Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen liên quan ở các chủng salmonella đa kháng tt

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… NGUYỄN THANH VIỆT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 9420107 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Hà Nội - 2020 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: GS.TS Nghiêm Ngọc Minh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Võ Thị Bích Thủy Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … giờ’, ngày … tháng … năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng bệnh từ thực phẩm lớn Theo đó, năm khoảng 10 người có người bị bệnh Bệnh từ thực phẩm tiến triển nghiêm trọng, đặc biệt trẻ nhỏ, người già người suy giảm miễn dịch Trong số bệnh thực phẩm gây tiêu chảy phổ biến sử dụng thực phẩm khơng an tồn, 550 triệu người bị bệnh năm, có 220 triệu trẻ em tuổi Salmonella nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy toàn cầu Khả kháng kháng sinh Salmonella tăng lên nhanh chóng trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe lồi người Salmonella kháng kháng sinh gây khó khăn cho việc kiểm sốt nhiễm khuẩn, dự phòng điều trị bệnh Do vậy, việc phân lập xác định đặc điểm kháng kháng sinh Salmonella từ thực phẩm việc làm cần thiết Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh Salmonella cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm sốt bệnh tật kiểm sốt nhiễm thực phẩm quy định sử dụng kháng sinh điều trị chăn nuôi nhằm hạn chế khả kháng kháng sinh vi khuẩn Ở Việt Nam nay, chưa có nghiên cứu phân tích nhóm gen vi khuẩn Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập từ thực phẩm cơng nghệ giải trình tự hệ Nghiên cứu nhóm gen giúp hiểu biết sâu dịch tễ học phân tử gen kháng kháng sinh Quan trọng phát đột biến gen kháng kháng sinh gây tính kháng kháng sinh Salmonella Ngồi tìm nhóm gen có khả gây nên tính kháng kháng sinh lồi vi khuẩn Theo tổ chức Nông lương Liên Hiệp Quốc, Việt Nam quốc gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, thịt gia cầm tăng lên nhanh kể từ năm 1993 trở lại dự báo tăng lên đáng kể năm Vì vậy, luận án thực với mục tiêu nội dung sau: Mục tiêu nghiên cứu luận án • Phân lập định danh chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, thịt gà chợ bán lẻ khu vực Hà Nội • Xác định đặc điểm kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập • Phân tích nhóm gen chủng Salmonella đa kháng kháng sinh Các nội dung nghiên cứu luận án • Ni cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ mẫu thịt thu thập chợ địa bàn Hà Nội, lựa chọn mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella • Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ lựa chọn chủng Salmonella đa kháng kháng sinh • Giải trình tự gen hệ số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích nhóm gen liên quan Xác nhận số kết phương pháp giải trình tự gen Sanger CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học Salmonella Salmonella trực khuẩn Gram âm, di động, khơng có vỏ khơng sinh bào tử Salmonella dễ ni, vừa ưa khí vừa kỵ khí, mọc số mơi trường có chất ức chế chọn lọc XLD Trong môi trường XLD, khuẩn lạc Salmonella thường có màu đỏ, có màu đen Salmonella có sức đề kháng cao ngoại cảnh, nhiên nhạy cảm với nhiệt độ, bị tiêu diệt từ 700C trở lên Salmonella có loại kháng nguyên kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên Vi Ngày nay, Salmonella phân thành hai loài S bongori S enterica Trong đó, S enterica chia thành loài là: I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) VI (indica) 1.2 Đặc điểm hệ gen Salmonella 1.2.1 Cấu trúc hệ gen Kích thước hệ gen Salmonella khác (3,39-5,59 Mb) Số gen trung bình 4.742 Salmonella có từ đến plasmid kích thước từ 2-200 kb S enterica cần khoảng 3.499 gen S bongori cần khoảng 3.368 gen để đảm bảo cho trình sinh trưởng bình thường Hệ gen Salmonella có độ tương đồng từ 65% đến 99%, có tính bảo thủ cao biến đổi chỉ tập trung vào số vùng đặc biệt Có khoảng 2.800 họ gen có mặt tất Salmonella tổng số họ gen tất serovar khoảng 10.000 1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh Salmonella Salmonella thường đề kháng số nhóm kháng sinh phổ biến aminoglycoside, β- lactam, chloramphenicol, quinolone, tetracycline, sulfonamide trimethoprim Nhóm Aminoglycoside Salmonella sử dụng chế biểu enzyme để biến đổi aminoglycoside qua trung gian plasmid để đề kháng aminoglycoside Các enzyme phân loại thành ba nhóm đặt tên dựa phản ứng mà chúng thực acetyltransferase, phosphotransferase nucleotidyltransferase Nhóm β-lactam Ở Salmonella, tiết β-lactamase chế đề kháng kháng sinh β-lactam phổ biến Các enzyme hoạt động cách thủy phân vòng cấu trúc β-lactam, tạo β amino acid khơng có hoạt tính kháng khuẩn Hiện người ta tìm 340 gen mã hóa enzyme β-lactamase Kháng sinh chloramphenicol (C) Chloramphenicol chất ức chế tổng hợp protein cách liên kết với trung tâm peptidyltransferase đơn vị 50S ribosome Có hai chế đề kháng C Salmonella là: (i) enzyme chloramphenicol acetyltransferases gen kháng chloramphenicol cm1A (ii) kênh bơm thải C Nhóm Quinolone Đề kháng quinolone Salmonella phân thành chế Một đột biến gen gyrA, gyrB mã hóa enzyme DNA gyrase gen parC mã hóa enzyme topisomerase IV, hai tăng biểu kênh bơm thải thuốc AcrAB-TolC Sự kết hợp nhiều đột biến tạo khả đề kháng quinolon đột biến đơn lẻ Kháng sinh tetracycline (TE) Cơ chế kháng tetracycline Salmonella hệ thống kênh bơm thải thuốc, kênh làm giảm nồng độ tetracycline tế bào Hiện người ta xác định 46 gen đề kháng TE Sulfonamide/trimethoprim (SXT) Những loại kháng sinh có hoạt tính kìm khuẩn chế hoạt động ức chế cạnh tranh enzyme tham gia vào trình tổng hợp tetrahydrofolic acid Sulfonamide ức chế enzyme dihyrdropteroate synthetase, trimethoprim ức chế reductase dihydrofolate Khả đề kháng Salmonella với sulfonamide diện gen sul Ngồi gen dhfr dfr 1.2.3 Liên quan đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh vi khuẩn Mối quan hệ đột biến gen thay đổi kiểu hình kháng kháng sinh chưa làm sáng tỏ Mối quan hệ lúc đơn giản quan hệ nhân Thường nhiều đột biến tạo kiểu hình đề kháng loại kháng sinh Nhìn chung, mối quan hệ phức tạp khả kháng kháng sinh đột biến gen chưa rõ ràng 1.2.4 Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc (efflux pumps) Các kênh bơm thải thuốc khơng có khả đào thải lượng lớn loại kháng sinh mà tạo chế kháng kháng sinh khác cách làm giảm nồng độ kháng sinh tế bào thúc đẩy q trình tích tụ đột biến Biểu hệ thống kênh bơm thải thuốc vi khuẩn có liên quan đến tính kháng kháng sinh chúng lâm sàng 1.3 Tình hình nhiễm kháng kháng sinh Salmonella thực phẩm 1.3.1 Trên giới Đã có nhiều nghiên cứu khác tỷ lệ ô nhiễm Salmonella thực phẩm công bố khắp nơi giới Nhìn chung, kết nghiên cứu cho thấy chủng Salmonella phân bố khác tùy theo khu vực địa lý theo nguồn thực phẩm Các type huyết phổ biến khác theo vùng địa lý tỷ lệ đề kháng kháng sinh chúng tăng lên hàng năm 1.3.2 Tại Việt Nam Các công bố gần cho thấy nguồn thực phẩm Việt Nam nhiễm Salmonella với tỷ lệ khác nhau, có nhiều loài đa kháng kháng sinh Tỷ lệ nhiễm Salmonella thực phẩm tỷ lệ đa kháng kháng sinh loài Salmonella phân lập tăng lên hàng năm Vì việc tiến hành phân lập xác định đặc điểm kháng kháng sinh Salmonella loại thực phẩm khu vực địa lý vào khoảng thời gian khác cần thiết 1.4 Một số kỹ thuật sử dụng phổ biến nghiên cứu biểu gen Hiện người ta thường sử dụng bốn kỹ thuật Reverse transcription PCR (RT-PCR), Real-time PCR (qPCR), Microarray, giải trình tự gen hệ (NGS) để nghiên cứu biểu gen Trong số kỹ thuật giải trình tự hệ có ưu điểm cả, kỹ thuật khắc phục nhược điểm ba kỹ thuật lại kỹ thuật có khả phát gen Giải trình tự hệ mới NGS phương pháp đo trực tiếp trình tự nucleic acid có mặt mẫu nghiên cứu Số lượng trình tự tuyến tính với nồng độ trình tự nucleic acid có mặt mẫu nghiên cứu Hơn nữa, NGS