Nghiên cứu đặc điểm kháng sinh và gen liên quan ở các chủng salmonella đa kháng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NGUYỄN THANH VIỆT NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2020 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… NGUYỄN THANH VIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã sỗ: 42 01 07 Người hướng dẫn khoa học: GS TS Nghiêm Ngọc Minh PGS TS Võ Thị Bích Thủy Hà Nội – 2020 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu sử dụng phân tích luận án có nguồn gốc rõ ràng, công bố theo quy định Các kết nghiên cứu luận án tơi tự tìm hiểu, phân tích cách trung thực, khách quan Các kết nghiên cứu công bố tạp chí quốc tế tạp chí chuyên ngành nước với đồng ý đồng tác giả Các kết chưa công bố nghiên cứu tác giả khác Tác giả luận án Nguyễn Thanh Việt Lời cảm ơn Để hoàn thành luận án này, trước tiên xin cảm ơn GS TS Nghiêm Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen PGS TS Võ Thị Bích Thủy, Phó Trưởng phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam trực tiếp hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu trình học tập Tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Ban Giám đốc Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng tạo điều kiện cho tơi học tập Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Nghiên cứu hệ gen tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu viện Cảm ơn TS Nguyễn Thị Thanh Ngân, chuyên viên đào tạo Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ tơi hồn thành thủ tục cần thiết trình học tập Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Khoa học Công nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, Phòng Đào tạo, Học viện Khoa học Công nghệ tạo điều kiện để tơi hồn thành khóa học Tơi xin cảm ơn Khoa xét nghiệm, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác, Học viện Quân y giúp thực số thí nghiệm q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn TS Moreland Gibbs, Trung tâm hỗ trợ phần mềm Genenious, New Zealand, giúp đỡ tơi q trình phân tích số liệu Cảm ơn đồng nghiệp đóng góp, giúp đỡ tơi hồn thiện luận án Cuối cùng, tơi xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người bạn thân thiết bên cạnh, động viên giúp đỡ tơi q trình học tập Nghiên cứu sinh Nguyễn Thanh Việt DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Viết tắt Viết đầy đủ Tên tiếng việt AM Ampicillin BHI Brain Heart Infusion Broth C Chloramphenicol CAZ Ceftazidime CIP Ciprofloxacin DNA Deoxyribonucleic Acid Axit đêôxiribônuclêic RNA Ribonucleic Acid Axit ribônuclêic GN Gentamycin GI Genomic Island KSĐ Canh thang BHI Kháng sinh đồ Độ dài contig dài LCS Longest Contig Size LPS Lipopolysaccharide MDR Multidrug Resistance Đa kháng kháng sinh MSS Mean Sequence Size Kích thước trung bình trình tự NC Number of Contigs Số lượng contig NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự hệ OMP Outer Membrane Protein Protein màng R Resistant Đề kháng S Sensitive Nhạy cảm STR Streptomycin SCS Shortest Contig Size SXT Sulfamethoxazol/Trimetoprim TE Tetracycline Độ dài contig ngắn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục từ viết tắt Mục lục Danh mục bảng Danh mục hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN 1.1 Đặc điểm sinh học Salmonella 1.1.1 Hình thái 1.1.2 Tính chất nuôi cấy 1.1.3 Tính chất hóa sinh 1.1.4 Sức đề kháng 1.1.5 Kháng nguyên 1.1.5.1 Kháng nguyên O 1.1.5.2 Kháng nguyên H 1.1.5.3 Kháng nguyên Vi 1.1.6 Phân loại 1.2 Đặc điểm hệ gen Salmonella 1.2.1 Cấu trúc hệ gen 1.