NGHIÊN CỨU HỆ HAI PHA LỎNG THÂN NƯỚC IPA/(NH4)2SO4 ỨNG DỤNG TRONG TINH CHẾ RUTIN TỪ NỤ HOA HÒE

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THANH HẰNG NGHIÊN CỨU HỆ HAI PHA LỎNG THÂN NƢỚC IPA/(NH4)2SO4 ỨNG DỤNG TRONG TINH CHẾ RUTIN TỪ NỤ HOA HỊE KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI - 2019 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI LÊ THỊ THANH HẰNG Mã sinh viên: 1401191 NGHIÊN CỨU HỆ HAI PHA LỎNG THÂN NƢỚC IPA/(NH4)2SO4 ỨNG DỤNG TRONG TINH CHẾ RUTIN TỪ NỤ HOA HỊE (KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ) Người hướng dẫn: DS.Trần Trọng Biên Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dƣợc HÀ NỘI - 2019 LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài em nhận bảo, giúp đỡ hướng dẫn tận tình DS.Trần Trọng Biên Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới giúp đỡ Em xin trân thành cảm ơn tồn thể thầy đặc biệt PGS.TS Nguyễn Văn Hân TS Bùi Thị Thúy Luyện, anh chị kĩ thuật viên Bộ môn Công nghiệp Dược tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo Trường Đại học Dược Hà Nội dạy dỗ bảo em năm tháng học tập trường Cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè động viên giúp đỡ em suốt thời gian qua Do thời gian trình độ có hạn nên đề tài em khơng thể tránh khỏi thiết sót Vì vậy, em mong nhận dạy góp ý thầy cô bạn Em xin chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 10 tháng năm 2019 Sinh viên Lê Thị Thanh Hằng MỤC LỤC DANH MỤC KÍ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ hai pha lỏng thân nước 1.1.1 Khái quát hệ hai pha lỏng thân nước chiết phân bố sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước 1.1.2 Phân loại 1.1.3 Ứng dụng 1.1.4 Hệ hai pha alcol-muối 1.2 Cây Hòe 11 1.2.1 Đặc điểm thực vật, phân bố 12 1.2.2 Thành phần hóa học 12 1.3 Rutin 12 1.3.1 Cơng thức hóa học 12 1.3.2 Tính chất 13 1.3.3 Các phương pháp chiết rutin 14 1.3.4 Các phương pháp tinh chế rutin 14 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 17 2.1.1 Mẫu nghiên cứu 17 2.1.2 Dung mơi, hóa chất 17 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ 18 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Phương pháp xây dựng giản đồ pha 18 2.3.2 Phương pháp khảo sát thông số ảnh hưởng đến hệ số phân bố rutin hai pha hiệu suất thu hồi rutin pha giàu cồn 19 2.3.3 Phương pháp tinh chế rutin từ dịch chiết 20 2.3.4 Phương pháp định tính rutin 23 2.3.5 Phương pháp định lượng rutin 23 CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 27 3.1 Kết xây dựng đường chuẩn 27 3.1.1 Đường chuẩn định lượng phương pháp đo quang 27 3.1.2 Đường chuần định lượng phương pháp TLC scaning 28 3.2 Kết xây dựng giản đồ pha 30 3.3 Khảo sát thông số ảnh hưởng đến phân bố rutin hệ hai pha lỏng thân nước IPA/(NH4)SO4 32 3.3.1 Khảo sát sơ phân bố rutin hai pha 32 3.3.2 Ảnh hưởng % khối lượng isopropanol thêm vào hệ 33 3.3.3 Ảnh hưởng %(NH4)2SO4 thêm vào hệ 34 3.3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung dịch natri tetraborat 35 3.3.5 Ảnh hưởng thời gian chiết phân bố hệ chất lỏng 36 3.3.6 Ảnh hưởng nồng độ rutin 37 3.4 Kết ứng dụng hệ hai pha lỏng thân nước IPA/(NH4)2SO4 vào tinh chế rutin từ dịch chiết nụ Hòe 39 3.4.1 Kết định tính rutin pha trên, pha kết tủa hai pha 39 3.4.2 Kết định lượng rutin pha giàu cồn hiệu suất thu rutin