không phụ thuộc vào thông tin trình tự nucleic acid biểu mẫu nghiên cứu, không phụ thuộc vào gen tương đồng cao Do phát gen Trong số công nghệ giải trình tự hệ thì công nghệ Illumina tạo liệu có độ xác cao nhất, quy trình làm thí nghiệm đơn giản, ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác Hiện nay, 90% liệu trình tự giới tạo công nghệ Illumina CHƯƠNG VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 2.1.1 Nguyên liệu Tổng số 90 mẫu thịt, gồm 30 mẫu thịt lợn (được ký hiệu từ TL-1 đến TL-30), 30 mẫu thịt gà (được ký hiệu từ TG-1 đến TG-30), 30 mẫu thịt bò (được ký hiệu từ TB-1 đến TB-30), thu thập ngẫu nhiên 10 chợ Hà Nội 2.1.2 Mơi trường, hóa chất, kháng sinh, bợ kit Môi trường nuôi cấy, kháng sinh, kit sử dụng cung cấp hãng có uy tín giới 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu Các thiết bị sử dụng sở nghiên cứu uy tín nước như: Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, Viện Bỏng Quốc Gia, Học viện Quân y 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu Các mẫu lấy theo tiêu chuẩn TCVN 4833-2002 Thời gian từ 7-8 sáng mùa đông, từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2016 2.2.2 Định danh Salmonella Định danh Salmonella theo quy trình ISO 6579:2002 2.2.3 Kháng sinh đồ Phương pháp khoanh giấy khuếch tán Kirby-Bauer 2.2.4 Giải trình tự hệ mới Lựa chọn số chủng Salmonella đa kháng để giải trình tự hệ phiên mã cơng nghệ giải trình tự gen hệ Illumina 2.2.5 Nhóm phương pháp tin sinh học Chất lượng trình tự kiểm tra phần mềm FastQC Các trình tự adapter trình tự xấu cắt bỏ phần mềm Trimmomatic 0.32 Trình tự tinh điểm chất lượng Q20 lắp ráp de novo phần mềm Geneious R11 Trình tự de novo thích chức gen sở liệu khác như: RAST, PATRIC 3.5.2, BASys, phần mềm Geneious R11 Xác định gen kháng kháng sinh sở liệu: ResFinder, ARG7 ANNOT, CARD, PATRIC 3.5.2 Xác định đột biến gen đề kháng kháng sinh nhóm quinolone công cụ ResFinder 2.2.6 Xác nhận kết đột biến gen kháng kháng sinh phương pháp giải trình tự gen Sanger Để xác khẳng định kết dự đoán đột biến gen kháng kháng sinh thu từ phương pháp giải trình tự gen hệ mới, đột biến gen liên quan đến kháng kháng sinh nhóm quinolone kiểm tra phương pháp giải trình tự gen Sanger từ cDNA mẫu nghiên cứu 2.2.7 Xử lý thống kê Sử dụng phần mềm SPSS 16.0 để tính giá trị χ2, Fisher exact test, giá trị p CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Phân lập định danh type chủng Salmonella nghiên cứu 3.1.1 Kết phân lập Salmonella Từ kết tăng sinh không chọn lọc, tăng sinh chọn lọc khẳng định sinh hóa, chúng tơi thu chủng Salmonella từ mẫu nghiên cứu Kết trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1 Kết phân lập chủng Salmonella mẫu nghiên cứu Mẫu Tởng sớ Dương tính Âm tính mẫu Sớ mẫu Tỷ lệ (%) Số mẫu Tỷ lệ (%) Thịt gà 30 11 36,7 19 63,3 Thịt lợn 30 30,0 21 70,0 Thịt bò 30 16,7 25 83,3 Tổng số 90 25 27,8 65 72,2 χ2 = 3,102; df = 2; p = 0,212 sinh chăn nuôi điều trị khác vùng, điều làm tăng áp lực chọn lọc, dẫn tới xuất tồn vi khuẩn kháng kháng sinh với tỷ lệ khác Số lượng mẫu nghiên cứu (25 mẫu) Vì cần tiến hành nghiên cứu tỷ lệ đề kháng tỷ lệ đa kháng kháng sinh với số lượng mẫu lớn 3.2.2 Số lượng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập Xác định tỷ lệ kháng kháng sinh Salmonella theo nguồn phân lập giúp đánh giá chi tiết đặc điểm kháng kháng sinh chúng theo nguồn thực phẩm Kết nghiên cứu cho thấy Salmonella phân lập từ thịt lợn đề kháng nhiều kháng sinh nhất, với tỷ lệ 66,7% (6/9 chủng), 44,4% (4/9 chủng) đa kháng kháng sinh Tiếp theo chủng phân lập từ thịt gà với tỷ lệ 36,4% (4/11 chủng) 27,3% (3/11 chủng) đa kháng Chỉ có chủng S Typhimurium từ thịt bò kháng kháng sinh chủng đa kháng S Typhimurium chiếm tỷ lệ lớn ba nguồn phân lập (11 chủng), chỉ có chủng kháng kháng sinh đồng thời chủng đa kháng 3.2.3 Số lượng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập Việc xác định khả kháng kháng sinh