Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6859-2:2001 mô tả phương pháp xác định những ảnh hưởng của các chất lên sự sinh sản, tử vong và sự sinh trưởng của loài giun Eisenia fetida fetida và Eisenia fetida andrei thông qua da và thức ăn của chúng khi sử dụng nền đất nhân tạo.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 6859 - : 2001 ISO 11268 - : 1998 CHẤT LƯỢNG ĐẤT - ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT Ô NHIỄM LÊN GIUN ĐẤT (EISENOA FETIDA) - PHẦN 2: XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ĐỐI VỚI SỰ SINH SẢN Soil quality - effects of pollutants on earthworms (eisenia fetida) - Part 2: Determination of effects on reproduction Lời nói đầu TCVN 6859 - : 2001 hoàn toàn tương đương với ISO 11268 -2 : 1998 TCVN 6859 - : 2001 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC190 Chất lượng đất biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học, Công nghệ Môi trường ban hành CHẤT LƯỢNG ĐẤT - ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC CHẤT Ô NHIỄM LÊN GIUN ĐẤT (EISENIA FETIDA) - PHẦN 2: XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ĐỐI VỚI SỰ SINH SẢN Soil quality - Effects of pollutants on earthworms (Eisenia fetida) - Part : Determination of effects on reproduction Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn mô tả phương pháp xác định ảnh hưởng chất lên sinh sản, tử vong sinh trưởng loài giun Eisenia fetida fetida Eisenia fetida andrei thông qua da thức ăn chúng sử dụng đất nhân tạo Phương pháp không áp dụng cho chất dễ bay hơi, tức chất mà giá trị H (hằng số Henry) hệ số riêng phần không khí / nước lớn 1, cho chất có áp suất lớn 0,0133 Pa 25oC Chú thích - Khơng có điều khoản phương pháp thử dành cho việc giám sát độ bền chất trình thử nghiệm Chú thích - Những đề nghị làm cho phương pháp thích ứng để so sánh giám sát chất lượng đất hoạt động nơng nghiệp, thí dụ đánh giá ảnh hưởng thuốc bảo vệ thực vật, trình bày phụ lục D E Tiêu chuẩn trích dẫn TCVN 5979:1995 (ISO 10390:1974), Chất lượng đất - Xác định pH TCVN 5961:1995 (ISO 11268-1:1993), Chất lượng đất - ảnh hưởng chất ô nhiễm lên giun đất (Eisenia fetida) - Phần 1: Xác định độ độc cấp tính cách sử dụng đất nhân tạo TCVN 6651:2000 (ISO 11274:1998), Chất lượng đất - Xác định đặc tính giữ nước - Phương pháp phòng thí nghiệm TCVN 6648:2000 (ISO 11465:1986) Chất lượng đất - Xác định chất khô hàm lượng nước sở khối lượng - Phương pháp khối lượng Định nghĩa Các định nghĩa sau sử dụng tiêu chuẩn này: 3.1 Sự sinh trưởng Sự tăng sinh khối, (nghĩa khối lượng tươi thể sống) biểu thị phần trăm khối lượng tươi thể sống thời điểm bắt đầu thử 3.2 Sự sinh sản Sự tăng số lượng trung bình giun bình thử sau tám tuần ấp điều kiện thử định 3.3 Tỷ lệ sinh sản Số trung bình giun nở từ ổ trứng sống đến thời điểm kết thúc phép thử giun trưởng thành sống sót sau bốn tuần 3.4 Nồng độ thấp quan sát thấy hiệu ứng LOEC Nồng độ thấp chất thử quan sát thấy có hiệu ứng đáng kể so sánh với phép thử đối chứng, nồng độ biểu thị khối lượng chất thử khối lượng khô chất 3.5 Nồng độ không quan sát thấy hiệu ứng NOEC Nồng độ cao chất thử mà khơng quan sát thấy hiệu ứng gây chết giun hiệu ứng khác (như làm thay đổi khối lượng) nồng độ biểu thị khối lượng chất thử khối lượng khô chất 3.6 EC 50 Nồng độ ước tính làm giảm tỷ lệ sinh sản 50% thời điểm kết thúc phép thử so sánh với đối chứng, biểu thị khối lượng chất thử khối lượng khô chất Nguyên tắc Xác định ảnh hưởng sinh sản, sinh trưởng tỷ lệ tử vong giun trưởng thành (loài Eisenia fetida fetida hay Eisenia fetida andrei) mẫu đất nhân tạo xác định, có chứa chất thử nồng độ khác Sau lần sử dụng chất thử xác định ảnh hưởng tỉ lệ tử vong sinh khối sau bốn tuần ảnh hưởng sinh sản tính cách đếm số giun nở từ ổ trứng sau bốn tuần Tất nồng độ thử cao LOEC phải có hiệu ứng xấu lớn hiệu ứng quan sát LOEC Nếu trước nồng độ chất thử có ảnh hưởng nên tiến hành thử theo hai bước: - tiến hành thử sơ xác định độc tính cấp mơ tả TCVN 5961:1995 (ISO 1268-1:1993) để có dẫn nồng độ gây ảnh hưởng nồng độ làm chết toàn giun, sau thử nồng độ sử dụng lần thử cuối lựa chọn - thử lần cuối sinh sản giun xác định nồng độ hoá chất, trộn với đất nhân tạo, không gây ảnh hưởng đáng kể số giun nở từ ổ trứng so với nồng độ đối chứng (NOEC), xác định nồng độ thấp gây ảnh hưởng (LOEC) Thuốc thử 5.1 Nguyên liệu sinh vật Nguyên liệu sinh vật giun đất trưởng thành thuộc loài Eisenia fetida fetida Eisenia fetida andrei (xem tài liệu tham khảo phụ lục F), có độ tuổi từ tháng đến năm có búi tuyến da (clitellum) khối lượng tươi 300 mg đến 600 mg Tiến hành đồng thời việc sinh sản cách để giun trưởng thành vào hộp nuôi giun (xem phụ lục A) lấy chúng sau bốn tuần Còn giun lại đạt tuổi trưởng thành sau tháng Trước tiến hành thử, giun phải có thời gian lưu đất nhân tạo khoảng đến ngày Nguồn thức ăn sử dụng làm thức ăn thử (5.3) phải cung cấp đầy đủ (xem 5.2.1) 5.2 Chất thử 5.2.1 Chất đất Chất dùng để chế tạo đất nhân tạo (5.2.2) phải có thành phần sau: Thành phần đất nhân tạo Phần trăm tính theo khối lượng khơ Than bùn, phơi khơ khơng khí, xay mịn khơng thấy vết tích thực vật (nhìn mắt) 10% Đất sét caolinit, phơi khơ khơng khí, chứa 30% caolinit 20% Cát thạch anh cơng nghiệp, phơi khơ khơng 70% khí, (phần lớn cát mịn có 50% khối lượng loại hạt có kích thước 0,05 mm đến 0,2 mm), phụ thuộc vào lượng CaCO3 cần có Trước tiến hành thử, trộn chất thử vào thức ăn Nếu dùng phân bò phơi khơ (xem 5.3), nên dùng lượng 5g 500g khối lượng khô đất Bổ sung đủ lượng canxi cacbonat (khoảng 0,5%), xay thành bột mịn, có độ tinh khiết phân tích, để điều chỉnh pH đất ướt đến 6,0 ± 0,5 thời điểm bắt đầu phép thử Chú thích - Lượng CaCo3 cần phụ thuộc vào thành phần chất đất bao gồm thức ăn phải xác định trước thử cách sử dụng mẫu phụ Sử dụng từ 500 g đến 600g chất đất khô cho thùng thử (6.1) để chế tạo đất nhân tạo 5.2.2 Đất nhân tạo Để tạo thành đất nhân tạo, dùng nước loại ion nước cất làm ẩm chất đất (5.2.1) để hàm lượng nước đạt khoảng 40% đến 60% khối lượng khả chứa nước toàn phần, xác định theo TCVN 6651 : 2000 (ISO 11274 :1998) Chú thích - Đát nhân tạo phải làm ẩm khơng có nước tự nước chảy nén đất Sử dụng phương pháp trình bày phụ lục C để xác định đặc tính giữ nước Xác định hàm lượng nước pH với có mặt dung dịch KCl mol/lit đất nhân tạo mẫu hỗn hợp, trước thử thời điểm kết thúc phép thử mẫu đối chứng mẫu nồng độ thử (khi thử chất axit bazơ khơng điều chỉnh pH), theo TCVN6648:2000 (ISO 11465 :1998) TCVN 5979 :1995 (ISO 10390 :1994) 5.3 Thức ăn Bất kỳ nguồn thức ăn với chất lượng trì quần thể giun, sử dụng thử Để đạt sinh sản đầy đủ cần phải cho giun ăn thời gian thử Phân bò khơ khơng khí nghiền mịn, nguồn thức ăn thích hợp cho giun đất Mỗi lần cho thức ăn phải kiểm tra để xác định xem giun có ăn khơng, phải xem có ảnh hưởng xấu khơng (thí dụ amoniac chất phụ gia có tiềm ẩn gây hại) Sự sinh trưởng lượng trứng giun không giảm so với giun ni chất khơng có thức ăn [điều kiện mô tả TCVN 5961:1995 (ISO11268- :1993)] Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị phòng thí nghiệm chuẩn, và: 6.1 Các thùng chứa, có dung tích lít đến lít có mặt cắt chéo với diện tích khoảng 200 cm2, loại thùng có chiều sâu lớp đất từ cm đến cm chứa 500 g đến 600g khối lượng khô Những thùng chứa phải có q trình trao đổi khí mơi trường bên thùng khơng khí bên ngồi, phải có ánh sáng lọt vào (thí dụ cách sử dụng lớp phủ suốt có lỗ) phải có biện pháp ngăn ngừa giun chui (thí dụ dùng băng cố định lớp phủ) 6.2 Thiết bị, đo pH hàm lượng nước chất 6.3 Mơi trường thử 6.3.1 Phòng thử có bao che, kiểm sốt nhiệt độ đến 20oC ± 2oC 6.3.2 Nguồn sáng, có khả cung cấp cường độ ánh sáng ổn định từ 400 lx đến 800 lx thùng chứa kiểm tra chu kỳ sáng / tối 12 h :12 h 16 h : h Cách tiến hành 7.1 Thử sơ Nếu cần phải xác định khoảng nồng độ sử dụng phép thử chính, phải tiến hành thử sơ theo TCVN 5961 :1995 (ISO 11268 -1 :1993) cho bốn nồng độ chất thử đối chứng (thí dụ 0mg/kg, mg/kg, 10 mg/kg, 100 mg/kg 1000 mg/kg) Nồng độ biểu thị miligam chất thử kilogam đất khô (5.2.1), sử dụng 10 giun cho nồng độ thùng 7.2 Phép thử cuối 7.2.1 Đưa chất thử vào chất Sử dụng phương pháp a) b) c), thích hợp a) Các chất tan nước Ngay trước bắt đầu phép thử, hoà tan lượng chất thử cần thiết để tạo nồng độ nước (hoặc lượng cần thiết để làm ẩm đất) để đạt yêu cầu 5.2.2 trộn kỹ với đất