pha giàu cồn 39 3.4.3.Hiệu suất thu sản phầm rutin thực tế 40 3.4.4 Độ tinh khiết sản phẩm 40 3.5 Kết so sánh hai phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước kết tinh 40 3.5.1 Về phương pháp tiến hành 40 3.5.2 Cảm quan sản phẩm hiệu suất thu sản phẩm 41 3.5.3 Về độ tinh khiết sản phẩm 43 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu ATPS BMMI ENIM EtOAc EtOH HPLC HPTLC IPA KL SD SKLM TB TLC TLC scaning Tiếng Việt Hệ hai pha lỏng thân nước 1-butyl-3-methylimidazolium tetraflouroborat 1-ethyl-3-methylimidazolium acetat Ethyl Acetat Ethanol Sắc ký lỏng hiệu cao Sắc ký lớp mỏng hiệu cao Isopropanol Khối lượng Độ lệch chuẩn Sắc ký lớp mỏng Giá trị trung bình Sắc kí lớp mỏng Sắc kí lớp mỏng kết hợp đo mật độ quang DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng 1.1 Một số ứng dụng hệ hai pha lỏng thân nước chiết xuất tinh chế chất 2.1 Dung mơi, hóa chất sử dụng nghiên cứu 3.1 Kết xây dựng đường chuẩn đo quang 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn định lượng TLC scaning 3.3 Kết xây dựng giản đồ pha 3.4 Hiệu suất thu rutin lên pha giàu cồn tinh chế hệ IPA/(NH4)2SO4 3.5 Hiệu suất thu rutin phương pháp tinh chế sử dụng hệ IPA/(NH4)2SO4 3.6 Hiệu suất thu hồi rutin hai phương pháp Trang 17 27 29 31 40 40 42 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1 1.2 2.1 2.2 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.12 3.13 3.14 3.15 3.16 Tên hình Giản đồ pha hệ hai pha lỏng thân nước alcol/muối Cấu trúc hóa học rutin quercetin Ngun liêu nụ Hòe Sơ đồ quy trình chiết tinh chế rutin từ nụ hoa Hòe sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước kết tinh Đường chuẩn định lượng rutin phương pháp đo quang Sắc kí đồ rutin định lượng phương pháp TLC scaning Đường chuẩn định lượng rutin phương pháp TLC scaning Giản đồ pha hệ hai pha lỏng thân nước isopropanol/ (NH4)2SO4 Sự tách pha hệ isopropanol/(NH4)2SO4 với rutin chuẩn Ảnh hưởng %isopropanol đến phân bố rutin Ảnh hưởng %(NH4)2SO4 đến phân bố rutin Ảnh hưởng nồng độ dung dịch natri tetraborat đến phân bố rutin Ảnh hường thời gian chiết phân bố đến phân bố rutin Ảnh hưởng nồng độ rutin đến phân bố rutin Định tính rutin hai pha phần kết tủa hai pha Sản phẩm thu sau tinh chế hệ isopropanol/ (NH4)2SO4 Sản phẩm thu sau tinh chế kết tinh Sắc kí đồ rutin chuẩn Sắc kí đồ rutin thử thu phương pháp tinh chế sử dụng hệ isopropanol/(NH4)2SO4 Sắc kí đồ rutin thử thu sau tinh chế phương pháp kết tinh Trang 13 17 21 28 29 30 32 33 34 35 36 37 38 39 42 42 41 41 42 ĐẶT VẤN ĐỀ Rutin chất có tác dụng làm giảm tính thấm mao mạch, tăng sức bền thành mạch, y dược học ứng dụng để phòng điều trị chứng bệnh dẫn đến biến chứng nguy hiểm tai biến mạch máu xơ vữa động mạch tăng huyết áp, rối loạn tuần hoàn, suy giãn tĩnh mạch [1] Rutin chiết xuất từ nhiều nguồn ngun liệu, nụ Hòe biết đến nguyên liệu chủ yếu cho ngành công nghiệp sản xuất rutin Rutin chiết từ nụ Hòe phương pháp khác nhau, dịch chiết sau phải qua tinh chế để thu sản phẩm Đã có số nghiên cứu tinh chế rutin phương pháp khác kết tinh, hấp phụ sử dụng nhựa macroporous, sắc kí phân bố ngược dòng, chiết phân bố lỏng – lỏng [10] Mỗi phương pháp lại có ưu, nhược điểm riêng chiết phân bố lỏng – lỏng phương pháp sử dụng từ lâu Tuy nhiên chiết phân bố lỏng – lỏng cổ điển có nhược điểm