Salmonella theo nguồn phân lập giúp đánh giá chi tiết đặc điểm kháng kháng sinh chúng theo nguồn thực phẩm Theo đó, tất Salmonella phân lập từ thịt gà kháng kháng sinh (trừ CAZ) Khơng có chủng phân lập từ thịt lợn thịt bò đề kháng CIP Salmonella có nguồn gốc từ ba nguồn thịt đề kháng AM, STR, C, TE SXT, chủng phân lập từ thịt lợn có tỷ lệ đề kháng kháng sinh cao Toàn Salmonella phân lập từ thịt bò nhạy cảm với CAZ, GN CIP Salmonella phân lập từ thịt lợn đề kháng 11 AM, STR, TE với tỷ lệ lớn Salmonella từ thịt gà đề kháng C nhiều nhất, đặc biệt chủng kháng CIP chỉ tìm thấy thịt gà Thịt bò mẫu nhiễm Salmonella chủng nhạy cảm với nhiều kháng sinh 3.2.4 Kiểu hình kháng kháng sinh Từ kết kháng sinh đồ xác định kiểu hình kháng kháng sinh Salmonella nghiên cứu Hai kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến TE, STR, AM (2/9), C, TE, SXT, STR, AM (3/9) Kiểu hình TE, STR, AM chỉ có Salmonella phân lập từ thịt lợn Hai kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến nghiên cứu khác với kiểu hình kháng kháng sinh công bố nghiên cứu Miranda CS, Kim CS Từ kết nhận định kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến khác nghiên cứu Việc xác định kiểu hình kháng kháng sinh mẫu nghiên cứu quan trọng Kết kiểu hình kết hợp với kết phân tích hệ gen cho biết gen kháng kháng sinh, đột biến liên quan đến kháng kháng sinh Từ kết kiểu hình trên, thu Salmonella đa kháng, S Typhimurium phổ biến Thịt lợn nguồn phân lập nhiều Salmonella đa kháng (5 serovar), thịt gà (3 serovar), thịt bò (1 serovar) Tỷ lệ kháng kháng sinh, tỷ lệ đa kháng, kiểu hình kháng kháng sinh khác nghiên cứu công bố Sự khác biệt theo số nhà nghiên cứu lạm dụng kháng sinh điều trị chăn nuôi, làm tăng áp lực chọn lọc lên vi khuẩn dẫn tới xuất nhiều chủng Salmonella đa kháng kháng sinh khác theo vùng địa lý 12 3.3 Kết phân tích nhóm gen sớ chủng Salmonella đa kháng kháng sinh Giải trình tự hệ gen phiên mã sử dụng để xác định gen kháng kháng sinh vi khuẩn Thay vào đó, người ta thường sử dụng giải trình tự DNA tồn hệ gen Việc giải trình tự hệ gen phiên mã cho phép nghiên cứu chức gen tốt so với giải trình tự DNA Trong nghiên cứu muốn tập trung nghiên cứu hệ gen chức vi khuẩn Điều quan trọng gen khơng cần thiết khơng biểu có xu hướng bị thoái biến Hơn kỹ thuật giải trình tự tồn hệ gen khơng phân biệt gen bị bất hoạt hệ gen chức liên quan khác gen Ngồi ra, theo chúng tơi gen biểu có mối liên quan với kiểu hình, cụ thể kiểu hình kháng kháng sinh cao so với gen không biểu Chúng thực giải trình tự hệ gen phiên mã Salmonella đa kháng kháng sinh giống phương pháp mà tác giả Marcelino cộng công bố (tác giả giải trình tự hệ phiên mã vi khuẩn ruột chim để xác định gen kháng kháng sinh) Một điều quan trọng gen kháng kháng sinh biểu vi khuẩn nhạy cảm với kháng sinh điều kiện nuôi cấy thơng thường Do nghiên cứu chúng tơi không sử dụng chủng nhạy cảm với kháng sinh để đối chiếu Thay vào chúng tơi sử dụng kiểu hình nhạy cảm đề kháng với loại kháng sinh chủng để tham chiếu với Từ rút dự đốn gen nào, đột biến liên quan đến kháng kháng sinh vi khuẩn Để phân tích nhóm gen Salmonella đa kháng, số serovar đa kháng cần lựa chọn để giải trình tự tồn hệ gen 13 phiên mã Tuy nhiên, khuôn khổ luận án này, chỉ lựa chọn chủng theo tiêu chí tỷ lệ nhiễm cao, đề kháng nhiều kháng sinh theo nguồn phân lập, gồm S Derby, S Give, S Indiana, S Typhimurium S384, S Typhimurium S360, S Typhimurium S181 Sau tách RNA từ mẫu nghiên cứu, tiến hành kiểm tra chất lượng đo nồng độ OD260/280, kết hợp với điện di Kết cho thấy mẫu RNA đạt yêu cầu Mẫu sau chuyển thành cDNA kiểm tra độ toàn vẹn cho thấy giá trị RIN (RNA Integrity Number) 8,0, đạt yêu cầu để giải trình tự Kết thu sau: 3.3.1 Số lượng trình tự đọc (read) Từ kết trình tự thơ chúng tơi tiến hành tinh phần mềm Trimmomatic: Tổng số có 160.043.486 read, tổng số lượng read có điểm Q20 146.080.642 Số lượng read nhiều Sal Sal Các trình tự read