Tè;Tam thất rừng;

Tam thất đen[6] Loài cây này được Zhu và cộng sự đã mô tả là một thứ mới,

bậc phân loại dưới loài của Sâm ngọc linh (Panax vietnamensis) Thứ này

được phát hiện đầu tiên tại vùng Jinping, phía nam của tỉnh Vân Nam - Trung

Quốc Đây là cây dược liệu đặc hữu có giá trị thuộc chi Sâm (Panax), họ Ngũ

gia bì (Araliaceae).Trong kết quả nghiên cứu của mình tác giả đã mô tả thu mẫu được cả quả chín đốm đen

Chi Sâm Panax L gồm có 15 loài và dưới loài và hầu hết chúng là

nguồn dược liệu cho y học cổ truyền như các loại Nhân Sâm, Nhân Sâm Hoa

kỳ, Tam thất, Nhân Sâm Nhật bản và Sâm Ngọc Linh (Nguyễn Tập, 2005) [8].Mới gần đây nhóm nghiên cứu của Phan Kế Long et al., (2013) đã phát

hiện thứ Panax vietnamensis var fuscidiscus nói trên có phân bố ở tỉnh Lai

Châu và được gọi tên là Sâm Lai Châu Loài này có phân bố hẹp trên dãy núi

Pu Si Lung và lân cận (Mường Tè và Tây Sìn Hồ, giáp biên giới với Trung Quốc) và dãy núi Pu Sam Cáp nằm giữa các huyện Sìn Hồ và Tam Đường với Thành phố Lai Châu, tỉnh Lai Châu Sâm Lai Châu bị người dân bản địa khai thác, sử dụng làm thuốc và bán sang Trung Quốc, đang bị đe doạ tuyệt chủng

ở mức độ trầm trọng (CR) (Phan Kế Long et al., 2013) [52]

v Đặc điểm hình thái

Chi Sâm Panax L thuộc họ Ngũ gia bì (Araliaceae)được mô tả sớm

nhất và được ứng dụng phổ biến nhất.Chi Sâm được mô tả đầu tiên cho hai

loài là P quinquefolius L và P trifolius L với đặc điểm khác biệt so với các

chi khác trong họ là bầu 2 ô, hoa mẫu 5, xếp van hay xếp lợp (Linnaeus,

1754)[48].De Candolle (1830) đã sắp xếp một số loài thuộc chi Nothopanax vào chi Panax[23] Tuy nhiên, Decaisne và Planchon (1854) lại cho rằng đặc điểm chính của chi Panax là đài xếp van, nên chuyển 2 loài P quinquefolius

và P trifolius sang chi Aralia, đồng thời đồng nhất hoá các chi Polyscias Forest, Cheirodendron Nutt, Pseudopanax Koch và Maralia Pet vào chi

Panax[22].Như vậy, với cách phân loại như trên, các tác giả đã cho rằng đặc

điểm hình thái của chi Panax bên cạnh đài xếp van còn có đặc điểm thân gỗ

và thân thảo Đồng ý với quan điểm trên, các tác giả Bentham và Hooker

(1867), Clarke (1879) tiếp tục xác nhập chi Nothopanax vào chi Panax, đồng thời chuyển chi Panax vào tông (tribe) Panaceae[17], [19]

Seemann (1868) đã nghiên cứu sự khác biệt giữa chi Panax so với chi

khác trong họ Araliaceae là: thân dạng củ, đài 5, xếp lợp, bầu 2 ô Dựa vào kết quả trên, tác giả đã chuyển 61 loài không có thân dạng củ ra khỏi chi

Panax, đồng thời chuyển các loài có thân dạng củ trước đây ở các chi khác

vào chi Panax, và chi này chỉ còn lại các loài: P trifolium L., P quinquefolius L., P ginseng Mey., P pseudoginseng Wall., P japonicus Mey và P

bipinnatifidus Seem Với loài P fructicosus có đặc điểm là đài xếp van, tác

giả xếp vào chi Nothopanax và đồng thời lấy loài này là danh pháp cho chi

Nothopanax (Seemann, 1868) [57] Năm 1987, Harm cho rằng chi Panax có

nguồn gốc từ chi Aralia dựa trên các đặc điểm của các loài Nhân sâm phân bố

trên thế giới như: cơ quan sinh sản, cơ quan sinh dưỡng[32].Britton và Brown

(1913) cho rằng loài P quinquefolius được mô tả lần đầu tiên và có đặc điểm

đại diện cho chi Panax như thân dạng củ, hoa mẫu 5 xếp van hay xếp lợp, bầu

2 ô, nên lấy loài này để phân loại danh pháp cho chi [18]

Nhiều nghiên cứu cho rằng chi Panax có mối quan hệ gần gũi với chi

Aralia(Hara 1970; Wen, 1993; Wen và Zimmer, 1996; Plunkett et al., 1996;

Xiang và Lowry, 2007)[31], [65], [66], [54], [69] Theo các tác giả, cách phân

loại các loài thuộc chi Panax sẽ dựa vào hình thái của thân rễ (Rhizome type:

thân rễ có dạng thân củ (carot type); thân rễ có đốt kéo dài; và thân rễ có đốt ngắn như đốt trúc); các đặc điểm cơ quan sinh dưỡng; đặc điểm hình thái, hình thái giải phẫu, hạt phấn và sinh học phân tử Bên cạnh cách phân loại dựa trên các hình thái còn có một số nghiên cứu phân loại khác dựa trên thành phần hoạt chất và số lượng nhiễm sắc thể (Tsai và Feng, 1975; Yang, 1981) [63], [70]

Ví dụ, Tsai và Feng (1975) đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane gồm có

các loài: P ginseng, P notogingseng và Triterpenoid oleanane gồm các loài:

P pseudoginseng, P zingiberensis, P japonicus, P japonicus var angustifolius, P japonicus var major, P japonicus var bipinatifidus, P stipuleanatus Ngoài ra, kết hợp với các đặc điểm hình thái của thân rễ, các

tác giả chia các loài Sâm ở Trung Quốc thành 2 nhóm chính: Nhóm 1 gồm các loài có thân rễ ngắn, giống thân củ cà rốt, hạt lớn, đồng thời hoạt chất chính là tetracyclic triterpenoid có trong thân rễ; Nhóm 2 gồm các loài có thân

rễ dài hay dạng đốt trúc, hạt nhỏ, đồng thời có hoạt chất pentacyclic triterpenoid Yang (1981) đã chỉ ra số lượng nhiễm sắc thể của 7 loài Sâm

Tác giả cũng cho rằng hai loài P gingseng và P quinquefolius không là tổ tiên của chi Panax vì 2n = 48 (44), mà tổ tiên của chi Panax phải là P

japonicus với bộ nhiễm sắc thể 2n = 24)