trước đưa vào thùng thử b) Các chất không tan nước tan dung mơi hữu Hồ tan lượng chất thử cần thiết để thu nồng độ mong muốn dung môi bay (axeton hexan) trộn dung dịch với phần cát thạch anh theo yêu cầu Sau làm bay dung môi cách để thùng chứa tủ hốt, bổ sung phần lại chất với nước trộn thật kỹ trước cho chúng vào thùng thử Tiếp tục làm mơ tả 7.2.3 Chú thích - Có thể dùng siêu âm, dung mơi hữu cơ, chất tạo huyền phù chất phân tán để phân tán chất tan nước Khi sử dụng chất phụ trợ đó, tất nồng độ thử đối chứng bổ sung phải chứa lượng nhỏ chất phụ trợ Cảnh báo: Phải có biện pháp thích hợp tiếp xúc với dung môi để tránh nguy hiểm bị hít phải nổ, tránh làm thiệt hại cho thiết bị chiết, bơm c) Các chất không tan nước dung môi hữu Đối với chất khơng tan dung mơi bay hơi, điều chế hỗn hợp gồm 10g cát thạch anh công nghiệp nghiền mịn (xem 5.2.1) lượng cần thiết chất thử để thu nồng độ mong muốn Cho hỗn hợp phần lại chất đất (5.2.1) nước vào thùng thử (6.1) trộn thật Trộn chất thử vào đất nhân tạo theo TCVN 5961:2000 (ISO 11268-1:1993) trước bổ sung giun đất Trên sở kết phép thử sơ bộ, đặt nồng độ chọn để đưa LOEC/NOEC Để cách nồng độ số không lớn Các chất trộn vào chất không cần thử nồng độ lớn 1000 mg/kg khối lượng chất thử Tiến hành đồng thời bốn mẫu lặp lại cho nồng độ cho đối chứng 7.2.2 Thùng đối chứng Chuẩn bị thùng đối chứng giống cách chuẩn bị thùng thử chất thử bên Nếu q trình thử u cầu có chất phụ trợ (xem 8.2.1), sử dụng thêm thùng đối chứng tương tự thùng thử khơng có chất thử 7.2.3 Bổ sung vật liệu sinh vật Chuẩn bị, rửa lau (sử dụng giấy thấm) 10 giun (5.1) cho thùng thử (6.1) thùng đối chứng Để tránh sai số hệ thống phân phối giun vào thùng phải tiến hành xác định độ đồng giun thử cách cân mẫu gồm 20 giun riêng biệt Khi chắn đạt độ đồng đều, mẻ gồm 10 giun chọn, cân cho cào thùng Các mẻ giun phân chia sử dụng theo quy luật ngẫu nhiên Đậy thùng dẫn 6.1 Đặt thùng vào buồng thử phòng thử có bao che (6.3.1) 7.2.4 Tiến hành thử Sau cho giun vào thùng thử ngày, rắc g thức ăn khô nghiền mịn phơi khơ khơng khí vào thùng thử bề mặt đất làm ẩm đất nước uống được, (khoảng từ đến ml cho thùng) Cho ăn lần tuần suốt thời gian thử Nếu nhu cầu tiêu thụ thức ăn chậm giảm lượng thức ăn đến mức thấp Ghi lại hành vi giun ăn, cho ăn, lượng thức ăn dùng thời gian thử thùng Duy trì hàm lượng nước chất đất thùng thử (6.1) thời gian thử cách cân chúng khoảng thời gian định bổ sung lượng nước cần thời điểm kết thúc thử, hàm lượng nước không thay đổi 10% hàm lượng nước lúc bắt đầu thử Giữ giun trưởng thành tuần lễ chất thử Khi thời gian kết thúc, lấy giun trưởng thành ghi lại tổng số khối lượng giun sống thùng Giữ thùng thêm tuần môi trường thử (6.3) giun phát triển Khi bắt đầu thời kỳ này, cho giun ăn lần cách trộn tay 5g