sử dụng dung mơi hữu gây hại môi trường, nguy tồn dư dung môi sản phẩm, thiết bị phức tạp, khó khăn nâng quy mô Để khắc phục vấn đề phương pháp chiết phân bố lỏng – lỏng sử dụng hệ hai pha thân nước nghiên cứu cho thấy hiệu nhiều trường hợp với ưu điểm như: rút ngắn thời gian chiết xuất tinh chế, sử dụng dung mơi rẻ tiền, dễ kiếm, an tồn với sức khỏe thân thiện với môi trường, thu sản phẩm có độ tinh khiết hiệu suất thu hồi cao, dễ nâng quy mô Nhằm xây dựng phương pháp tinh chế rutin từ dịch chiết Hòe hoa đơn giản, dễ thực hiện, rút ngắn thời gian, sử dụng dung mơi khơng độc hại, cho sản phẩm có độ tinh khiết cao dễ ứng dụng vào thực tế, đề tài “Nghiên cứu hệ hai pha lỏng thân nước ứng dụng tinh chế rutin từ nụ Hoa hòe” thực với mục tiêu: Xây dựng giản đồ pha hệ hai pha lỏng thân nước IPA/(NH4)2SO4 Khảo sát thông số ảnh hưởng đến phân bố rutin hai pha hệ hai pha lỏng thân nước IPA/(NH4)2SO4 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Hệ hai pha lỏng thân nƣớc 1.1.1 Khái quát hệ hai pha lỏng thân nước chiết phân bố sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước Hệ hai pha lỏng hệ gồm hai dung môi không không trộn lẫn vào thường sử dụng chiết phân bố Chiết phân bố (còn gọi chiết lỏng – lỏng) phương pháp tách thành phần dung dịch dựa phân bố không đồng thành phần hai pha lỏng không đồng tan Phương pháp chiết phân bố cổ điển sử dụng dung môi hữu ether, cloroform, ethyl acetat, n-hexan, butanol, ngày bộc lộ nhiều nhược điểm lượng dung môi hữu sử dụng lớn, ảnh hưởng đến môi trường, tồn dư dung môi sản phẩm, cần sử dụng thiết bị phức tạp, khó nâng quy mô, Để khắc phục vấn đề này, phương pháp chiết phân bố sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước nghiên cứu, ứng dụng ngày nhiều Hệ hai pha lỏng thân nước hệ gồm nước chất lỏng dung môi thân nước (đồng tan với nước) điều kiện xuất chất cạnh tranh liên kết với nước liên kết nước với dung mơi thân nước yếu gây tách pha Chiết phân bố pha thân nước kỹ thuật chiết phân bố lỏng – lỏng quan tâm nghiên cứu ngày nhiều tiềm lớn việc chiết tách, tinh chế làm giàu sản phẩm sinh học protein, enzym, acid nucleic số phân tử sinh học có phân tử lượng nhỏ hợp chất phenolic, anthocyanidin, chất màu… với ưu điểm hiệu suất thu hồi cao, ảnh hưởng đến hoạt tính phân tử mục tiêu, bị ảnh hưởng nâng cấp quy mơ, có khả hoạt động liên tục, thân thiện với môi trường tương đối hiệu mặt kinh tế [6], [24] Phương pháp sử dụng trình bước kết hợp đồng thời loại tạp phân tách phân tử mục tiêu [31] 1.1.2 Phân loại nghiệm: giữ nguyên thông số hệ bao gồm thời gian lắc (20 phút),khối lượng muối (NH4)2SO4 thêm vào hệ (1,4 g), khối lượng cồn isopropanol thêm vào hệ (5 g), nồng độ dung dịch natri tetraborat (2%) Thay đổi nồng độ rutin ban đầu nước từ mg/mL đến 20 mg/mL Các kết ghi lại sử dụng để tính tốn K H mục 2.3.2.2 Kết biễu diễn 100 90 80 70 60 50 40 H 30 K 20 Hệ só phân bố K Hiệu suất thu hồi H (%) Hình 3.10 10 0 10 15 20 Nồng độ rutin (mg/mL) Hình 3.10: Ảnh hưởng nồng độ rutin đến phân bố rutin Từ đồ thị ta thấy thay đổi nồng độ rutin K H thay đổi không đáng kể Có thể nói khoảng nồng độ khảo sát nồng độ rutin ảnh hưởng đến hệ số phân bố hiệu suất thu hổi rutin Mức độ ảnh hưởng thông số đến hệ số phân bố K hiệu suất thu hồi rutin H khác Các thông số quan trọng ảnh hưởng đến