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh Salmonella 10 1.2.2.1 Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside 11 1.2.2.2 Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam 12 1.2.2.3 Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol 13 1.2.2.4 Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone 13 1.2.2.5 Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline 13 1.2.2.6 Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim 14 1.2.3 Liên quan đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh vi khuẩn 15 1.2.4 Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc 15 1.2.4.1 Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc 16 1.2.4.2 Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở Salmonella 18 1.3 Tình hình nhiễm đề kháng kháng sinh Salmonella thực phẩm 19 1.3.1 Trên giới 19 1.3.2 Tại Việt Nam 22 1.4 Một số kỹ thuật hay được sử dụng nghiên cứu biểu gen 23 1.4.1 Reverse transcription PCR (RT-PCR) 24 1.4.2 Real-time PCR (qPCR) 24 1.4.3 Microarray 24 1.4.4 Giải trình tự hệ mới 26 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 28 2.1.1 Nguyên liệu 28 2.1.2 Mơi trường, hóa chất, kháng sinh, bộ kit 29 2.1.2.1 Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO 6579:2002 29 2.1.2.2 Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ 33 2.1.2.3 Kháng sinh 34 2.1.2.4 Các kít 34 2.1.3 Thiết bị nghiên cứu 35 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 37 2.2.2 Định danh Salmonella 37 2.2.2.1 Tăng sinh sơ không chọn lọc 37 2.2.2.2 Tăng sinh chọn lọc 37 2.2.2.3 Quy trình khẳng định 38 2.2.3 Kháng sinh đồ 41 2.2.4 Giải trình tự hệ mới 42 2.2.4.1 Tách chiết, tinh sạch RNA tổng số thiết lập thư viện cDNA 42 2.2.4.2 Giải trình tự hệ công nghệ Illumina 42 2.2.5 Nhóm phương pháp tin sinh học 43 2.2.5.1 Kiểm tra chất lượng trình tự 43 2.2.5.2 Lọc trình tự chất lượng cao phần mềm Trimmomatic [57] 43 2.2.5.3 Lắp ráp de novo 43 2.2.5.4 Chú thích hệ gen biểu 44 2.2.5.5 Xác định các gen kháng kháng sinh 44 2.2.5.6 Xác định đột biến gen kháng kháng sinh 44 2.2.6 Xác nhận kết đột biến gen kháng kháng sinh phương pháp giải trình tự gen Sanger 45 2.2.7 Xử lý thống kê 45 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 46 3.1 Phân lập định danh type chủng Salmonella nghiên cứu 46 3.1.1 Kết phân lập Salmonella 46 3.1.2 Kết định danh type chủng Salmonella phân lập 56 3.2 Đặc điểm kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập được 59 3.2.1 Mức độ đề kháng kháng sinh chủng Salmonella phân lập 61 3.2.2 Số lượng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập 63 3.2.3 Salmonella đề kháng loại kháng sinh theo nguồn phân lập 65 3.2.4 Kiểu hình kháng kháng sinh 66 3.3 Kết phân tích nhóm gen số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh 69 3.3.1 Số lượng trình tự đọc (read) 71 3.3.2 Lắp ráp de novo 72 3.3.3 Chú thích chức các gen 73 3.3.4 Phân tích nhóm gen chủng Salmonella nghiên cứu 74 3.3.4.1 Nhóm gen kháng kháng sinh 74 3.3.4.2 Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone 87 3.3.4.3 Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux pump) 90 3.3.4.4 Nhóm gen độc lực 97 3.3.4.5 Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar 99 3.3.4.6 Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide (LPS) thành tế bào 101 3.3.4.7 Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc 102 3.3.4.8 Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage 105 3.3.4.9 Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC 107 3.4 Xác nhận kết đột biến gen kháng kháng sinh phương pháp giải trình tự gen Sanger 110 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 114 Kết luận 114 Kiến nghị 114 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 115 NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 116 TÀI LIỆU THAM KHẢO 117 PHỤ LỤC Phụ lục Kết kiểm tra chất lượng thư viện cDNA máy Bioanalyzer Phụ lục Gen độc lực biểu mẫu nghiên cứu Phụ lục Biểu gen liên quan đến flagellar 14 Phụ lục Các gen tổng hợp LPS thành tế bào 16 Phụ lục Các gen liên quan đến yếu tố di truyền vận động, phage, prophage 18 Phụ lục Các gen liên quan đến tác động bất lợi môi trường biểu mẫu nghiên cứu 20 ... VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… NGUYỄN THANH VIỆT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG... Phân tích nhóm gen chủng Salmonella nghiên cứu 74 3.3.4.1 Nhóm gen kháng kháng sinh 74 3.3.4.2 Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone 87 3.3.4.3 Nhóm gen liên quan đến hệ thống... lượng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân lập 64 Bảng 3.8 Salmonella đề kháng loại kháng sinh theo nguồn phân lập 65 Bảng 3.9 Kiểu hình kháng kháng sinh chủng Salmonella