thức ăn vào chất thùng Sau thời kỳ định, dùng phương pháp thích hợp đếm số giun nở từ ổ trứng Chú thích - Phụ lục B cho thí dụ hai phương pháp thích hợp bao gồm phương pháp đếm trứng 7.3 Chất đối chiếu Carbendazim chọn làm chất đối chiếu Nếu hợp chất trộn vào chất nền, tiến hành quan sát ảnh hưởng trình sinh sản ( ỏ = 0,05) nồng độ từ mg đến mg carbendazim kilôgam khối lượng chất khô ( Đối với áp dụng bề mặt xem phụ lục D) Tính tốn biểu thị kết 8.1 Tính toán Đối với nồng độ, xác định phần trăm tử vong, phần trăm tăng / giảm sinh khối giun trưởng thành số lượng giun sinh phép thử sau So sánh giá trị trung bình với đối chứng phương pháp thống kê thích hợp thí dụ phương pháp William, Dunnet' Student' với mức ý nghĩa (ỏ = 0,05) 8.2 Biểu thị kết Chỉ rõ, nồng độ thử cao khơng tử vong, tính theo miligam kilogam khối lượng chất đát khô, thay đổi sinh khối giun trưởng thành, nồng độ thấp có ảnh hưởng (LOEC) tính tỷ lệ LC/EC 50 Tính đắn phép thử Các kết coi nếu: a) tỷ lệ sinh sản giun 30 thùng đối chứng; b) hệ số biến thiên sinh sản phép thử đối chứng không vượt 30% ; c) phần trăm tử vong thùng đối chứng giun trưởng thành ≤ 10% 10 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo kết dựa theo tiêu chuẩn phần bổ sung cho kết nêu 8.2 cung cấp thông tin sau - mô tả cụ thể chất thử thơng tin tính chất hố học, lý học để giúp hiểu rõ kết thử; - mơ tả tồn nguyên liệu sinh vật dùng (loài, độ tuổi, khoảng khối lượng, điều kiện sinh sản, người cung cấp); - phương pháp điều chế chất thử chất phụ trợ dùng cho chất thử tan chậm, không tan nước; - kết đạt với chất đối chiếu sử dụng; - điều kiện chi tiết môi trường thử; - bảng ghi chép phần trăm tử vong thùng nồng độ phép thử đối chứng; - tổng số khối lượng giun trưởng thành lúc bắt đầu thử, tổng số khối lượng giun trưởng thành sống thùng thử sau tuần; - số lượng giun thùng thử kết thúc phép thử; - nồng độ cao không gây ảnh hưởng (NOEC) nồng độ thấp gây ảnh hưởng (LOEC); - mô tả triệu chứng bệnh lý thay đổi quan sát (thí dụ: giảm độ ăn) thể thử thùng thử; - hàm lượng nước pH đất nhân tạo thời điểm bắt đầu kết thúc phép thử nồng độ thử thử đối chứng; - tất thao tác không qui định tiêu chuẩn cố có ảnh hưởng đến kết thử Phụ lục A (tham khảo) Thí dụ kỹ thuật ni giun Eisenia fetida fetida E fetida andrei Phụ lục đưa dẫn nuôi sinh vật thử sử dụng để xác định độc tính tối đa Cả hai lồi ni chất thải động vật Mơi trường ni thích hợp hỗn hợp phân ngựa phân bò với than bùn trộn theo tỷ lệ 50:50 Mơi trường ni có pH khoảng đến (được điều chỉnh canxi cacbonat), có độ dẫn điện thấp (nhỏ 6mg nồng độ muối nhỏ 0,5%) không bị nhiễm bẩn amoniac nước giải gia súc Chất phải ẩm khơng q ướt Thùng ni giun có dung tích 10 lít đến 50 lít thích hợp Để có giun với khối lượng độ tuổi đủ tiêu chuẩn, tốt nên