K H bao gồm %IPA, %(NH4)2SO4, nồng độ dung dịch natri tetraborat sử dụng thời gian chiết phân bố nồng độ rutin ảnh hưởng đến phân bố rutin hai pha Dựa vào kết khảo sát bên lựa chọn hệ hai pha lỏng thân nước gồm IPA/(NH4)2SO4 sử dụng tinh chế rutin từ dịch chiết nụ hòe để đảm bảo trình tinh chế hiệu gồm %IPA=55%, %(NH4)2SO4=15%, thời gian chiết phân bố 20 phút 38 3.4 Kết ứng dụng hệ hai pha lỏng thân nƣớc IPA/(NH4)2SO4 vào tinh chế rutin từ dịch chiết nụ Hòe Tiến hành bước tinh chế mục 2.3.3.2 3.4.1 Kết định tính rutin pha trên, pha kết tủa hai pha Sau chiết phân bố để tách pha cân định tính rutin pha giàu cồn (pha trên), pha giàu muối (pha dưới) phần kết tủa hai pha phương pháp TLC.Thu kết quả: Rutin chuẩn Pha giàu nước Pha giàu muối Kết tủa hai pha methanol Hình 3.11: Định tính rutin hai pha phần kết tủa hai pha Pha giàu cồn cho vết sắc kí tương đương vị trí màu sắc so với vết sắc kí rutin chuẩn pha giàu muối kết tủa hai pha hòa methanol khơng thấy xuất vết rutin Như rutin phân bố chủ yêu lên pha bên phần kết tủa hai pha rutin mà tạp chất bị loại tinh chế 3.4.2 Kết định lượng rutin pha giàu cồn hiệu suất thu rutin pha giàu cồn Tiến hành định lượng nồng độ rutin thu pha bên phương pháp TLC scaning Từ tính tổng lượng rutin dịch chiết lên pha giàu cồn thông qua nồng độ rutin pha bên thể tích pha bên Bảng 3.4: Hiệu suất thu rutin lên pha giàu cồn tinh chế hệ IPA/(NH4)2SO4 39 Lần TB± SD Lượng dược liệu (g) 6,65 6,64 6,66 6,65± 0,01 Diện tích pic (mAU.s) 59834 61231 59835 60300± 806 Lượng rutin lên pha (g) 2,78 2,87 2,78 2,81± 0,05 Hiệu suất (%) 41,7 43,2 41,7 42,2± 0,9 Lượng rutin phân bố lên pha giàu cồn chiếm 42,2 ± 0,9% so với lượng dược liệu ban đầu 3.4.3 Hiệu suất thu sản phầm rutin thực tế Cân xác định khối lượng sản phẩm rutin thu sau sấy khô Xác định hiệu suất thu rutin tỉ lệ rutin thu so với lượng dược liệu ban đầu Kết ghi lại Bảng 3.5 Bảng 3.5: Hiệu suất thu rutin phương pháp tinh chế sử dụng hệ IPA/(NH4)2SO4 Lần TB± SD Sử dụng hệ IPA/(NH4)2SO4 KL dược liệu (g) KL sản phẩm (g) 6,65 1,80 6,64 1,80 6,66 1,83 6,65 1,81 ±0,01 ±0,02 Hiệu suất (%) 27,0 27,1 27,4 27,2 ± 0,2 Hiệu suất thu rutin thực tế đạt 27,2 ± 0,2%, chiếm 64,4% so với tổng lượng rutin phân bố lên pha giàu cồn 3.4.4 Độ tinh khiết sản phẩm Sản phẩm thu sau tinh chế phương pháp sử dụng hệ IPA/(NH4)2SO4 đem định lượng xác định hàm lượng rutin phương pháp HPLC, kết sau sử dụng để tính toán hàm lượng rutin mục 2.3.5.3 Thu kết hàm lượng rutin mẫu thử thu sau tinh chế dịch chiết nụ Hòe hệ hai pha lỏng thân nước đạt 96,5% 3.5 Kết so sánh hai phƣơng pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha lỏng thân nƣớc kết tinh 3.5.1 Về phương pháp tiến hành 40 Dịch chiết nụ hòe dung dịch natri tetraborat chia làm hai phần, tiến hành tinh chế song song hai phương pháp: phương pháp kết tinh phương pháp sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước Tiến hành so sánh hai phương pháp bước tiến hành mức độ phức tạp phương pháp Phương pháp tinh chế kết tinh phải tiến hành qua bước kết tinh – tẩy màu – kết tinh lại Thời gian tiến hành thường 72h Thời gian tiến hành lâu dẫn tới rutin tiếp xúc lâu với nước acid gây thủy phân tạo tạp chất đặc biệt quercetin khó tách q trình tinh chế Giai đoạn tẩy màu tốn lượng để hòa tan lại rutin thơ cồn, than hoạt