Tuy nhiên, số lượng các loàiSâm củachi Panax vẫn chưa rõ ràngvì

một số tác giả xác định cùng một loài nhưng lại cho các kết quả khác nhau Nhiều nghiên cứu xác định các loài Sâm đã sử dụngphương pháp hình thái học, tế bào học, giải phẫu học, sinh lý học và sinh thái học (Woo et al., 2004; Yu et al., 2009; Jee et al., 2014; Bai et al., 2015; Kim et al., 2015) [68], [73], [35], [13], [40] Sử dụng như đặc điểm hình thái để phân biệt giữa các loài có thể dẫn đến sự nhầm lẫn bởi vì các đặc điểm biểu hiện có thể là kết quả kết hợp của di truyền và môi trường (Jo et al., 2013) [37] Hơn nữa, kỹ thuật sinh học phân tử đã được ứng dụng để bổ sung thêm một mức độ phân loại các loài thông qua các nghiên cứu về DNA (Lim và Choi 1990; Lim et al., 1993; Hon et al., 2003) [46], [47], [33] Để phân loại các loài thực vật, các kỹ thuật như RFLP, RAPD, AFLP và SSR đã được sử dụng Trong đó các kỹ thuật marker SSR hoặc microsatellite có tiềm năng rất lớn do có khả năng phát hiện tính đa hình rất cao, có thể phân biệt được

sự sai khácmà không xác định được bằng các marker khác như RAPD và RFLP(Powell et al., 1996; Kim et al., 2007; Silva et al., 2013)[55], [42], [58].Những nghiên cứu ứng dụng marker SSR để đánh giá đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ di truyền, so sánh gen, lựa chọn trợ giúp của marker đã mang lại nhiều kết quả khả quan, vì bộ gen của Nhân sâm là rất lớn (3.12 tỷ cặp base) và có rất nhiều giống phát triển gần đây Bảng 1.1

cho thấy việc phân loại các taxon thuộc chi Panax dựa vào đặc điểm hình

thái với các kết quả rất khác nhau, đòi hỏi cần tiếp tục có những nghiên cứu

về phân loại

Bảng 1.1: Phân loại các taxon Panax ở Châu Á theo quan điểm của các

nhà nghiên cứu hệ thống học thực vật giai đoạn 1996-2014

Hệ thống phân

Dựa trên hình thái

và vùng

ITS1-5,8S-ITS2

Panax ginseng, P japonicas, P.bipinnatifidus (Sichuan, China), P

omeiensis, P bipinnatifidus (Hubei,

China), P major ((Syn.: P japonicus var major; P pseudoginseng subsp

himalaicus), P wangianus (Syn.: P

japonicus var angustifolius), P

sinensis, P zingiberensis, P

pseudoginseng, P notoginseng, P

stipuleanatus

Wen và Zimmer (1996)[66]

Dựa trên hình

thái, trình tự gene

18S rDNA và

gene matK/trnK

Panax ginseng, P japonicus (Japan),

P japonicus (China), P japonicus

var bipinnatifidus

P japonicus var major, P

pseudoginseng subsp Himalaicus, P

japonicus var angustifolius, P

Ở Việt Nam, loài cây này đã được công bố phát hiện tại Lai Châu năm

2013 và đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế và đăng ký mẫu DNA vào ngân hàng Genbank Tính đến năm 2016 thì diện tích phân bố tự nhiên của Sâm Lai Châu đã giảm đáng kể chỉ còn lại rất ít trong rừng rậm nguyên sinh mưa mùa nhiệt đới chưa bị tác động hoặc tác động nhẹ thuộc vùng núi cao xã Pa Vệ Sử, xã

Ka Lăng, xã Thum Lũm, xã Tá Bạ huyện Mường Tè, cây phân bốrải rác

Sâm Lai Châu là cây thảo, sống nhiều năm, cao 40-80 cm Thân rễ hợp trục, nằm ngang hay hơi chếch, mập, nạc có nhiều chỗ lõm do vết thân để lại;

ít khi phân nhánh; đường kính củ 1,5-3 cm Mỗi cây thường có 1 thân mang

lá, ít khi 2 hoặc 3 trừ trường hợp đầu thân rễ bị tổn thương, sau phân nhánh và mọc lên số chồi thân tương ứng Thân đơn độc, vỏ màu đen hoặc lục, mọc thẳng đứng, nhẵn, cao 0,3m (khi chưa có hoa); 0,7m (khi có hoa); khi tươi đường kính 0,3-0,6 cm, mặt cắt ngang hình tròn hay hơi có 3 cạnh, xốp ở giữa khi tươi, rỗng khi khô

Lá kép chân vịt, gồm 3-4 cái có khi lên đến 5-6 cái, mọc vòng ở ngọn;

có cuống dài 5-10 cm Lá chét 5; có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, nhọn 2 đầu, 5-13 x 2-4 cm; mép có răng cưa, hoặc ở một số ít cây non có thể gặp dạng xẻ lông chim nông, mép của thuỳ nông cũng khía răng cưa; thường

có lông ở gân mặt trên lá

Mùa ra hoa tháng 4-5, quả tháng 7-9 (10) Tái sinh chủ yếu tự nhiên bằng hạt Thân mang lá lụi hàng năm vào mùa đông, chồi mới mọc lên từ đầu thân rễ vào đầu mùa xuân năm sau

Cây Sâm Lai Châu có phân bố tập trung chủ yếu ở tỉnh Lai Châu, cây

có cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, hiếm khi có thêm 1 tán phụ, nhỏ Cuống cụm hoa mọc đơn độc ở đỉnh thân, giữa vòng lá cao tán lá, dài đến 25 cm, gấp 1,5-2 lần cuống lá Cụm hoa có dạng hình cầu Lá hoa tổng bao hình tam giác hẹp, dài khoảng 2mm, mép nguyên Cuống hoa dài 1-1,5cm, mang dày đặc

nhú mịn, mọng chất tiết giống như trên cuống cụm hoa Cụm hoa có đường kính 2,5-4cm Số hoa trên 1 tán từ 70-100 hoa, có khi hơn tuỳ vào kích thước

và tuổi cây, nhưng tỷ lệ đậu quả thấp, chỉ đạt từ khoảng 40-50% Hoa màu vàng xanh nhạt, 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 ô, có đầu nhuỵ thường chẻ đôi Nhị đực màu trắng, chỉ nhị hình sợi, dài khoảng 2,5mm; bao phấn hình thuôn ngắn, dài khoảng 1mm Đĩa tuyến mật trên đỉnh bầu thoạt đầu hơi hình nón, sau dẹt dần, toàn bộ màu mận chín

Thường có đến 80% số lượng hoa chỉ có một ô cùng một vòi nguyên phát triển, ô còn lại sớm bị tiêu giảm Quả mọng, gần hình cầu dẹt (thận) dẹt theo hướng lưng bụng, đường kính 0,6-1,2 cm, khi chín màu đỏ có chấm đen

Có 1 hạt, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt

1.1.2 Đặc điểm sinh thái và phân bố

Trong vùng phân bố, Sâm mọc tự nhiên dưới tán rừng có độ cao từ 1500m trở lên, phù hợp với điều kiện khí hậu ôn hòa, mát mẻ quanh năm Nhiệt độ trung bình từ 200C đến 250C, tổng tích ôn từ 7200-75000C/năm Nhiệt độ tối thấp trên 50C và nhiệt độ tối cao là 330C, nhiệt độ quá cao và thấp

sẽ ảnh hưởng tới sinh trưởng của cây Hạt Sâm có thể mọc mầm trong điều kiện nhiệt độ thấp, thời kỳ hạt Sâm mọc yêu cầu nhiệt độ từ 100C trở nên Cây Sâm mọc tự nhiên dưới tán rừng nên yêu cầu về độ ẩm không khí và độ ẩm đất tương đối cao từ 80% đến 90% so với độ ẩm tối đa Ở thời kỳ sinh trưởng, thân khí sinh yêu cầu độ ẩm cao, lượng mưa trung bình từ 200-250 mm/tháng Ngoài ra, trong quá trình sinh trưởng của cây, các yếu tố như mưa dông, mưa