có điểm chất lượng Q20 sử dụng để lắp ráp de novo sử dụng cho phân tích 3.3.2 Lắp ráp de novo Kết lắp ráp de novo cho thấy kích thước hệ gen phiên mã dao động từ 4,69 Mb (Sal 4) đến 5,1 Mb (Sal 11), giá trị GC dao động quanh 52%, giá trị N50 cao L50 thấp Kết tương tự với kết giải trình tự tồn hệ gen S Derby 07CR553 cơng bố Kérouanton cộng Từ kết luận trình tự mẫu nghiên cứu có chất lượng tốt, đủ điều kiện cho phân tích 3.3.3 Chú thích chức các gen Để hạn chế việc bỏ sót gen, nhiều cơng cụ phân tích gen sử dụng Số lượng gen phát công cụ khác Kết phát gen công cụ khác phương pháp phân tích chúng khác nhau, chưa có 14 phương pháp chuẩn, thống việc thích gen chấp nhận giới Số lượng trình tự mã hóa tìm sở liệu khác trình bày bảng 3.3 Bảng 3.3 Trình tự mã hóa mẫu nghiên cứu Sớ lượng các trình tự mã hóa Cơ sở dữ liệu Sal Sal Sal Sal Sal 11 Sal 12 RAST 4.807 4.917 5.154 5.097 5.357 5.000 PATRIC 4.807 4.917 5.154 5.049 5.357 5.000 BASys 4.973 5.100 5.336 5.253 5.566 5.209 Genious R11 4.400 4.513 5.022 5.207 5.304 5.309 Năm 2017, Baek cộng cơng bố có nhiều gen kích thước nhỏ, mã hóa cho protein có chiều dài 100 amino acid khơng phát thích hệ gen vi khuẩn Do đó, cần tiến hành nghiên cứu sâu gen mẫu nghiên cứu 3.3.4 Phân tích nhóm gen chủng Salmonella nghiên cứu Ngồi housekeeping gen…Chúng tơi xác định nhóm gen quan trọng biểu Salmonella đa kháng sau: 3.3.4.1 Nhóm gen kháng kháng sinh Kết tóm tắt gen kháng kháng sinh kiểu hình kháng kháng sinh trình bày bảng 3.4 Theo đó, tổng số có 107 gen kháng kháng sinh (danh sách gen khơng trình bày tóm tắt này) Bao gồm 22 gen kháng kháng sinh nhóm β-lactam, 46 gen kháng aminoglycoside, gen kháng quinolone, gen kháng phenicol, gen kháng cycline, gen kháng sulfonamide, gen kháng trimethoprim Ngoài chúng tơi phát 12 gen kháng kháng sinh nhóm macrolides, rifamycin, fosfomycin, lincosamide, polymyxin, peptide Số lượng đa dạng gen kháng 15 kháng sinh nghiên cứu tương tự kết nghiên cứu tác giả Saskia (2018) Tổng số 42 kiểu hình tạo từ kết kháng sinh đồ Có 29 kiểu hình kháng kháng sinh có biểu gen kháng kháng sinh Có 12 kiểu hình nhạy cảm kháng sinh có biểu gen kháng kháng sinh Chỉ có kiểu hình nhạy cảm khơng có biểu gen kháng kháng sinh Sal nhạy cảm với kháng sinh SXT khơng có biểu gen kháng kháng sinh Như vậy, phù hợp kiểu gen kiểu hình (29+1)/42 = 71,4% Và khơng phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh 12/42 = 28,6% Tỷ lệ phù hợp kiểu gen kiểu hình tương tự với kết nghiên cứu tác giả Owen cộng sự, 2017 (72,7%) Kết nghiên cứu thấp so với kết nghiên cứu số tác giả khác McDermott CS, 2016 (99%), Zankari CS 2013 (99,74%) Sự không phù hợp kiểu gen kiểu hình nghiên cứu giải thích gen kháng kháng sinh biểu mức độ chưa đủ, có nhiều chế kháng kháng sinh cùng tham gia kháng loại kháng sinh, chế kháng kháng sinh khác chưa tìm 16 Bảng 3.4 Kết tóm tắt gen kháng kháng sinh kiểu hình kháng kháng sinh mẫu nghiên cứu KS Mẫu nghiên cứu (Kiểu hình kháng kháng sinh/gen kháng kháng sinh) Sal (R) blaOXA-1 blaTEM family, PBPE** (R) aac family* aph family* ant family*, kdpE Sal (R) blaTEM family (S) aac(6')-Iy kdpE Sal (R) blaTEM family PBPE** (S) aac (6')-Iy, aac6-Iy, aadA8, aadA17; kdpE Sal (R) blaTEM family (R) aac family* aph family* ant family*, kdpE (R) aac(6')Ib-cr, gyrA, gyrB, parC (R) aac(6')-Iy kdpE (R) aac (6')-Iaa, aac3-IIa aadA17, aadA8b aph3-IIa, kdpE (S) qnrS1, qnr-S3, qnr-S5, gyrB, parC (R) aac family* aph family* kdpE (S) gyrA, gyrB, parC (S) floR, cmlA1 (S) cmlA1 (R) sul1, sul2, dfrA12 (R) tet(A), tet(B), tet(C), tet(R) (R) sul2, dfrA14, dfrA5 (R) tet(A) SXT (R) floR, cmlA1, cmlA5, cat2 (R) tet(A), tet(B), tet(C), tet(M), tet(R), tet(S) (R) sul2, sul3, dfrA12 (R) floR, cmlA1 TE (R) floR, cmlA1, catB4, catB8 (R) tet(A), tet(R) (R) aac (6')-Iy, aac6-Iy aadA8, aadA17 kdpE (S) qnr-S1, qnr-S3, gyrA, gyrB, parC, parE (R) floR, cmlA1, cmlA5, cat2 (R) tet(A), tet(M), tet(R), tet(S) (R) sul2, sul3, dfrA12 