hấp phụ rutin gây hao phí Tuy nhiên phương pháp lại có ưu điểm tiến hành đơn giản, thiết bị không cần phức tạp Với phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha thân nước IPA/(NH4)2SO4 cần tiến hành qua bước chiết phân bố - kết tinh Thời gian tiến hành rút ngắn xuống 24h, hạn chế tiếp xúc rutin với nước acid nên giảm lượng tạp chất Tuy nhiên phương pháp lại có nhược điểm nguyên liệu đắt tiền, tiến hành phức tạp so với kết tinh 3.5.2 Cảm quan sản phẩm hiệu suất thu sản phẩm Sản phẩm rutin sau tinh chế hai phương pháp đem sấy khô tới hàm ẩm < 5% So sánh cảm quan sản phẩm thu được, cân xác định khối lượng sản phẩm thu từ tính tốn hiệu suất thu rutin 3.5.2.1 Cảm quan sản phẩm Sản phẩm rutin thu hai phương pháp tinh chế chụp lại Hình 3.11 Hình 3.12 41 Hình 3.12: Sản phẩm thu sau tinh chế hệ isopropanol/(NH4)2SO4 (Trái) Hình 3.13: Sản phẩm thu sau tinh chế kết tinh (Phải) Sản phẩm rutin thu phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha thân nước có màu vàng nhạt sản phẩm thu phương pháp kết tinh lại có màu vàng lục nhạt Sự khác màu sắc than hoạt tẩy màu tốt 3.5.2.2 Hiệu suất thu hồi rutin Hiệu suất thu hồi thực tế xác định cách cân lượng sản phẩm thu chia cho lượng dược liệu ban đầu kết ghi lại Bảng 3.6 Bảng 3.6: Hiệu suất thu hồi rutin hai phương pháp Lần TB± SD Sử dụng hệ IPA/(NH4)2SO4 KL dược KL sản Hiệu liệu (g) phẩm (g) suất (%) 6,65 1,7980 27,0 6,64 1,8027 27,1 6,66 1,8272 27,4 6,65 1,8093 27,2 ±0,01 ±0,0157 ± 0,2 KL dược liệu (g) 6,65 6,64 6,66 6,65 ±0,01 Kết tinh KL sản phẩm (g) 1,8963 1,9334 1,9408 1,9235 ±0,0238 Hiệu suất (%) 28,5 29,1 29,1 28,9 ±0,3 Như phương pháp tinh chế kết tinh cho hiệu suất thu cao so với phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước Tuy nhiên hiệu suất thu rutin lên pha giàu cồn cao đạt 42,2% Do để tăng hiệu suất trình tinh chế rutin phương pháp sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước 42 IPA/(NH4)2SO4 cần tìm biện pháp để tăng khả thu hồi rutin pha giàu cồn 3.5.3 Về độ tinh khiết sản phẩm Để so sánh độ tinh khiết sản phẩm rutin thu hai phương pháp tiến hành định lượng rutin so sánh tạp chất phương pháp sắc kí lỏng hiệu HPLC Các điều kiện sắc kí tiến hành nêu mục 2.3.4.3 mẫu chuẩn thử pha sau: Mẫu chuẩn: Cân xác 10 mg rutin chuẩn cho vào bình định mức 100mL, hòa tan khoảng 70 mL methanol Thêm methanol vạch lắc đều, đem siêu âm 10 phút Lọc qua màng lọc 0,45µm Mẫu thử: Cân xác 10 mg rutin thử cho vào bình định mức 100 mL, hòa tan khoảng 70 mL methanol Thêm methanol vạch lắc đều, đem siêu âm 10 phút Lọc qua màng lọc 0,45 µm Hệ thống HPLC chạy ổn định với pha động 30 phút trước tiêm mẫu vào Tiến hành tiêm mẫu chuẩn rutin mẫu thử Sắc kí đồ mẫu chuẩn, mẫu thử phương pháp kết tinh mẫu thử phương pháp tinh chế hệ hai pha thân nước ghi lại sau: Hình 3.14: Sắc kí đồ rutin chuẩn 43 Sắc kí đồ dung dịch rutin chuẩn nồng độ 0,1020 mg/mL cho pic thời gian lưu tR= 9,059 phút, diện tích pic 6187228 Hình 3.15: Sắc kí đồ rutin thử thu phương pháp tinh chế sử dụng hệ isopropanol/(NH4)2SO4 Sắc kí đồ rutin thử (10,3 mg pha 100 mL dung dịch) cho pic sắc kí Pic có thời gian lưu tR= 9,023 phút tương đương với tR rutin chuẩn diện tích pic 6154305 Pic pic tạp chất có tr= 24,523 phút diện tích pic 198955 Hình 3.16: Sắc kí đồ rutin thử thu sau tinh chế phương