đá, sương muối đều không thích hợp, gây tổn hại đến cây Chế độ ánh sáng, đặc biệt là chất lượng ánh sáng và thời gian chiếu sáng rất quan trọng đối với quá trình sinh trưởng và phát triển của cây Sâm Chế độ ánh sáng trực xạ chiếm 10% và tán xạ chiếm 90% là ánh sáng được xem là thích hợp nhất cho sinh trưởng của cây Cây Sâm phát triển tốt dưới tán rừng, nơi đất đai tơi xốp,

có lớp mùn dày, đủ ẩm và có điều kiện thông thoáng tốt Cây cần một lượng đạm nhất định, pH trung tính, giàu lân và kali tạo điều kiện cho củ Sâm tích lũy các hoạt chất có năng suất cao, chất lượng tốt Các loại đất trũng, nghèo dinh dưỡng đều không thuận lợi cho sự sinh trưởng của cây

Sự phân bố của chi Panax L chỉ xuất hiện ở Bắc bán cầu, kéo dài từ

vùng rừng núi giáp bờ biển phía Đông của Bắc Mỹ bao gồm Bắc Hoa Kỳ và

Tây-Nam Canada (có 2 loài P quinquefolius và P trifoliatus Vùng Đông Bắc

Á (gồm Viễn Đông Nga, Đông Bắc Trung Quốc, bán đảo Triều Tiên và Nhật

Bản) có 2 loài là P ginseng và P japonica Trung tâm phân bố của chi Panax

L có thể từ vùng Tây- Nam của Trung Quốc lan toả xuống phía Bắc của Việt Nam Thực chất khu vực này gồm 2 tỉnh biên giới kề nhau là Vân Nam (Trung Quốc) và Lào Cai (Việt Nam), ở đây đang có tới 7 loài và dưới loài (thứ) mọc

hoàn toàn tự nhiên, 2 loài trồng là P notoginseng (nhập từ Bắc Mỹ) và P

pseudoginseng (không tìm thấy trong tự nhiên, nhưng giả thiết có nguồn gốc từ

vùng cận Himalaya hoặc là kết quả của lai tự nhiên giữa 2 loài gần gũi nào đó)

Đây có thể coi là trung tâm phân bố của chi Sâm (Panax L.) của thế giới Ở Bắc Mỹ hiện có 3 loài (P notoginseng; P quinquefolius và P trifoliatus) Giới hạn cuối cùng về phía Nam của chi Panax L là loài Sâm Việt Nam (Panax

vietnamensis) ở Miền Trung của Việt Nam, tại 14015’ vĩ độ Bắc

Năm 2016, Phạm Quang Tuyến trong hội thảo “Bảo tồn và phát triển

Sâm Lai Châu tại huyện Mường Tè” trong báo cáo về đặc điểm sinh thái cây

Sâm Lai Châu về cơ bản thống nhất với những mô tả về hình thái lá, hoa và hạt của Phan Kế Long et al., (2013) [11] Nhưng tác giả có bổ sung đặc điểm quan trọng để nhận biết cây Sâm Lai Châu và phân biệt với các loài cùng chi

Panax đó là: quả khi chín có màu đỏ chấm đen ở đầu Đây là đặc điểm dễ

nhận biết để phân biệt Sâm Lai Châu (Panax vietnamensis var fuscidiscus) với Tam thất hoang (Panax stipuleanatus) và Sâm vũ diệp (Panax

bipinnatifidus) khi chín hạt chỉ có màu đỏ Như vậy, các kết quả nghiên cứu

phân loại, tên gọi và mô tả đặc điểm hình thái cây Sâm Lai Châu về cơ bản đã đầy đủ thông tin làm cơ sở nhận biết đặc trưng loài và dưới loài Tuy nhiên, một số mẫu cây mọc tự nhiên vẫn có đặc điểm hình thái thân và củ màu sắc khác nhau có thể do các yếu tố về vùng địa lý (xuất xứ) hoặc hoàn cảnh sống Đây là yếu tố quan trọng để xác định mẫu giống trong quá trình chọn giống

Ở Việt Nam, Sâm Lai Châu có đặc điểm ưa ẩm và ưa bóng, mọc rải rác trên đất có nhiều mùn, dưới tán rừng kín thường xanh ẩm, trên đất có nhiều mùn, hoặc rừng có xen lẫn với sặt gai, ở độ cao 1400-2300m Độ cao thường gặp từ 1400-1900m Thực vật đi cùng thường là các loài cây thân gỗ, cây bụi, cây thảo thuộc các họ: Ngọc Lan (Magnoniaceae), Dẻ (Fagacea), Re (Lauraceae), Ngũ gia bì (Araliaceae), Đỗ quyên (Ericaceae), Hồi (Illiciaceae),

Gừng (Zingiberacaea), nhiều chỗ có Sặt gai (Sinarudinaria griffiana) chiếm

ưu thế và một số loài Dương xỉ khác

Đất đai, thổ nhưỡng: Sâm Lai Châu phát triển trên các nhóm: Đất mùn trên núi cao >1700m; đất mùn vàng đỏ trên núi cao 700-1700m Đất rừng có Sâm lai châu phân bố nhìn chung thuộc loại đất chua (pH 3,5-5,7); đất khá màu mỡ hàm lượng các bon hữu cơ 2,88-7,23%; hàm lượng nitơ tổng số 0,25-0,76%

Khí hậu: Số liệu khí hậu (bảng 1.2) được thu thập và kế thừa từ số liệu được tổng hợp ở bảng sau:

Bảng 1.2: Đặc điểm khí hậu các xã vùng cao huyện Mường Tè

Địa điểm nghiên cứu Lượngmưa

(mm/năm)

Độ ẩm (%)

Nhiệt độ trungbình năm (độ)

Các xã vùng cao huyện

(Nguồn dẫn: Niêm giám thống kê tỉnh Lai Châu, 2005-2010)

Sâm Lai Châu là cây ưa ẩm, khí hậu mát quanh năm và lạnh về mùa đông Kết quả điều tra đặc điểm khí hậu tại các xã vùng cao huyện Mường Tè cho thấy tổng lượng mưa trong năm trung bình là 3.000mm/năm; Độ ẩm không khí 87,5%; Nhiệt độ trung bình năm là 150C Kết quả điều tra này một lần nữa khẳng định cây Sâm Lai Châu là cây ưa ẩm (87%), khí hậu mát quanh năm (trung bình khoảng 150C).Kết quả nghiên cứu này là cơ sở cho việc lựa

chọn địa điểm trồng bảo tồn và phát triển cây Sâm tại Lai Châu

1.1.3 Giá trị sử dụng và giá trị kinh tế

Tại các nước Châu Á, Nhân sâm được coi là vị thuốc quý đứng đầu trong các loại thuốc quý đông y (sâm, nhung, quế và phụ) Nhân sâm có tác dụng kích thích nhẹ ở liều thấp làm tăng vận động, tăng trí nhớ nhưng tác dụng