bắt đầu nuôi từ trứng Đặt giun trưởng thành vào hộp ni chứa chất để đẻ trứng lấy chúng sau 14 đến 28 ngày Giun sử dụng cho đợt sinh sản tiếp Những giun nở từ ổ trứng dùng để thử trưởng thành (sau tháng, phải 12 tháng tuổi) Thực ni phòng điều hồ nhiệt độ 20 oC ± 2oC thích hợp nhiệt độ giun trưởng thành sau tháng đến tháng Phụ lục B (tham khảo) Các kỹ thuật đếm giun nở từ trứng Việc đếm giun tay tốn phí thời gian Có hai phương pháp tách giun khỏi chất đất nhanh giới thiệu a) Thùng thử đặt vào nồi cách thuỷ, nhiệt độ 50oC đến 60oC Sau khoảng 20 phút giun xuất bề mặt chất dễ dàng tách chúng đếm Phải kiểm tra hiệu phương pháp Nếu giun thu nhặt tay, cần phải kiểm tra lại b) Nếu than bùn phân bò nghiền thành bột mịn, đất thử rửa rây sử dụng phương pháp sau [9], phương pháp cho phép xác định số lượng trứng số lượng giun cần đếm Dùng rây có lỗ 0,5 mm (đường kính 30 cm) chồng lên Các vật bên thùng thử rửa rây tia nước mạnh, giun trứng lại rây Cần phải lưu ý bề mặt phía rây lúc ướt suốt trình này, giun bò lớp nước mỏng, tránh cho chúng không chui vào lỗ rây Kết tốt dùng vòi hoa sen Sau đất trơi hết, giun trứng tráng nước cho vào hộp riêng Các trứng rỗng lên mặt nước, giun chìm phía đáy hộp Khi chắt hết nước, giun chuyển vào đĩa Petri với chút nước Dùng kìm kẹp để nhặt giun đếm Phụ lục C (tham khảo) Xác định khả giữ nước đất nhân tạo Xác định khả giữ nước đất nhân tạo theo TCVN 6651:2000 (ISO 11274:1998), Chất lượng đất- Xác định đặc tính giữ nước - Phương pháp phòng thí nghiệm Phụ lục D (tham khảo) Thử ảnh hưởng chưa tử vong thuốc bảo vệ thực vật giun đất Eisenia fetida fetida E fetida andrei D.1 Khái quát Phương pháp thích hợp việc nghiên cứu phòng thử hiệu ứng phụ giun đất Chú ý ảnh hưởng chưa gây tử vong, cách sử dụng nồng độ thuốc phù hợp với thực tế canh tác Mức độ áp dụng vùng điều chỉnh, có lưu ý đến chiều sâu đất sử dụng thử, cho nồng độ chất thử đất thường cao nồng độ áp dụng thực tế Khi thử thuốc bảo vệ thực vật, phương thức áp dụng cho giống với thực tế canh tác, thí dụ sử dụng bình phun ruộng thử cho ô nhỏ Số lượng chất sử dụng phải kiểm tra kỹ thuật hiệu chuẩn (thí dụ cách cân) Đối với thuốc bảo vệ thực vật, phép thử cuối phải tiến hành nhiều tỷ lệ dựa tính tốn sử dụng thuốc dự định trước với lượng nước từ 600l/ha đến 800l/ha Các dạng đặc biệt thuốc bảo vệ thực vật bột, hạt viên phải dùng theo cách phù hợp với sử dụng thông thường nông nghiệp Không dùng thuốc bảo vệ thực vật giun mặt đất! Sau cho thuốc bảo vệ thực vật, để thùng thử trạng thái hở vòng dung môi bay D.2 Chất đối chiếu (xem 7.3) Một lượng 250g ai/ha đến 500g ai/ha chất carbendazim khuyến cáo để sử dụng chất độc chuẩn Chất độc chuẩn phải kiểm tra lần năm D.3 Biểu thị kết Chỉ rõ đơn vị miligam mét vuông mặt đất, tỷ lệ sử dụng cao mà không gây