pháp kết tinh 44 Sắc kí đồ rutin thử thu phương pháp tinh chế kết tinh cho pic sắc kí Pic có thời gian lưu tR= 8,724 phút tương đương với tR rutin chuẩn diện tích pic 6015299, pic pic tạp chất có tr2 = 13,713 phút diện tích pic 158932, pic pic tạp chất có tr3= 23,430 phút diện tích pic 753182 Từ kết thu áp dụng cơng thức tính tốn mục 2.3.5.3 thu kết quả: Mẫu thử rutin thu phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước IPA/(NH4)2SO4 HLrutin1= 96,5 (sản phẩm rutin thu phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha thân nước IPA/(NH4)2SO4 đạt độ tinh khiết lên đến 96,5%) Mẫu thử rutin thu phương pháp tinh chế kết tinh HLrutin2= 95,2% (sản phẩm rutin thu phương pháp kết tinh đạt độ tinh khiết 95,2%) Như phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước mặc hiệu suất thấp so với phương pháp tinh chế kết tinh (27,2% < 28,9%) lại cho sản phẩm có độ tinh khiết cao (96,5% > 95,2%), tạp chất (1 pic tạp chất < pic tạp chất), pic tạp chất tr khoảng 24 phút có diện tích nhỏ (198955< 753182) 45 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Sau thời gian thực đề tài “Nghiên cứu hệ hai pha lỏng thân nước ứng dụng tinh chế rutin từ nụ hoa hòe” đạt mục tiêu nghiên cứu có kết luận sau: Giản đồ pha hệ hai pha lỏng thân nước IPA/(NH4)2SO4 xây dựng có phương trình: w1 = a1× + a2× +c a1 = 0,163, a2 = 100,3, b1 = 0,498, b2 = 7,345, c =2,077 Hệ hai pha lỏng thân nước gồm cồn isopropanol muối (NH4)2SO4 hệ phù hợp để tinh chế rutin Khảo sát điều kiện, thông số ảnh hưởng đến hệ số phân bố hiệu suất thu hồi rutin lựa chọn điều kiện tối ưu cho trình tinh chế bao gồm: tỉ lệ % khối lượng isopropanol so với khối lượng toàn hệ 55%, tỉ lệ % khối lượng muối (NH4)2SO4 thêm vào so với khối lượng toàn hệ 15%, thời gian chiết phân bố hệ hai pha 20 phút Xây dựng quy trình tinh chế rutin từ dịch chiết nụ hoa Hòe dung dịch natri tetraborat 2% Từ 6,65g ngun liệu nụ hòe khơ thu khối lượng sản phẩm rutin 1,8093g tương ứng với hiệu suất thu 27,2%, hàm lượng rutin sản phẩm thu đạt 96,5% ĐỀ XUẤT Trên kết nghiên cứu bước đầu làm sở cho nghiên cứu Vì tơi xin đề xuất: Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa trình tinh chế rutin phương pháp tinh chế sử dụng hệ hai pha lỏng thân nước Nghiên cứu để tăng hiệu suất thu sản phẩm rutin từ pha giàu cồn 46 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Y Tế (2007), Dược liệu học tập I, tr 387-388 Đồn Thị Bình (2009), Nghiên cứu chiết xuất rutin từ hoa hòe phương pháp siêu âm, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học khóa 20042009, Đại học Dược Hà Nội Tống Xuân Quang (2015), Nghiên cứu thay đổi hàm lượng rutin phát triển hoa hòe nụ hoa hòe chế biến theo y học cổ truyền phương pháp HPTLC, Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ Đại học khóa 20102015, Đại học Dược Hà Nội Bộ môn Công Nghiệp Dược (2016), Kĩ thuật chiết xuất Dược liệu, Đại học Dược Hà Nội, tr 121-122 Tiếng Anh de Albuquerque Wanderley M.C., Wanderley Duarte Neto J M., et al (2017), "Purification and characterization of a collagenase from Penicillium sp UCP 1286 by polyethylene glycol-phosphate aqueous two-phase system", Protein Expr Purif, 133, pp 8-14 Iqbal Mujahid, Tao Yanfei, et al (2016), "Aqueous two-phase system (ATPS): an overview and advances in its applications", Biological