ức chế ở liều cao đối với hệ thần kinh; làm tăng sinh lực chống lại sự mệt mỏi, giúp hồi phục sức lực; làm tăng sự thích nghi của cơ thể trước những bất lợi của điều kiện môi trường sống; tác dụng bảo vệ tế bào giúp hồi phục số hồng cầu, bạch cầu bị giảm; tác dụng tăng nội tiết tố sinh dục; tác dụng kháng viêm; tác dụng điều hoà hoạt động của tim; tác dụng hạ cholesterol máu, chống xơ vữa động mạch; tác dụng giải độc gan và tác dụng kháng khuẩn nhất là đối với Streptococcus gây bệnh viêm họng Thân rễ và rễ củ Sâm có thể dùng như Nhân sâm làm thuốc bổ; tăng lực, chống suy nhược, hồi phục sức lực bị suy giảm, kích thích nội tiết sinh dục, tăng sức chịu đựng, giải độc và bảo vệ gan, điều hoà thần kinh trung ương, điều hoà tim mạch, chống xơ vữa động mạch, giảm đường huyết, và có thể dùng làm thuốc trị viêm họng Ginsenosides,

cáchợp chất hóa học độc đáo của các loài Panax, đang được nghiên cứu để sử

dụng tiềm năng trong y học Tuy nhiên dược tính và tác dụng bổ dưỡng của Sâm còn gây tranh cãi trong giới học giả phương Tây

Nhân sâm thương mại được bán tại hơn 35 quốc gia với doanh số vượt quá tỷ $ 2.1 vào năm 2013, trong đó một nửa đến từ Hàn Quốc và Trung

Quốc là thị trường tiêu thụ lớn nhất (Bae và So, 2013) [12] Giá trị kinh tế của các loại Nhân sâm rất khác nhau tùy vào thời điểm, xuất xứ, loài, độ tuổi, có nguồn gốc trồng hay từ tự nhiên Giá bán Sâm tự nhiên đắt gấp nhiều lần

Nhân sâm trồng, giá bán Nhân sâm đỏ (P ginseng) trồngtại Hàn Quốc là 250

USD/kg còn giá của Sâm tự nhiên cùng loại dao động từ 2000-20.000USD/kg

tùy vào tuổi Ở Việt Nam, giá bán của P vietnamensis khoảng1000-1500 USD/kg, giá bán của P vietnamensis var fuscidiscus khoảng 200-300 USD/kg; giá của P stipuleanatus khoảng 150-250 USD/kg và giá bản của P

bipinnatifidus khoảng 100-200 USD/kg Chính vì có giá trị dược dụng và giá

trị kinh tế lớn, mà các quốc gia trên thế giới có các loài thuộc chi Panax phân

bố tự nhiên như Hàn Quốc, Mỹ, Canada, Trung Quốc… đều đã đưa ra các chương trình bảo tồn, phát triển và khai thác rất nghiêm ngặt để bảo vệ nguồn tài nguyên quý hiếm này (Bai et al., 1997; Jennifer và Hamrick, 2004; Eidus

và Leopold, 2013) [14], [36], [24]

Theo Sách Đỏ Việt Nam (2007) Tam thất hoang là nguồn gen đặc biệt quý hiếm đối với Việt Nam và thế giới [1] Tất cả các bộ phận của cây đều có thể dùng làm thuốc Thân rễ thường được dùng làm thuốc bổ, cầm máu, tăng cường sinh lực, chống stress Lá, nụ hoa dùng làm trà uống có tác dụng kích thích tiêu hoá, an thần

Tam thất có vị ngọt, hơi đắng, tính ôn; có tác dụng chỉ huyết, phá huyết tán ứ, tiêu thũng định thống và tư bổ cường tráng Ngoài ra, Tam thất có tác dụng tăng lực rất tốt, tác dụng này giống với tác dụng của Nhân sâm; rút ngắn thời gian đông máu; tiêu máu ứ và tăng lưu lượng máu ở động mạch vành của động vật thí nghiệm Làm tăng sức co bóp cơ tim ở liều thấp; tác dụng kích dục, đối với chức năng nội tiết sinh dục nữ, thể hiện ở các hoạt tính oestrogen

và hướng sinh dục; giãn mạch ngoại vi và không ảnh hưởng đến huyết áp và

hệ thần kinh trung ương; điều hòa miễn dịch; kích thích tâm thần, chống trầm

uất Dựa trên những đặc điểm trên mà Tam thất đã được sử dụng trong đông y

từ khá lâu đời như một vị thuốc quý

Công trình nghiên cứu của tác giả Phạm Thanh Huyềncũng đã đạt một

số kết quả về nghiên cứu giá trị của các thành phần hóa học của loàiTam thất hoang tại Việt Nam.Tác giả cũng đã xác định được các thành phần hóa học của Tam thất hoang có Saponin, Phytosterol, tinh dầu, Axit hữu cơ, Acid béo, hợp chất uronic và đường khử tự do Ngoài ra, tác giả còn xác định sự khác nhau giữa thành phần hóa học tinh dầu lá và bước đầu xác định dấu vân tay hóa học của loài góp phần vào việc phân loại và kiểm định dược liệu(Phạm Thanh Huyền, 2007)[2]

Trong Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 5, Lã Đình Mỡi và nhóm tác giả đã công bố kết quả nghiên cứu về các loài cây thuốc quý thuộc họ Sâm Kết quả cho thấy trong rễ của hai loài Sâm

vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax

stipuleanatusH.T Tsai et K.M Feng) phân bố tại vùng núi Hoàng Liên Sơn

(Lào Cai) chứa các hợp chất saponin triterpen thuộc nhóm olean (như các chikusetsusaponin IV, zingibrosid R1, ginseninosid Ro, Rb, Rd, Re, Rg1, Rg2, ), các phytosterol, đường khử tự do, tinh dầu, các acid hữu cơ, acid uronic và các acid béo Các thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu ở cả 2 loài cũng tương tự nhau (như: β-farnesen, germacren D, spatulenol) Cả 2 loài hiện đã rất hiếm, đã và đang bị de dọa ở mức độ rất nguy cấp (CR A1a,c,d, B1+2b,c,e và CR A1c,d, B1+2b,ce) (Lã Đình Mỡi et al., 2013)[5] Nhìn chung, những nghiên cứu sâu về mặt hóa học mới chỉ được thực hiện ở một

số ít các loài thuộc học Sâm

1.1.4 Các thành phần hoạt chất ở chi Panax

Đến nay, các nhà khoa học đã xác định rất nhiều hoạt chất dược thuộc các nhóm ginsenoside, polysaccharide, polyacetylene, peptide và amino acid

ở các loài Nhân sâm thuộc chi Panax Tuy nhiên, thành phần dược dụng chủ

yếu được quan tâm là các triterpen saponin (ginsenoside), trong đó nhóm saponin dammarane và oleane là quan trọng nhất Chính thành phần và hàm lượng của nhóm hoạt chất này quyết định giá trị dược dụng của các taxon cũng như chất lượng dược liệu