tử vong, thay đổi đáng kể sinh khối giun trưởng thành, giảm đáng kể số giun Phụ lục E (tham khảo) Xác định ảnh hưởng sinh sản giun đất ô nhiễm E.1 Giới thiệu Phương pháp mô tả tiêu chuẩn thích hợp để so sánh sinh sản giun số loại đất E.2 Nguyên tắc Những ảnh hưởng tăng trưởng sinh sản giun trưởng thành (Eisenia fetida fetida E fetida andrei) tỷ lệ sống trứng nở xác định đất thử đất đối chứng Nếu mục đích đánh giá ảnh hưởng đất bị nghi nhiễm, tất tính chất đất đối chứng phải gần giống đến mức tối đa với đất thử, khác khơng có chất ô nhiễm E.3 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị mô tả điều E.4 Cách tiến hành E.4.1 Chuẩn bị đất thử Nếu mẫu đất chọn tính chất sau phải xác định báo cáo a) pH, theo TCVN 5979:1995 (ISO 10390); b) Khả trao đổi cation, theo TCVN 6646:2000 (ISO 11260); c) Hàm lượng chất hữu cơ, theo TCVN 6642:2000 (ISO 10694); d) Phân bố kích thước hạt, theo TCVN 6862 : 2001 (ISO 11277); e) Tỷ khối, theo TCVN 6860 : 2001 (ISO 11272); f) Hàm lượng nước, theo TCVN 6648:2000 (ISO 11465); g) Khả giữ nước, theo TCVN 6651:2000 (ISO 11274); h) Sinh khối vi sinh, theo TCVN 6856 - : 2001 (ISO 14240); Phải sử dụng it mẫu lặp lại loại đất đất đối chứng Đất sử dụng phải đạt khả giữ nước từ 40% đến 60% phải xác định ghi lại pH hàm lượng nước đất thời điểm bắt đầu kết thúc phép thử E.4.2 Tiến hành thử Cho giun vào thùng theo 7.2.3 đặt thùng vào phòng thử có bao che (6.3.1) tiến hành xác định theo 7.2.4 E.5 Biểu thị kết Đối với mẫu đất, xác định phần trăm tử vong, phần trăm tăng/giảm sinh khối giun trưởng thành số giun sinh So sánh giá trị trung bình với đối chứng phương pháp thống kê thích hợp với mức y nghĩa (α=0,05) Phụ lục F (tham khảo) Cách thực hồn chỉnh phương pháp F.1 Khái qt Tóm tắt việc hoàn chỉnh phương pháp dựa kết 30 cơng trình tiến hành loại phương tiện thử trình bày bảng Phương pháp sử dụng phù hợp với thử hiệu ứng phụ thuốc bảo vệ thực vật trình bày phụ lục D F.2 Chỉ tiêu hợp lệ Bảng F.1 - Chỉ tiêu hợp lệ phần trăm phép thử đáp ứng tiêu Chỉ tiêu Giá trị giới hạn Phù hợp với % cơng trình (n = 30) Tỷ lệ giun chết phép thử đối chứng Tỷ lệ sinh sản giun thùng đối chứng CV giun thùng đối chứng ≤10% 100 ≥ 30 83 ≤ 30% 67(33 30 50) F.3 Độ nhạy hệ thống thử Độ nhạy hệ thống thử đo cách tính tốn tất kết lần thử khác nhau, khác biệt đáng kể số giun so với phép thử đối chứng Để so sánh tốt tỷ lệ % giảm chia làm loại Bảng F.2 kết tất phép thử với liều khác đáp ứng tiêu hợp lệ Bảng rõ khác biệt từ 30% đến 40% giảm số giun hệ thống thử so với phép thử đối chứng đạt yêu cầu Bảng F.2 - Độ nhạy hệ thống thử nghiệm dựa 45 kết 19 phép thử đáp ứng tiêu hợp lệ % giun giảm so với đối chứng Số kết Kết quan trọng, tính % kết (phương pháp William) 60 15 100 F.4 Kết phép thử sử dụng chất hoạt động benomyl