procedures online, 18, pp 18-18 Simental-Martinez J., Rito-Palomares M., et al (2014), "Potential application of aqueous two-phase systems and three-phase partitioning for the recovery of superoxide dismutase from a clarified homogenate of Kluyveromyces marxianus", Biotechnol Prog, 30(6), pp 1326-34 Zhi W., Song J., et al (2004), "Partial purification of alpha-amylase from culture supernatant of Bacillus subtilis in aqueous two-phase systems", Bioprocess Biosyst Eng, 27(1), pp 3-7 Amid Mehrnoush, Shuhaimi Mustafa, et al (2012), "Purification of serine protease from mango (Mangifera Indica Cv Chokanan) peel using an alcohol/salt aqueous two phase system", Food Chemistry, 132(3), pp 1382-1386 10 Gullón Beatriz, Lú-Chau Thelmo A., et al (2017), "Rutin: A review on extraction, identification and purification methods, biological activities and approaches to enhance its bioavailability", Trends in Food Science & Technology, 67, pp 220-235 11 Guo Y X., Han J., et al (2012), "An ammonium sulfate/ethanol aqueous two-phase system combined with ultrasonication for the separation and purification of lithospermic acid B from Salvia miltiorrhiza Bunge", Ultrasonics Sonochemistry, 19(4), pp 719-724 12 Horosanskaia Elena, Minh Nguyen Tan, et al (2017), "CrystallizationBased Isolation of Pure Rutin from Herbal Extract of Sophora japonica L", Organic Process Research & Development, 21(11), pp 1769-1778 13 Li Yajuan, Wu Yanyang, et al (2017), Partition behavior of spiramycin in an aqueous two-phase system based on polyethylene glycol and sulfates, pp 496-502 14 Li Yuliang, Yang Siyu, et al (2017), "Phase equilibria and salt effect on the aqueous two-phase system of ethanol + 2-propanol + salt [(NH4)2SO4/Na2SO4] + water", Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 127(3), pp 2473-2487 15 Liu Qingfen, Yu Jiang, et al (2006), "Partitioning Behavior of Penicillin G in Aqueous Two Phase System Formed by Ionic Liquids and Phosphate", Separation Science and Technology, 41(12), pp 2849-2858 16 Liu Xingli, Mu Taihua, et al (2013), "Optimisation of aqueous two-phase extraction of anthocyanins from purple sweet potatoes by response surface methodology", Food Chemistry, 141(3), pp 3034-3041 17 Meng Li, Liu Renmin, et al (2009), Separation and Purification of Rutin and Acaciin from the Chinese Medicinal Herb Herba Cirsii by Combination of Macroporous Absorption Resin and High-Speed CounterCurrent Chromatography, pp 2-4 18 Mokhtarani Babak, Karimzadeh Ramin, et al (2008), "Partitioning of Ciprofloxacin in aqueous two-phase system of poly(ethylene glycol) and sodium sulphate", Biochemical Engineering Journal, 38(2), pp 241-247 19 Montalvo-Hernández Bertha, Rito-Palomares Marco, et al (2012), "Recovery of crocins from saffron stigmas (Crocus sativus) in aqueous two-phase systems", Journal of Chromatography A, 1236, pp 7-15 20 Rajni Hatti-Kaul "Aqueous Two-Phase Systems: Methods and Protocols", pp 21 Rangel Juan Carlos, Jacobo-Velázquez Daniel, et al (2017), "Aqueous Two-Phase System Strategies for the Recovery and Partial Purification of Bioactive Low Molecular Weight Compounds", pp 79-96 22 Rangel Juan Carlos, Jacobo-Velázquez Daniel, et al (2014), Primary recovery of bioactive compounds from stressed carrot tissue using Aqueous