Ginsenosides hoặc panaxosides là một lớp học của glycosides steroid ,

và saponin triterpene, đặc biệt tìm thấy trong chi Panax nên còn gọi là saponin

Nhân sâm để phân biệt với các loại saponin trong nhiều loại thảo dược khác Ginsenosides là chất quan trọng trong các mục tiêu nghiên cứu, khi chúng được xem như là các hợp chất chính đứng đằng sau những hiệu quả của Nhân sâm Bởi vì ginsenosides xuất hiện trong Nhân sâm và mộtsố loại thực vật khác cùng với nhiều hợp nhất như fenolic hay acid amin protein polyacetylene dẫn đến nhiều khó khăn trong việc đánh giá về hiệu quả của Nhân sâm, tác động của chúng rất phức tạp và khó khăn để nghiên cứu Ginsenosides được phân tách bằng sắc ký cột Hàm lượng Ginsenoside có thể khác nhau tùy thuộc vào giống

cây Sâm (panax) và giai đoạn sinh trưởng, phát triển của Nhân sâm vào thời

gian khác nhau trước khi thu hoạch và cũng bị ảnh hưởng khá nhiều bởi quy trình và phương pháp chế biến Gốc Sâm hay thân củ Sâm còn gọi là rễ chính

là cơ quan được sử dụng thường xuyên nhất, chứa nhiều phức hợp saponin Nhân sâm quan trọng nhất Chúng thường được phân chia thành hai nhóm: nhóm Rb1 (đặc trưng bởi protopanaxaDiol - PD gồm Rb1, Rb2, Rc và Rd) và nhóm Rg1 (protopanaxaTriol PT : Rg1, Re, Rf, RG2)

Elyakov và cộng sự đã phân lập từ dịch chiết rễ Nhân sâm nhiều thành phần có liên kết đường và đặt là “panaxoside”; panaxoside A và B được nhóm tác giả báo cáo năm 1962 và các panaxoside C, D, E, F được công bố năm 1964[27] Shibata và cộng sựcũng đã phân lập và mô tả các saponin từ Sâm tương tự và gọi là “ginsenoside” Năm 1962, Fujita và công sự đã nghiên cứu

dịch chiết cồn của rễ P ginseng, P japonicum và P quinquefolium, phân

biệt các saponin và thành phần aglycol và sapogenin của chúng bằng cách thủy phân với acid hydrochloric [28] Đến năm 1963, Shibata và cộng sự

đã lập cấu trúc sapogenin panaxadiol ở dạng dammarane-type tetracyclic triterpene [59]

Có nhiều nghiên cứu cho thấy sự biến động thành phần ginsenodide

theo vào tuổi, điều kiện canh tác, vùng trồng ở nhiều taxon Panax khác nhau

trên thế giới (Kenneth et al., 2004[38]; Deborah et al., 2005[21]), biến động

ginsenodide và các hoạt chất khác theo điều kiện nuôi cấy in vitrocũng như sự

đa dạng và khác biệt hóa học của các loài (Kim, 2012[39]; Komatsu et al., 2005[43]; Quan et al., 2001 [56])

Quá trình nghiên cứu, sự đa dạng các hoạt chất có bản chất Saponin

được phát hiện ở chi Panax được hệ thống hóa trong một công trình nghiên

cứu mang tính khái quát hóa của các nhà khoa học Hàn Quốc Theo đó, đến cuối năm 2012, có tối thiểu 289 loại saponin khác nhau được ghi nhận, phân loại thành 6 nhóm là protopanaxadiol, protopanaxatriol, octillol, oleanolic acid, nhóm biến động vị trí chuỗi C17 và một nhóm đa thành phần có cấu trúc sapogenin khác nhau (Yang et al., 2014) [71]

Có một số nghiên cứu sử dụng thành phần hoạt chất, chủ yếu là các

saponin để phân biệt các taxon thuộc chi Panax: Tsai và Feng (1975) khảo sát

thành phần hoạt chất trong các loài Sâm ở Trung Quốc[63] Thông qua đó, các tác giả đã chỉ ra có 2 nhóm triterpenoid saponin chính tồn tại trong các loài Sâm khác nhau: Triterpenoid dammarane và Triterpenoid oleanane Theo

Osamu Tanaka thì chi Panax có đến 8 loài và 11 taxon dưới loài được phân

thành các nhóm dựa vào thành phần hoạt chất

1.2.Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền Sâm

Tại nhiều nước trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị phân tử trong phân

loại chi Panax đã được triển khai và đạt được nhiều kết quả mang tính ứng

dụng cao

Shim và cộng sự (2003) tiến hành phân biệt P.ginseng (Hàn Quốc) với các taxon Panax khác gồm Nhân sâm SheoAn (Trung Quốc), P notoginseng (Trung Quốc), P japonicus (Nhật Bản) và hai loại Nhân sâm thuộc loài P

quinquefolius từ Mỹ và Canada được thu thập từ 6 vùng khác nhau bằng kỹ

thuật RAPD [60] Kết quả phân tích với mồi 80 mồi ngẫu nhiên cho thấy mồi OP-13B có thể xem là marker RAPD duy nhất để phân biệt các taxon Nhân sâm được khảo sát Những kết quả này cho phép phân biệt Nhân sâm Hàn

quốc (P ginseng) với các taxon khác ở mức độ phân tử

Năm 2007, Kim và cộng sự đã phát triển các chỉ thị Microsatellite mới

để nhận dạng P Ginseng [41] Nhóm nghiên cứu đã xây dựng một thư viện được làm giàu microsatellite của P ginseng và 251 trình tự microsatellite mới

được xác định Thông qua việc xác định kiểu gene của 91 microsatellite bằng cách sử dụng tập hợp các mồi đặc hiệu cho chỉ thị, nhóm tác giả đã xác định

11 chỉ thị đa hình trong loài cũng như 14 chỉ thị đa hình phân biệt P ginseng

và P quinquefolius Kết quả nghiên cứu này cho thấy các chỉ thị

microsatellite rất hữu ích cho phân tích di truyền và việc xác định các loài

thuộc chi Panax

Dan và cộng sự (2010) đã thử nghiệm với 35 cặp mồi được thiết kế cho

35 microsatellite được chọn ở các mẫu P ginseng cho thấy 12 trong số chúng

là đa hình, 19 là đơn hình và 3 không có sản phẩm khuếch đại [20] Phân tích

thêm các chủng thuộc P quinquefolius từ Mỹ và Canada cho thấy các mồi có khả năng khuếch đại ở P ginseng cũng thể hiện kết quả ở P quinquefolius

Từ đó, nhóm tác giả đề xuất và có thể sử dụng các chỉ thị ISSR có được trong

việc phân biệt các chủng P ginseng và P quinquefolius, cũng như trong việc

lập bản đồ gene và đánh giá mức độ bảo thủ

Thuan và cộng sự (2010) cũng đã sử dụng kỹ thuật RFLP với các mồi khuếch đại các vùng rDNA 18S và ITS cũng như kỹ thuật Random Amplified

Microsatellite (RAMS) để xác định 4 loài P ginseng, P quinquefolius, P

notoginseng và P vietnamensis[62].Kết quả cho thấy, vùng ITS được khuếch

đại với sản phẩm có kích thước như trông đợi ở tất cả các mẫu ngoại trừ P

ginseng mua tại Việt Nam.Dựa trên trình tự vùng ITS, tất cả các mẫu được

xác định là thuộc chi Panax Tuy nhiên, kết quả có được không thể sử dụng

để phân biệt các loài dựa trên trình tự gene 18S rRNA Phân tích RFLP trên

vùng ITS cho thấy hai mẫu thuộc P notoginseng không giống nhau, các tác

giả giải thích là do khác nhau về nguồn gốc, điều kiện trồng Ngoài ra, dựa

trên phân tích RFLP vùng ITS, các tác giả cho rằng 2 loài P ginseng và P

quinquefolius có quan hệ phát sinh gần Phân tích RFLP vùng 18S rRNA

cũng cho thấy các mẫu thuộc P ginseng mua ở Hàn Quốc là giống nhau hơn

những mẫu cùng loài này mua ở Việt Nam Kết quả phân tích RFLP dựa trên vùng 18S rRNA có mức độ tương đồng cao hơn dựa trên vùng ITS

