Khảo Sát Độ Nhiễm Khuẩn Và Khả Năng Kháng Kháng Sinh Của Pseudomonas Aeruginosa Phân Lập Trong Nước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP HCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - THỰC PHẨM - MÔI TRƯỜNG - - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHÁNG SINH CỦA PSEUDOMONAS AERUGINOSA PHÂN LẬP TRONG NƯỚC UỐNG ĐƯỢC KIỂM NGHIỆM TẠI VIỆN PASTEUR THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn: TS BS CAO HỮU NGHĨA Họ tên sinh viên: KHANG BẢO KHÁNH Mã số sinh viên: 1211100099 Lớp: 12DSH02 Thành phố Hồ Chí Minh, 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan báo cáo nghiên cứu riêng Các số liệu kết đồ án tốt nghiệp có để bàn luận trung thực, không chép đồ án, khóa luận tốt nghiệp khác hình thức Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm với lời cam đoan Sinh viên thực Khang Bảo Khánh LỜI CẢM ƠN Đồ án tốt nghiệp hoàn thành với giúp đỡ tận tình, quý báu từ Thầy cô, Anh chị Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc đến: TS BS Cao Hữu Nghĩa, Trưởng khoa Xét nghiệm Sinh Học lâm Sàng, Viện Pasteur Thành Phố Hồ Chí Minh tận tâm hướng dẫn giúp đỡ suốt thời gian thực đồ án tốt nghiệp Quý Thầy, Cô giảng viên Khoa Công Nghệ Sinh Học - Thực Phẩm Mơi Trường, Trường Đại Học Cơng Nghệ TP Hồ Chí Minh tận tình dạy dỗ, truyền đạt kiến thức quý báu cho suốt thời gian học tập trường ThS Nguyễn Thị Nguyệt ThS Vũ Lê Ngọc Lan, khoa Xét nghiệm Sinh học lâm sàng, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh nhiệt tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức giúp đỡ tơi hồn thành đồ án Các Cơ, Anh Chị Phòng Vi sinh Nước – Thực phẩm Phòng Vi sinh Bệnh Phẩm, Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành đồ án tốt nghiệp Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Ba Mẹ nuôi dạy, yêu thương, động viên chỗ dựa vững cho Sinh viên thực Khang Bảo Khánh MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii DANH MỤC SƠ ĐỒ, QUY TRÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu 2.1 Mục tiêu tổng quát 2.2 Mục tiêu cụ thể CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nhiễm khuẩn nước uống 1.1.1 Trong nước 1.1.2 Thế giới 1.2 Tình hình kháng kháng sinh P aeruginosa 1.2.1 Trong nước 1.2.2 Trong nước 1.3 Khái quát Pseudomonas aeruginosa 1.3.1 Hình thái cấu trúc 1.3.2 Đặc điểm 1.3.3 Khả đề kháng .10 1.3.4 Kháng nguyên .11 1.3.5 Các yếu tố độc lực 11 1.3.6 Khả gây bệnh .13 1.3.7 Phòng bệnh 14 1.3.8 Điều trị 14 i 1.4 Kháng sinh chế kháng kháng sinh vi khuẩn 15 1.4.1 Giới thiệu kháng sinh .15 1.4.2 Cơ chế tác động kháng sinh 16 1.4.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn 17 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 21 2.2 Đối tượng nghiên cứu 21 2.3 Cỡ mẫu 21 2.4 Thiết bị, hóa chất, mơi trường 21 2.4.1 Thiết bị dụng cụ 22 2.4.2 Hóa chất, mơi trường thí nghiệm 23 2.5 Phương pháp thực 21 2.5.1 Nguồn mẫu 25 2.5.2 Đánh giá kết 25 2.5.3 Xử lý số liệu 26 2.5.4 Phương pháp định lượng P aeruginosa nước uống 26 2.5.5 Phương pháp thực kháng sinh đồ 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nước uống 36 3.1.1 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nước uống 36 3.1.2 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa loại nước uống 36 3.1.2.1 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nhóm nước uống 36 3.1.2.2 Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa loại nước uống .36 3.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa nước uống 36 3.2.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa nước uống 36 3.2.2 Tỷ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa loại nước uống .38 3.2.3 Tỷ lệ đa kháng kháng sinh P aeruginosa loại nước uống .42 ii 3.4 Thảo luận 43 3.4.1 Tình hình nhiễm P aeruginosa nước uống 45 3.4.2 Tình hình kháng kháng sinh P aeruginosa nước uống .45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHI 49 4.1 Kết luận 49 4.1 Kiến nghị 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 55 iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Brain - heart infusion BYT Bộ Y Tế CFU Colony - Forming Unit CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute DNA Deoxyribonucleic acid E.coli Escherichia coli kDa Kilodalton QCVN Quy chuẩn Việt Nam S Susceptible