Two-Phase Systems strategies, pp 23 Reis Igor A O., Santos Samuel B., et al (2014), "Extraction and Recovery of Rutin from Acerola Waste using Alcohol-Salt-Based Aqueous Two-Phase Systems", Separation Science and Technology, 49(5), pp 656-663 24 Simental-Martínez Jesús, Montalvo-Hernández Bertha, et al (2014), "Application of Aqueous Two-Phase Systems for the Recovery of Bioactive Low-Molecular Weight Compounds", Separation Science and Technology, 49(12), pp 1872-1882 25 Simental-Martínez Jesús, Montalvo Hernandez Bertha, et al (2014), Application of Aqueous Two-Phase Systems for the Recovery of Bioactive Low-Molecular Weight Compounds, pp 1872-1882 26 Souza Ranyere, Ventura Sónia, et al (2015), Lipase purification using ionic liquids as adjuvants in aqueous two-phase systems, pp 1-8 27 Veberic Robert, Colaric Mateja, et al (2008), "Phenolic acids and flavonoids of fig fruit (Ficus carica L.) in the northern Mediterranean region", Food Chemistry, 106(1), pp 153-157 28 Wu Jianbing, Chen Zhe, et al (2011), "One Step Large-Scale Separation and Purification of Rutin from Boenninghausenia sessilicarpa by Countercurrent Chromatography", Separation Science and Technology, 46(3), pp 525-529 29 Wu Xiangyang, Liang Linghong, et al (2011), "Aqueous two-phase extraction, identification and antioxidant activity of anthocyanins from mulberry (Morus atropurpurea Roxb.)", Food Chemistry, 129(2), pp 443453 30 Yang Wu-Yung, Lin Chun-Der, et al (1994), Separation of desacetyl cephalosporin C by aqueous two-phase partition, pp 439-445 31 Yau Yee Koon, Ooi Chien Wei, et al (2015), "Current applications of different type of aqueous two-phase systems", Bioresources and Bioprocessing, 2(1), pp 49 32 Yixin Guan, Lehe Mei, et al (1994), Recovery of antibiotics by aqueous two-phase partition —Partitioning behavior of pure acetylspiramycin solution in polyethylene glycol/potassium phosphate aqueous two-phase systems, pp 33 Zhang Dan, Park Jin-a, et al., Zhang et al-2015-Journal of Separation Science 2015 34 Zhang Dong-Yang, Zu Yuan-Gang, et al (2013), "Aqueous two-phase extraction and enrichment of two main flavonoids from pigeon pea roots and the antioxidant activity", Separation and Purification Technology, 102, pp 26-33 35 Zhang Wei, Zhu Dan, et al (2015), "Simultaneous extraction and purification of alkaloids from Sophora flavescens Ait by microwaveassisted aqueous two-phase extraction with ethanol/ammonia sulfate system", Separation and Purification Technology, 141, pp 113-123 36 Zhao Zhanyi, Dong Lulu, et al (2011), Preliminary separation and purification of rutin and quercetin from Euonymus alatus ( Thunb.) Siebold extracts by macroporous resins, pp.266-272 ... nước) Để rutin k t tinh 24h đến 48h lọc ly t m thu lấy t a rutin K t tinh rutin ethanol thường ứng dụng tinh chế rutin t dịch chi t cồn bước tinh chế rutin t rutin thô Nguyên liệu chứa rutin sau... Ab = Vbpb At Trong đó: Vt, pt thể t ch t trọng pha (top) Vb, pb thể t ch t trọng pha (bottom) Hoặc t nh xác cách phân t ch thành phần pha: TLL = (ΔX2 + ΔY2)1/2 Trong đó: X nồng độ thành phần... rutin k t tủa 48h Lọc rửa t a đến nước rửa có pH trung t nh thu rutin thơ Rutin thơ hòa tan nóng với 30 phần EtOH, thêm than ho t đun nóng 30 ph t Lọc nóng loại bã than Dịch lọc c t thu hồi EtOH