Gần đây, Lee và cộng sự (2011) đã phát triển một chỉ thị SCAR dẫn xuất

từ ISSR để nhận dạng các chủng giống Sâm P ginseng để xác định sự phân

biệt các chủng nông nghiệp có đặc tính tốt phục vụ cho chọn giống [45] Các

tác giả đã khảo sát 80 mồi ISSR trên 6 mẫu thuộc P ginseng và 2 mẫu Nhân sâm nước ngoài thuộc hai loài P quinquefolius và P notoginseng 34 trong số

85 mồi SSR hình thành các locus đa hình với tần suất trung bình 6,9 locus/mồi Các mẫu kiểm tra được nhận thấy có khác biệt rõ ràng bằng cách sử dụng các mồi này Các mồi UBC-821, UBC-868 và UBC-878 làm nảy sinh các band đa

hình giữa các chủng P ginseng và cho phép phân biệt chúng với các mẫu P

quinquefolius và P notoginseng Thêm vào đó, đa hình đặc hiệu cho chủng

Nhân sâm Sunwon được hình thành bằng cách xử lý sản phẩm PCR bằng mồi

PgI821C650 với enzyme giới hạn Taq I Kết quả này là công cụ chỉ thị DNA

hữu ích để xác định Nhân sâm Hàn Quốc, đặc biệt là chủng Sunwon, quản lý hạt giống và các chương trình chọn giống được hỗ trợ bằng chỉ thị phân tử

1.3 Nghiên cứu bảo tồn và phát triển Sâm

Năm 1988, hội thảo quốc tế về bảo tồn thực vật hoang dại hữu ích được

tố chức ở Chiang Mai, Thái Lan đã đánh giá cao tầm quan trọng của thực vật hoang dại hữu ích trong chăm sóc sức khỏe ban đầu, giá trị kinh tế và tiềm năng của cây cỏ đối với việc tìm ra các loại thực phẩm và thuốc mới Đồng thời báo động về việc mất tính đa dạng sinh vật cây cỏ và có thể ảnh hưởng đến việc tìm kiếm loài hoang dại hữu ích mới mang lại lợi ích toàn cầu Nhằm bảo tồn các nguồn đa dạng sinh vật cũng như tạo ra và duy trì mối quan hệ hợp tác, bảo vệ quyền lợi của các quốc gia trong việc bảo tồn và phát triển các nguồn lợi đa dạng sinh vật, đã có 2 công ước toàn cầu được ký kết là Công ước đa dạng sinh học (CBD) và Công ước về chống buôn bán các loài động thực vật có nguy cơ bị tiêu diệt (CITES) Với công ước CBD, lần đầu tiên thế giới đã chuyển các nguồn tài nguyên sinh học từ một di sản chung của nhân loại thành tài sản quốc gia Mặc dù vậy, hoạt động bảo tồn đa dạng sinh học (trong đó có thực vật hoang dại hữu ích) đang gặp phải mối thách thức kép là: (i) mối thách thức của bản thân việc bảo tồn đa dạng sinh học, (ii) bảo vệ tri thức truyền thống về sử dụng các nguồn tài nguyên khỏi sự khai thác mang tính chất thương mại trong phạm vi quốc gia cũng như quốc tế, (iii) phát triển các sản phẩm từ đa dạng sinh học và bản quyền tri thức cộng đồng

Shi-Lia Zhou và cộng sự (2005) khi nghiên cứu về sự mất tính đa dạng

di truyền của loài P notoginsen, trong đó có sự so sánh với loài P

stipuleanatus đã đề nghị cần phải bảo tồn tại chỗ các quần thể mọc hoang dại

của loài P stipuleanatus, cũng như dựa vào bảo tồn tại vườn trồng các giống

khác nhau của loài P notogingseng (dẫn theo Phạm Thanh Huyền, 2007) Việc nghiên cứu trồng bảo tồn và phát triển loài P stipuleanatus ở Trung

Quốc cũng mới chỉ dừng lại ở mức đề xuất Mà chưa có các nghiên cứu gây trồng và phát triển cụ thể Đây cũng chính là một trong những tồn tại trong nghiên cứu nhân giống, gây trồng trên thế giới nhằm bảo tồn cũng như phát

triển nguồn gen loài P stipuleanatus

Qua các nghiên cứu về phân loại, đặc điểm hình thái, phân bố, đặc điểm sinh thái, giá trị sử dụng cũng như khả năng nhân giống, gây trồng và bảo tồn loài Sâm trên thế giới còn rất nhiền vấn đề tồn tại cần giải quyết Đặc biệt, việc nghiên cứu kỹ thuật nhân giống, gây trồng để bảo tồn và phát triển các loài Sâm vẫn còn là một khoảng trống Phần lớn các nghiên cứu mới chỉ dừng lại ở việc mô tả và phân loại, cũng như đánh giá đa dạng di truyền giữa

các loài trong chi Panax mà chưa có những nghiên cứu thực sự đi sâu vào vấn

đề kỹ thuật nhân giống, kỹ thuật lâm sinh trong việc gây trồng phát triển và

bảo tồn loài này

1.4 Tổng quan phương pháp nghiên cứu về phân loại thực vật

1.4.1 Các phương pháp dựa trên đặc điểm hình thái

Các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là hai đơn vị phân loại (taxon) càng

có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai taxon càng gần gũi với nhau Bất cứ sự khác nhau nào giữa hai cá thể đều được nghiên cứu, nhưng không phải bất cứ đặc điểm nào cũng có thể dùng làm đặc điểm phân loại Những đặc điểm phân loại ổn định, biến đổi chậm, liên quan đến những cấu trúc ít biến đổi của cơ thể sinh vật thường được sử dụng để phân biệt và xác định các taxon bậc cao, những biến đổi nhanh hoặc liên quan đến cơ chế cách ly sinh sản có tác dụng xác định các taxon bậc thấp Người ta thường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết quả so sánh

Mặc dù phương pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái có ưu điểm là tiện lợi, nhanh chóng, kinh tế, có thể so sánh các đặc điểm giữa các loài hoá thạch với các loài đang sống để tìm kiếm mối quan hệ họ hàng giữa chúng Nhưng việc lựa chọn và cân nhắc giá trị sử dụng của các đặc điểm phân loại là một trong những khâu khó nhất, không chỉ đòi hỏi kiến thức

mà còn đòi hỏi kinh nghiệm và sự khéo léo của các nhà phân loại học Bên cạnh đó, phương pháp này nhiều khi không chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt được các loài đồng hình.Mặt khác bởi hình thái chính là kết quả của biểu hiện gene trong một điều kiện ngoại cảnh nhất định nên việc hoàn toàn dựa vào hình thái đôi khi dẫn đến các kết quả không xác thực, nhất là đối với các taxon thực vật có mức