carbendazim làm chất đối chứng Bảng F.3 - Kết 11 phép thử sử dụng benomyl carbendazim làm chất đối chứng Chất đối chứng Benomyl Tỷ lệ sử dụng g ai/ha % sinh sản đối chứng 125 39* 625 36* 625 0* Carbendazim 625 4* 750 0* 850 0* 1000 10* 1000 8* 900 5* 1260 19* 2520 5* * Khác biệt tin cậy so với đối chứng Bảng F.3 rõ 30% giảm sinh sản tất tỷ lệ sử dụng So sánh với đối chứng ảnh hưởng số giun đáng kể tất trường hợp Kết cho thấy liều 750g ai/ha giảm hệ số lớn Phụ lục G (tham khảo) Tài liệu tham khảo [1] Bouches, M.B.1972: omboucien (giun Pháp) Môi trường học hệ thống, NXB Viện Quốc Gia nông nghiệp [2] Edwars, C A, 1993 Xây dựng phương pháp tiêu chuẩn để đánh giá độc tính hố chất giun đất Báo cáo EUR 8714 EN, tiểu ban Hội đồng châu Âu [3] Edwards, C A Bohlen P J., 1996 Sinh học giun đất, XB lần thứ 3.Chapman Hall, London [4] Jaenicke, J "Eisenea foetida " hai loài sinh học, Megaclri logcea, 1982, trang 6-8 [5] Kokta, C., 1992 Phương pháp thử nghiệm phòng thử ảnh hưởng gây tử vong thuốc bảo vệ thực vật giun đất Eisenea fetida, độc tính mơi trường giun đất NXB P.W Greing - Smith, H.Becker, P.J Edwards F Heimbach: Intercept, Andover, Hants, Vương quốc Anh UK, trang 213 - 216 [6] OECD dẫn để kiểm tra hoá chất 207 g giun đất thử nghiệm độc tính cấp Nhân 4: tháng 4, 1984 [7] Oien, N J Stenersen, Esterases cuả giun đất - III phương pháp điện tử phát Eisenea foetida (Savigny) loài Comp Biochem Physiol., 78c, (2) 1984 trang 277 - 282 [8] Chỉ 87/302/CEE-18, tháng 11, 1987 [9] Van Gestel, C.A.M, Van Dis, W.A Van Breemen, E.M P.M Sparenburg: So sánh hai phương pháp xác định độ nở trứng giun thử độc tính giun đất Pedoliologia, 32, 1998, trang 367 - 371 [10] Van Gesdtel, C A M, Van Dis, W A, van Hreemen, E.M vaf P.M Sparenburg: Triển khai thử nghiệm độc tính tái tạo (sinh sản) tiêu chuẩn với loài giun đất Eisenia fetida andrei có sử dụng đồng, Pentaclo phenol 2, Diclo roanitine, an tồn mơi trường độc tính sinh , 18, 1989, trang 305 - 312 [11] Neuhauser, E.F C.A Callahan Tăng trưởng sinh sản giun đất Eisenia fetida tiếp xúc với nồng độ chưa gây tử vong hoá chất hữu Sinh hoá sinh học đất, 22 (2), 1990, trang 175 - 179 ... cơ, theo TCVN 6642:2000 (ISO 10694); d) Phân bố kích thước hạt, theo TCVN 6862 : 2001 (ISO 11277); e) Tỷ khối, theo TCVN 6860 : 2001 (ISO 11272); f) Hàm lượng nước, theo TCVN 6648:2000 (ISO 11465);... so với giun ni chất khơng có thức ăn [điều kiện mô tả TCVN 5961:1995 (ISO1 126 8- :1993)] Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị phòng thí nghiệm chuẩn, và: 6.1 Các thùng chứa, có dung tích lít đến lít... Cách tiến hành E.4.1 Chuẩn bị đất thử Nếu mẫu đất chọn tính chất sau phải xác định báo cáo a) pH, theo TCVN 5979:1995 (ISO 10390); b) Khả trao đổi cation, theo TCVN 6646:2000 (ISO 11260); c) Hàm