I Intermediate R Resistant ISO International Organization for Standardization MH Mueller Hinton NA Nutrient agar NUĐC Nước uống đóng chai NUCT Nước uống cơng ty NUTH Nước uống trường học NUGĐ Nước uống gia đình RNA Ribonucleic acid PBP Penicillin binding proteins P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa QCVN Quy chuẩn Việt Nam TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam UV Ultra Violet VSATTP Vệ sinh an toàn thực phẩm iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Số mẫu nước uống phân tích 22 Bảng 2.2: Chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật nước uống áp dụng theo QCVN 6-1:2010/BYT 25 Bảng 2.3: Các kháng sinh thử nghiệm kháng sinh đồ 29 Bảng 3.1: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nước uống 33 Bảng 3.2: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nhóm nước uống đóng chai nhóm nước uống xử lý 34 Bảng 3.3: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa loại nước uống 35 Bảng 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống 36 Bảng 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống đóng chai 38 Bảng 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống công ty 39 Bảng 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống trường học 40 Bảng 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống gia đình 41 Bảng 3.9: Tỷ lệ đa kháng kháng sinh chủng P aeruginosa loại nước uống 42 Bảng 3.10: So sánh tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nước uống 43 Bảng 3.11: So sánh tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nhóm nước uống 43 Bảng 3.12: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa loại nước uống 44 Bảng 3.13: So sánh tỷ lệ kháng kháng sinh P aeruginosa nước uống 46 v DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nước uống 33 Biểu đồ 3.2: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nhóm nước uống 34 Biểu đồ 3.3: Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa loại nước uống 35 Biểu đồ 3.4: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống 37 Biểu đồ 3.5: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống đóng chai 38 Biểu đồ 3.6: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống công ty 39 Biểu đồ 3.7: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống trường học 40 Biểu đồ 3.8: Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng P aeruginosa nước uống gia đình 41 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Pseudomonas aeruginosa Hình 2.1: Thiết bị lọc vi sinh vật với vị trí đặt phễu lọc 23 Hình 2.2: Tủ ấm 23 Hình 2.3: Đèn UV 24 Hình 2.4: Tủ an tồn sinh học cấp 24 Hình 2.5: Đĩa mơi trường Mueller Hinton đĩa kháng sinh 30 vii Đồ án tốt nghiệp [17] Clemens Kittinger, Michaela Lipp, Rita Baumert, Bettina Folli, Günther Koraimann, Daniela Toplitsch, Astrid Liebmann, Andrea J Grisold, Andreas H Farnleitner, Alexander Kirschner and Gernot Zarfel Antibiotic Resistance Patterns of Pseudomonas spp isolated from the River Danube Front Microbiol 7:586, 2016 [18] Deanna, L., Kiska, Peter, H., Gilligan Pseudomonas aeruginosa In Manual of clinical microbiology Patrick R Murray (Ed.), ASM Press, Washington D.C., 2003 [19] Ghazi M Al - Maliki, Rajaa Abdul - Kadem Haneff (2012), Studies on Pseudomonas aeruginosa in drinking water from water suppliers consumed in Basra University of Basrah, Iraq [20] Jonathan K Lutz, Jiyoung Lee (2011) Prevalence and Antimicrobial-Resistance of Pseudomonas aeruginosa in Swimming Pools and Hot Tubs Int J Environ Res Public Health 2011, 8, 554-564 [21] ISO 16266:2006, Water quality - Detection and enumeration of Pseudomonas aeruginosa - Method by membrane filtration [22] Lateef A, Oloke J K., Gueguimkana E B (2005) The prevalence of bacterial resistance in clinical, food, water and some environmental samples in Southwest Nigeria Environmental Monitoring and Assessment, 100: 59–69 [23] Mohammadi Kouchesfahani Alimohammadi, Nabizadeh Nodehi, Aslani, Rezaie, Asadian Pseudomonas aeruginosa and Heterotrophic Bacteria Count in Bottled Waters in Iran Iran J Public Health 2015 Nov;44(11):1514-9 [24] Clinical & Laboratory Standards Institute Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement, 2015 [25] Rusin PA, Rose JB, Haas