độ thường biến cao Các marker hình thái có nhiều điểm hạn chế như: các biến đổi hình thái không phát hiện được ở một số loài; các nghiên cứu sử dụng đặc điểm hình thái nói chung thường giới hạn trong một hay một vài locus; nhiều đặc điểm hình thái chỉ có thể quan sát được vào cuối chu kỳ sống; nhiều đặc tính hình thái không riêng biệt mà mang tính liên tục và chồng lấp giữa các loài gây trở ngại cho việc phân tích chính xác sự đa dạng di truyền của quần thể

1.4.2 Các phương pháp dựa trên chỉ thị phân tử

1.4.2.1 Các Marker phân tử dựa trên DNA

Các marker phân tử được sử dụng để đánh giá đa hình DNA được phân thành hai loại: marker dựa trên cơ sở lai phân tử và marker dựa trên cơ sở phản ứng chuỗi polymer hóa (PCR) Về mặt định dạng, đặc tính DNA có thể nhận ra thông qua việc lai các đoạn DNA được cắt giới hạn bằng enzymes phân giải với các DNA thăm dò (probe) được đánh dấu vốn là các đoạn DNA có nguồn

gốc hoặc trình tự đã biết Marker trên cơ sở PCR bao gồm việc khuếch đại in

vitro những trình tự DNA hay locus đặc trưng bằng cách sử dụng những trình

tự olygonucleotide trong vai trò là các mồi đặc hiệu hay ngẫu nhiên và một enzyme DNA polymerase bền nhiệt Các đoạn được khuếch đại được tách ra trên điện di và tạo các đặc trưng hình thành băng, các đặc trưng này vốn được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như nhuộm hay ghi phóng xạ tự động Những marker phân tử thường được sử dụng bao gồm:

Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn [Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)]

RFLP là một kỹ thuật áp dụng để phân biệt các sinh vật với nhau bằng cách phân tích các kiểu dẫn xuất hình thành từ việc cắt nhỏ DNA của chúng.RFLP có thể ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và phát sinh loài trên dải đối tượng từ các cá thể đến quần thể, từ trong loài đến các loài có quan hệ

họ hàng gần.RFLP được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu lập bản đồ gene bởi tính phong phú cao của chúng trên bộ gene, khả năng ứng dụng rộng của các enzymes cắt giới hạn khác nhau và sự phân bố ngẫu nhiên suốt bộ gene của các RFLP (Neale & Williams 1991)[51].RFLP cũng được sử dụng trong nghiên cứu khảo sát mối quan hệ giữa các bậc phân loại gần, hoặc sử dụng như một công cụ làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA (DNA fingerprinting), trong nghiên cứu về đa dạng di truyền lai, chuyển gene quan tâm vào sinh vật và bao gồm cả những nghiên cứu về dòng gene hay phân bố gene giữa các cây trồng Các marker RFLP cũng được sử dụng lần đầu trong việc xây dựng bản đồ di truyền bởi Botstein và cộng sự năm 1980, từ đó một

bộ các marker RFLP phát hiện được đã tạo nhiều cơ hội cho việc phát triển một bản đồ chi tiết ở rau diếp (Landry et al., 1987)[44]

DNA Đa hình khuếch đại ngẫu nhiên [Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)]

RAPD là một kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR Phương pháp được dựa trên

cơ sở sự khuếch đại các đoạn DNA mục tiêu hay ngẫu nhiên dưới tác động

của enzyme với các mồi tùy chọn, kỹ thuật này được Welsh và McClelland phát triển năm 1991 Trong phản ứng RAPD, một chủng loại mồi đơn sẽ gắn vào DNA bộ gene ở hai vị trí khác nhau trên hai mạch bổ sung của DNA khuôn mẫu Trung bình, mỗi mồi sẽ dẫn đến việc khuếch đại một vài locus riêng rẽ trên bộ gene, đó là cơ sở cho sự hữu dụng của RAPD cho việc sàng lọc một cách hiệu quả các đa hình trình tự nucleotide giữa các cá thể Tuy nhiên, vì tính ngẫu nhiên một cách tự nhiên trong việc khuếch đại DNA với các mồi có trình tự ngẫu nhiên, điều quan trọng là phải tối ưu hóa và duy trì điều kiện phản ứng cho việc nhân mạch đôi DNA

RAPD đã được sử dụng với nhiều mục đích, từ nghiên cứu ở mức độ cá thể (như xác định đa dạng di truyền) đến nghiên cứu liên quan đến những loài

họ hàng gần nhau.RAPD cũng đã và đang được ứng dụng vào việc nghiên cứu lập bản đồ gene để lấp đầy những lỗ hổng mà các markers khác chưa thực hiện được (Hadrys et al., 1992)[30]

Vi vệ tinh hay Trình tự lặp đơn giản [Microsatellites or Simple sequence Repeat (SSR)]

Microsatellite đặc biệtthích hợp để phân biệt các kiểu gene có quan hệ

họ hàng gần; bởi mức độ biến động cao của chúng, vì thế chúng được ưa thích khi sử dụng trong các nghiên cứu về quần thể và cho việc nhận dạng các chủng giống nông nghiệp có quan hệ gần Microsatellite thể hiện một tính đa hình cao nên chúng là những marker có thể được sử dụng trong nhiều nghiên cứu về di truyền quần thể cũng như các nghiên cứu quan hệ phát sinh từ mức

độ cá thể (như nhân dòng vô tính và xác định các dòng) đến mức độ những loài có quan hệ họ hàng gần Ngược lại, tỷ lệ đột biến cao của chúng làm cho chúng không thích hợp trong nghiên cứu phân biệt các taxon có quan hệ phát sinh xa nhau.Microsatellite được xem là các marker lý tưởng trong nghiên cứu lập bản đồ gene (Jarne & Lagoda 1996)[34].Marker SSR đã được chứng

minh tính hữu dụng cho việc đánh giá biến động di truyền trong chọn lọc các sinh vật (Mohammadi & Prasanna 2003)[49]

1.4.2.2 Sử dụng các trình tự DNA bảo tồn cao trong phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật

Hệ thống hóa là quá trình thăm dò, mô tả và giải thích tính đa dạng của thế giới sinh vật Vào năm 1758, Linnaeus đã xây dựng hệ thống phân loại mang tính thứ tự trước khi phát triển học thuyết tiến hóa Sự xuất hiện và phát triển của các kỹ thuật phân tử mà đặc biệt là phản ứng chuỗi polymer hóa - PCR (Mullis và Faloona, 1987) đã hình thành nên một lượng lớn các dữ liệu sẵn sàng cho việc giải trình tự DNA và các kỹ thuật làm nảy sinh đặc trưng nhận dạng DNA [50] Nhiều dạng đặc điểm mang tính thông tin, đặc biệt là các trình tự DNA đã được ứng dụng trong nghiên cứu mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở thực vật Các thực vật bậc cao mang trong nó ba bộ gene: bộ gene trong nhân, bộ gene ty thể và bộ gene lạp thể

bộ gene lục lạp tiến hóa nhanh hơn những vùng mã hóa Các đột biến ở DNA lục lạp thường là các thay thế nucleotide hay sự sắp xếp lại Các đột biến tăng đoạn hay mất đoạn tích lũy trong vùng không mang mã xảy ra với tỷ lệ ngang với sự thay thế nucleotide và chính kiểu đột biến này làm tăng cường tính đa dạng của các vùng không mang mã Phần lớn các gene lục lạp là loại gene