Sal 12 (R) blaTEM family PBPE** (S) aac(6')-Iaa, aac6Iaa, aph(6)-Id, aph(3'')-Ib strA, strB, kdpE (R) aac(6')-Iaa, aac6-Iaa aph(6)-Id, aph(3'')-Ib strA, strB, kdpE (S) gyrA, gyrB, parC AM GN STR CIP C catB3, (S) gyrA, gyrB, parC (R) tet(A), et(M), tet(S) (S) (S) aac (6')-Iaa, aac3-IIa, aadA17, aadA8b aph3-IIa, kdpE Sal 11 (R) blaTEM family PBPE** (R) aac family* aph family* kdpE (S) sul2 Chú thích: *Aac (Acetylation) family; Aph (Phosphorylation) family; Ant (Adenylylation) family; ** Penicillin Binding Protein E coli KS (kháng sinh), AM (ampicillin), GN (gentamycin), STR (streptomycin), CIP (ciprofloxacin), C (chloramphenicol), TE (tetracyclin), SXT (sulfamethoxazol/trimetoprim) 17 3.3.4.2 Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone Kháng sinh nhóm quinolone sử dụng phổ biến điều trị nhiễm Salmonella người Đối với Salmonella có nguồn gốc thực phẩm, đề kháng quinolone quan tâm đề cập đến danh sách kháng sinh quan trọng WHO lĩnh vực y học năm 2016 Một chế đề kháng quinolone Salmonella đột biến gen gyrA, gyrB parC Dó đó, chúng tơi tiến hành tìm đột biến gen trên, kết trình bày bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm quinolone Đột biến gen Mẫu Kết KSĐ gyrA Sal Đề kháng S83F;D87G Sal Nhạy cảm T57S; T255S; N395S Sal Nhạy cảm S83Y T57S; T255S; A352V S592N Sal Nhạy cảm T255S; N395S; S469A; A620T Sal 11 Nhạy cảm T255S; N395S; S469A; A620T Sal 12 Nhạy cảm T255S; N395S; S469A; A620T parC parE T57S; S80R; T255S; A628S Chú thích: A (Alanine), N (Asparagine), R (Arginine), S (Serine), T (Threonine), V (Valine), KSĐ (Kháng sinh đồ) Kết bảng 3.5 cho thấy, xác định đột biến: S83F, S83Y, D87G, S80R, T57S, T255S, N395S, S469A, A620T, A628S, S592N Tính đến thời điểm tại, chưa có cơng bố đột biến A628S, T255S, N395S, S469A, A620T Tuy nhiên, đột biến T255S, N395S, S469A, A620T lại xuất chủng nhạy cảm với CIP Sal 6, Sal 7, Sal 8, Sal 11, Sal 12 chứng tỏ 18 đột biến khơng có vai trò kháng CIP mẫu nghiên cứu Đột biến parC (A628S) có vai trò đề kháng CIP vì chỉ xuất Sal 4, chủng đề kháng CIP Kết có tính mà có ý nghĩa khoa học cao, mở đường cho nghiên cứu chế kháng kháng sinh Salmonella 3.3.4.3 Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc Chúng xác định biểu 41 gen liên quan, bao gồm 37 gen S Typhimurium S181, 25 gen S Typhimurium S384, 27 gen S Typhimurium S360, 27 gen S Give, 23 gen S Derby, 26 gen S Indiana Các kênh bơm thải thuốc phát mẫu nghiên cứu thuộc họ MFS (MefB, EmrAB, tetA, tetB, MdtD), SMR (QacE), RND (AcrAB-TolC, AcrAD-TolC, AcrEF-TolC, MdtABC-TolC, MexPQ-OpmE) Sự hiểu biết kênh bơm thải thuốc cần thiết cho việc phát triển biện pháp can thiệp để hạn chế khả kháng kháng sinh Salmonella Một số chủng Salmonella nhạy cảm với kháng sinh có biểu kênh bơm thải thuốc biểu ba kênh AcrAB-TolC, AcrEF-TolC, MdfA chủng nhạy cảm với chloramphenicol AcrD chủng nhạy cảm với gentamycin MexPQOpmE chủng nhạy cảm với ciprofloxacin chloramphenicol Do kênh khơng có vai trò việc kháng kháng sinh Một số chủng kháng kháng sinh có biểu kênh bơm thải thuốc AcrD với đề kháng ampicillin, streptomycin, MexPQOpmE với đề kháng tetracycline, EmrAB với đề kháng tetracycline, streptomycin ampicillin Vì chúng tơi dự đốn kênh liên quan đến đề kháng kháng sinh tương ứng Các nghiên cứu sâu hệ thống kênh bơm thải thuốc Salmonella cần tiến hành tương lai 19 Nhận định vai trò của kênh bơm thải thuốc với đề kháng kháng sinh tính luận án 3.3.4.4 Kết phân tích số nhóm gen khác Ngồi nhóm gen kh-áng kháng sinh nhóm gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc, xác định nhiều nhóm gen khác liên quan đến kháng kháng sinh độc tố vi khuẩn Số lượng gen nhóm chức trình bày bảng 3.6 Bảng 3.6 Biểu nhóm gen liên quan Sớ lượng gen Nhóm gen Sal Sal Sal Sal Sal 11 Độc lực 118 124 125 130 131 Tổng hợp flagellar 38 38 38 38 38 Tổng hợp LPS thành 52 39 48 52 51 tế bào Đáp ứng với Selenium 2 2 Đáp ứng với Tellurite 3 3 Đáp ứng