CN, Gerba CP Risk assessment of opportunistic bacterial pathogens in drinking water Rev Environ Contam Toxicol 1997;152:57-83 53 Đồ án tốt nghiệp Trang web : [26] http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/data/news/2009/4/6470/nhiem-khuankhang-sinh.htm [27] http://vietnamnet.vn/vn/bao-ve-nguoi-tieu-dung/79538/nuoc-uong-dong-chainhiem-khuan-mu-xanh.html [28] http://antoanthucpham.quangtri.gov.vn/index.php/vi/news/Tin-tuc-su-kien/Thuctrang-nguyen-nhan-nhiem-Pseudomonas-Aeruginosa-trong-nuoc-uong-dongchaiThuc-trang-nguyen-nhan-nhiem-Pseudomonas-Aeruginosa-trong-nuoc-uongdong-chai-629/ [29] http://congannghean.vn/kinh-te-xa-hoi/201511/than-trong-voi-nuoc-dong-chainhiem-khuan-647278/ [30] http://nhipcauduoclamsang.blogspot.com/2016/04/tinh-hinh-khang-thuoc-khangsinh-hien.html [31] http://www.benhvien103.vn/vietnamese/bai-giang-chuyen-nganh/vi-sinhvat/pseudomonas-aeruginosa-whitmore/1176/ [32] http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/TinTuc/tintuc/Lists/Posts/Post.aspx?C ategoryId=1&ItemID=1398&PublishedDate=2009-05-26T00:00:00Z 54 Đồ án tốt nghiệp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Mơi trường hóa chất Môi trường Pseudomonas agar - Gelatin pepton 16,0g - Casein hydrolysat 10,0 g - KH2SO4 10,0 g - MgCl2 1,4 g - Glyxerol 10 ml - Agar 11-18 g - Nước 000 ml - cetrimid 0,2 g - Axit nalidixic 0,015 g Môi trường King’s B - Gelatin pepton 20,0 g - Glyxerol 10 ml - K2HPO4 1,5 g - MgSO4.7H2O 1,5 g - Agar 15,0 g - Nước cất 000 ml Acetamide broth Dung dịch A - KH2PO4 1,0 g - MgSO4 0,2 g - Acetamid 2,0 g - NaCl 0,2 g - Nước 900 ml - pH 7,0 ± 0,5 25 oC 55 Đồ án tốt nghiệp Dung dịch B - Na2MoO4.2H2O 0,5 g - FeSO4.7H2O 0,05 g - Nước 100 ml - Để chuẩn bị môi trường acetamide broth, thêm ml dung dịch B vào 900 ml dung dịch A Que thử Oxydase - N,N,N’,N’ Tetramethyl – p – phenylenediamine dihydrochlride 56 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 2: Một số hình ảnh trình thử nghiệm Hình 1: Khuẩn lạc P aeruginosa môi trường Pseudomonas agar phát huỳnh quang đèn UV Hình 2: Phản ứng sinh ammoniac dương tính thử nghiệm oxydase 57 Đồ án tốt nghiệp Hình 3: Kết định danh P aeruginosa kit API 10S Hình 4: Kết sau đặt đĩa giấy kháng sinh (trước sau ủ) 58 Đồ án tốt nghiệp Hình 5: Kết kháng sinh đồ của số chủng P aeruginosa 59 Đồ án tốt nghiệp Phụ lục 3: Xử lý số liệu thống kê Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nhóm (nước uống đóng chai) nhóm (nước xử lý dùng để uống) Table of NHOM by TYLE NHOM TYLE Frequency Expected Cell Chi-Square Percent DAT KHONGDAT Total NHOM1 44 50 42.5 7.5 0.0529 0.3 22.00 3.00 25.00 126 24 150 127.5 22.5 0.0176 0.1 63.00 12.00 75.00 170 30 200 85.00 15.00 100.00 NHOM2 Total Statistics for Table of NHOM by TYLE Statistic DF Value Prob Chi-Square 0.4706 0.4927 Likelihood Ratio Chi-Square 0.4902 0.4839 Continuity Adj Chi-Square 0.2092 0.6474 Mantel-Haenszel Chi-Square 0.4682 0.4938 Phi Coefficient 0.0485 Contingency Coefficient 0.0485 Cramer's V 0.0485 Chi-Square có p = 0.4927 > 0.05 → khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 60 Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa loại nước uống Table of LOAINUOC by TYLE LOAINUOC TYLE Frequency Expected Cell Chi-Square Percent DAT KHONGDAT Total NUDC 44 50 42.5 7.5 0.0529 0.3 22.00 3.00 25.00 37 13 50 42.5 7.5 0.7118 4.0333 18.50 6.50 25.00 46 50 42.5 7.5 0.2882 1.6333 23.00 2.00 25.00 43 50 42.5 7.5 0.0059 0.0333 21.50 3.50 25.00 170 30 200 85.00 15.00 100.00 NUCT NUTH NUGD Total Statistics for Table of LOAINUOC by TYLE Statistic DF Value Prob Chi-Square 7.0588 0.0700 Likelihood Ratio Chi-Square 6.7122 0.0817 Mantel-Haenszel Chi-Square 0.2809 0.5961 Phi Coefficient 0.1879 Contingency Coefficient 0.1846 Cramer's V 0.1879 Chi-Square có p = 0.07 > 0.05 → khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê 61 Đồ án tốt nghiệp Tỷ lệ nhiễm P aeruginosa nước uống năm 2012 – 2016 Table of NAM by TYLE NAM TYLE Frequency Expected Cell Chi-Square Percent DAT KHONGDAT Total NAM2012 279 121 400 299.33 100.67 1.3812 4.1071 46.50 20.17 66.67 170 30 200 149.67 50.333 2.7624 8.2141 28.33 5.00 33.33 449 151 600 74.83 25.17 100.00 NAM2016 Total Statistics for Table of NAM by TYLE Statistic DF Value Prob Chi-Square 16.4648