đơn bản trong khi các gene trong nhân là thành viên của những họ đa gene Tính bảo tồn cao của DNA lục lạp thực sự là ưu thế khi sử dụng nó để xây dựng lại mối quan hệ phát sinh và quá trình tiến hóa ở các mức độ từ loài đến chi và đến họ thực vật.Có thể thấy những gene mã hóa và không mã hóa ở lục lạp thường được sử dụng trong nghiên cứu quan hệ phát sinh như sau:

Các trình tự bảo thủ ở bộ gene trong nhân

Bộ gene trong nhân có kích thước lớn nhất trong số ba bộ gene ở thực vật (1.1 × 106 đến 110 × 106 kbp) và bao gồm rất nhiều gene Phần lớn các nỗ lực nghiên cứu về quan hệ phát sinh bằng chỉ thị phân tử sử dụng các trình tự DNA ribosome trong nhân Cấu trúc căn bản của DNA ribosome là một đơn

vị lặp đơn, mỗi đơn vị như thế có thể lặp lại đến hàng ngàn lần trong bộ gene

Bộ gene trong nhân chứa một vùng sao mã có cấu trúc bao gồm khoảng trống bên ngoài vùng sao mã, tiếp theo là gene 18S mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ và gene 26S mã hóa cho tiểu đơn vị lớn vốn phân cách nhau bởi một gene nhỏ hơn là 5,8S Các khoảng trống trong vùng phiên mã (ITS1 và ITS2) tách rời những gene vừa đề cập Chiều dài của ba vùng mang mã là giống nhau ở các thực vật: gene 18S là khoảng 1800bp, 26S là khoảng 3300bp và gene 5,8S là khoảng 160bp Ngược lại, chiều dài của các khoảng trống giữa các gene biến động từ 1 đến 8kb Họ gene rDNA chứa các vùng bảo tồn cao như 18S, 26S

có thể sử dụng để suy luận các quan hệ phát sinh ở các mức độ phân loại cao.Các đoạn tiến hóa nhanh như các vùng ITS có thể là thích hợp nhất trong

so sánh các loài và những chi gần nhau, thậm chí là so ở mức độ các quần thể

Các trình tự 18S rDNA thường được sử dụng rộng rãi hơn các trình tự 26S.Cho dù cả hai vùng cùng được có dải ứng dụng rộng như nhau nhưng kích thước trên 3000bp của 26S rDNA đã cản trở các nhà nghiên cứu, đặc biệt

là trong việc giải trình tự toàn bộ gene.Trái lại, kích thước của 18S rDNA khoảng 1800bp giúp cho nó được ưu tiên lựa chọn hơn để khuếch đại bằng

PCR và giải trình tự.Thực tế cho thấy hình thể cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự 18S rDNA khá đồng dạng với cây quan hệ phát sinh sử dụng trình tự

rbcL ở nhiều mức độ phân loại ở thực vật hạt kín.Cho dù rất có tiềm năng

trong việc xây dựng cây quan hệ phát sinh ở thực vật, vùng 18S rDNA vẫn chưa được tận dụng trong hệ thống học thực vật hạt kín

Gene 26S rDNA thường được lưu ý là ứng viên cho việc thay thế gene 18S rDNA Khi so sánh có thể nhận thấy toàn bộ gene 26S rDNA tiến hóa nhanh gấp từ 1,6 đến 2,2 lần và cung cấp các đặc điểm mang tính thông tin nhiều hơn 3 lần so với 18S rDNA

Gene 5,8S rDNA dễ dàng được khuếch đại và giải trình tự khi sử dụng các mồi định vị trên các gene 18S và 26S rDNA Gene 5,8S rDNA hiếm khi được sử dụng để suy luận quan hệ phát sinh bởi tính bảo thủ cao và kích thước bé (164-165bp) Tỷ lệ các vị trí mang thông tin tiềm năng cho phân tích quan hệ phát sinh ở thực vật có hạt cũng tương đương với gene 18S rDNA

Vùng ITS: ITS1 phân cách gene 18S rDNA với gene 5,8S rDNA còn ITS 2 phân cách gene 5,8S rDNA với gene 26S rDNA Vùng ITS hiện hữu một cách rộng rãi dưới 700bp ở các thực vật có hoa (Baldwin et al., 1995)[15].Vùng ITS chứa các trình tự bảo tồn cao nên rất nhiều mồi tổng thể được thiết kế cho việc khuếch đại và giải trình tự đã được mô tả.Các trình tự ITS1 và ITS2 vốn giàu GC làm cho việc giải trình tự trở nên khó khăn Khó khăn trong việc giải trình tự biến động theo các nhóm thực vật và việc cho thêm DMSO vào PCR hay phản ứng giải trình tự là việc bổ sung mang lại hiệu quả cao Việc căn trình tự ITS từ nhiều họ thực vật hạt kín chỉ ra rằng các trình tự ITS1 và ITS2 đa dạng hơn trình tự của các gene rDNA Các trình

tự ITS biến động một cách hiệu quả cho phép giải quyết những câu hỏi về quan hệ phát sinh ở những taxon có quan hệ họ hàng gần Theo đó, rất nhiều các bài báo thể hiện sự thành công trong việc xây dựng lại lịch sử tiến hóa sử

dụng các trình tự ITS(Bellarosa et al., 2005) [16] Hơn nữa, vùng ITS được di truyền theo kiểu từ cả cha và mẹ khiến cho nó cũng có thể được sử dụng để thăm dò sự lai chéo

Hình 1.1: Sơ đồ vùng ITS của các gen rDNA vùng nhân và vị trí

của các mồi ITS(Embong et al., 2008) [25]

Chương II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu là 25 mẫu Sâm được thu thậpở các

xã Pa Vệ Sử, Thu Lũm và Ka Lăng của huyện Mường Tè; Sìn Hồ; Tam Đường và Phong Thổ tỉnh Lai Châu

Thời gian thu mẫu: từ tháng 5/2017 đến tháng 6/2017

Bảng 2.1 Danh sách 25 mẫuSâm

STT Ký hiệu mẫu Tên mẫu Địa điểm thu thập

1 AS02 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

3 LNT3 Sâm Lai Châu Phong Thổ

4 LNT4 Sâm Lai Châu Phong Thổ

5 PX9 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

6 PXA3 Sâm Lai Châu Tam Đường

7 PX13 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

8 PX14 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

9 PX15 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

10 MX5 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

11 MX4 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

12 MX1 Sâm lai châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

13 PT3 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

14 PKL1 Sâm lai châu Ka Lăng - Mường Tè

15 PT10 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

16 PT19 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

17 PTPX3 Sâm Lai Châu tím Pa Vệ Sử - Mường Tè

18 PTPX2 Sâm Lai Châu tím Pa Vệ Sử - Mường Tè

19 PT7 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

20 SLC2 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

21 SLC3 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

22 SLC6 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

23 SLC9 Sâm Lai Châu Pa Vệ Sử - Mường Tè

24 PX10 Sâm Lai Châu Thu Lũm - Mường Tè

25 PTH1 Sâm Lai Châu Sìn Hồ

2.2 Hóa chất

Một số hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử của các hãng Sigma, Merck, CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, Agarose, kit Qiagen, các mồi ITS

Bảng 2.2 Danh sách các mồi ITS sử dụng trong nghiên cứu

Quy trình:

Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C

Nghiền 0,3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu sâm, chày, cối được giữ trước ở - 800C)