với 2 2 Formaldehyde Di truyền vận động, 12 24 22 27 26 phage prophage Kênh vận chuyển ABC 21 21 21 21 21 Sal 12 133 38 51 26 21 Chú thích: Sal (S Indiana), Sal (S Derby), Sal (S Give), Sal (S Typhimurium S360), Sal 11 (S Typhimurium S384), Sal 12 (S Typhimurium S181) Nhóm gen đợc lực Có khoảng 200 gen liên quan đến độc tố Salmonella phát hiện, nhiên, chức chế hoạt động phần lớn gen chưa nghiên cứu đầy đủ Trong nghiên cứu này, có tất 134 gen độc tố xác định Số lượng đa dạng 20 gen tương tự số cơng bố khác, ví dụ tác giả Figueiredo (114 gen), Card (105 gen) Sự có mặt gen độc chứng tỏ tất chủng Salmonella đa kháng chủng độc Các gen có vai trò q trình gây bệnh, có vai trò kháng kháng sinh Salmonella Đây nghiên cứu xác định biểu toàn gen độc lực chủng Salmonlla đa kháng kháng sinh Việt Nam Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar Flagellar có vai trò quan trọng việc tạo độc tố vi khuẩn, thành phần thường lẫn vào túi màng người ta phân lập kháng nguyên để chế tạo vaccine Salmonella Việc hiểu biết gen biểu liên quan đến flagellar hữu ích cho việc tinh thành phần Chẳng hạn bất hoạt gen tạo túi màng tinh sạch, làm kháng nguyên để chế tạo vaccine Đây đóng góp đề tài Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp LPS thành tế bào Ngoài S Typhi, LPS Salmonella khác chưa nghiên cứu đầy đủ Các gen tổng hợp lipidA, thành phần quan trọng vỏ LPS, liên quan đến khả kháng kháng sinh polymixin biểu mẫu nghiên cứu LPS protein màng tạo thành túi màng ngồi, túi có khả kích thích miễn dịch xem thành phần quan trọng để chế tạo vaccine Kết nghiên cứu đóng góp phần kiến thức gen mã hóa LPS, nguồn tham khảo cho nghiên cứu sâu Nhóm gen đáp ứng với các chất gây đợc Ngồi selenium, tellurit ngun tố với độc tính cao, formaldehyde tìm thấy mẫu Salmonella, thực tế đáng báo động Kết nghiên cứu cho thấy cần phải có 21 nghiên cứu sâu rộng để làm sáng tỏ nguồn chất mức độ nhiễm hợp chất thực phẩm Hà Nội Do đó, việc kiểm sốt nguồn gốc q trình chế biến thực phẩm cần thiết Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage Các thực khuẩn thể thường mang gen độc, tạo nên độc tố Salmonella Một số thực khuẩn thể tồn Salmonella sử dụng marker chẩn đoán nhanh Chúng xác định thực khuẩn thể Gifsy-2 tất mẫu nghiên cứu, marker để chẩn đoán nhanh Salmonella Tuy nhiên, số mẫu nghiên cứu (6 mẫu), cần phải tiến hành nghiên cứu số lượng mẫu lớn để khẳng định vấn đề Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC Kênh vận chuyển ABC tạo độc tố nhiều vi khuẩn Khả vận chuyển chúng liên quan đến kháng kháng sinh điều trị Tuy nhiên, đa số loài Salmonella, chức số thành phần kênh vận chuyển sapABCDF chưa mơ tả đẩy đủ Ở S Typhimurium, sapABCDF tạo độc tố giúp vi khuẩn kháng lại kháng sinh nhóm peptide 3.4 Xác nhận kết đột biến gen kháng kháng sinh phương pháp giải trình tự gen Sanger Từ kết dự đốn phương pháp giải trình tự gen hệ điểm đột biến gen parC (A628S) có khả liên quan đến kháng kháng sinh nhóm quinolone, chúng tơi tiến hành giải trình tự phần gen parC có chứa điểm đột biến phương pháp giải trình tự gen Sanger để khẳng định kết Kết giải trình tự gen Sanger cho thấy chỉ mẫu Sal vị trí 1882 gen parC có xuất đột biến làm thay đổi nucleotide G→T, đột biến làm thay đổi amino acid A628S, kết 22 phù hợp với kết phân tích phương pháp giải trình tự gen hệ Đột biến A628S yếu tố làm thay đổi chức gen parC làm cho gen có khả đề kháng kháng sinh Sal Hiện chưa thấy có cơng bố điểm đột biến Tuy nhiên, để khẳng định chắn đột biến gen parC (A628S) có liên quan đến đề kháng kháng sinh nhóm quinolone hay khơng cần có nghiên cứu sâu KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã phân lập, định danh chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, thịt gà chợ bán lẻ Hà Nội Các mẫu nghiên cứu nhiễm Salmonella với tỷ lệ 27,8%, bao gồm serovar khác nhau, phổ biến S Typhimurium Đã xác định đặc điểm kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập Salmonella phân lập có tỷ lệ đề kháng kháng sinh hay sử dụng 52%, tỷ lệ Salmonella đa kháng kháng sinh 36% Các kháng sinh bị đề kháng cao STR TE (44%) Ngược lại, 100% số chủng nhạy cảm với CAZ Kiểu hình kháng kháng sinh phổ biến TE, STR, AM, C, TE, SXT, STR, AM Đã phân tích nhóm gen chủng Salmonella đa kháng kháng sinh Bao gồm nhóm gen liên quan đến kháng kháng sinh nhóm gen liên quan đến độc tố vi khuẩn Từ xác định được: • Đột biến gen parC (A628S) có khả liên quan đến đề kháng kháng sinh nhóm quinolone Salmonella • Đã phân tích gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc có vai trò đề kháng số kháng sinh Salmonella 23 như: vai trò AcrD đề kháng AM, STR GN, EmrAB với đề kháng TE, STR AM, MexPQ-OpmE với đề kháng TE Kiến nghị Tiến hành nghiên cứu chuyên sâu vai trò đột biến gen parC (A628S) với đề kháng kháng sinh nhóm quinolone Tiến hành nghiên cứu thực nghiệm vai trò chức hệ thống kênh bơm thải thuốc Salmonella, đặc biệt vai trò AcrD với đề kháng AM, STR GN, EmrAB với đề kháng TE, STR AM, MexPQ-OpmE với đề kháng TE Tiến hành nghiên cứu sâu để đánh giá vai trò gen có kích thước nhỏ, mã hóa cho protein có chiều dài 100 amino acid khơng phát mẫu nghiên cứu NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Xác định điểm đột biến gen parC (A628S) có khả liên quan đến kháng kháng sinh nhóm quinolone Salmonella Đề xuất vai trò kênh bơm thải thuốc đề kháng số kháng sinh Salmonella kênh AcrD với đề kháng AM, STR GN, kênh EmrAB với đề kháng TE, STR AM, kênh MexPQOpmE với đề kháng TE 24 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ Minh Ngoc Nghiem, Viet Thanh Nguyen, Eui-Bae Jeung, Thuy Thi Bich Vo Alternate antimicrobial resistance genes in multidrug resistant Salmonella spp isolated from retail meats in Vietnam using RNA-sequencing analysis (2019) Journal of Food Safety, SCI, Q2 ID: JFS12707, 07 October 2019 https://doi.org/10.1111/jfs.12707 Minh Ngoc Nghiem, Viet Thanh Nguyen, Thu Thi Hoai Nguyen, Ton Dang Nguyen, Thuy Thi Bich Vo (2017) Antimicrobial resistance gene expression associated with multidrug resistant Salmonella spp isolated from retail meat in Hanoi, Vietnam International Microbiology, SCIE, Q3 20(2): 85-93 Nguyễn Thanh Việt, Nghiêm Ngọc Minh, Võ Thị Bích Thủy (2018) Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh vi khuẩn Salmonella phân lập từ mẫu thịt lợn, thịt bò, thịt gà chợ bán lẻ Hà Nội Tạp chí Cơng nghệ sinh học 3(16): 553-564 Nguyễn Thanh Việt, Nguyễn Thanh Tùng, Võ Thị Bích Thủy, Nghiêm Ngọc Minh (2019) Nghiên cứu xác định gen liên quan đến tổng hợp lipopolysaccharide chủng Salmonella typhimurium đa kháng cơng nghệ giải trình tự gen hệ Tạp chí Y học Thực hành 4(1094): 52-56 Nguyen Thanh Viet, Nghiem Ngọc Minh, Nguyen Duc Hieu, Dang Thi Quynh, Vo Thi Bich Thuy (2018) Single nucleotide polymorphism discovery in multi-drug resistant Salmonella spp isolated from retail meats in noi, vietnam using rna-seq technology The 7th International Conference in Vietnam on the Development of Biomedical Engineering: 58 Nguyễn Thanh Việt, Võ Thị Bích Thủy (2018) Nghiên cứu xác định gen mã hóa kênh bơm thải thuốc chủng Salmonella spp đa kháng kháng sinh công nghệ giải trình tự hệ (2018) Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc 2018: 965-971 ... định đặc điểm kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập Salmonella phân lập có tỷ lệ đề kháng kháng sinh hay sử dụng 52%, tỷ lệ Salmonella đa kháng kháng sinh 36% Các kháng sinh bị đề kháng. .. chưa tìm 16 Bảng 3.4 Kết tóm tắt gen kháng kháng sinh kiểu hình kháng kháng sinh mẫu nghiên cứu KS Mẫu nghiên cứu (Kiểu hình kháng kháng sinh/ gen kháng kháng sinh) Sal (R) blaOXA-1 blaTEM family,... Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ lựa chọn chủng Salmonella đa kháng kháng sinh • Giải trình tự gen hệ số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh để phân tích nhóm gen liên quan Xác nhận số kết