Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8542:2010

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8542:2010. Tiêu chuẩn trình bày nội dung về thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng bacitracin kẽm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao. Mời các bạn cùng tham khảo.

TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8542 : 2010 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BACITRACIN KẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuff - Determination of zinc bacitracin content by high-perfomance liquid chromatographic method Lời nói đầu TCVN 8542:2010 chuyển đổi từ 10TCN 834:2006 thành Tiêu chuẩn Quốc gia theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn Kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 Chính phủ quy định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật; TCVN 8542:2010 Cục chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố THỨC ĂN CHĂN NI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG BACITRACIN KẼM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuff - Determination of zinc bacitracin content by high-perfomance liquid chromatographic method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng kháng sinh bacitracin kẽm (Znbacitracin) thức ăn chăn ni phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao (HPLC) Giới hạn định lượng phương pháp mg/kg Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6952:2011 (ISO 6498:1998) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử Nguyên tắc Zn-bacitracin mẫu thức ăn chăn nuôi chiết dung dịch đệm phosphat 0,5 M, pH 2, điều chỉnh dịch chiết thu đến pH 8,0, chiết pha lỏng-lỏng với etyl axetat, sau dịch chiết làm cột chiết pha rắn C18 phân tích hệ thống sắc kí lỏng hiệu cao với detector UV bước sóng 254 nm Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác 4.1 Nước dùng cho HPLC, tương đương 4.2 Axetonitril, loại dùng cho HPLC 4.3 Metanol, loại dùng cho HPLC 4.4 Etyl axetat, loại dùng cho HPLC 4.5 Diclometan, loại dùng cho HPLC 4.6 Natri sulfit (Na2SO3) 4.7 Dung dịch natri hydroxit (NaOH), 0,1 M Hòa tan 0,4 g Natri hydroxit 100 ml nước 4.8 Dung dịch đệm phosphat 4.8.1 Dung dịch đệm phosphat, nồng độ 0,06 M, pH Hòa tan 9,08 g kali dihydrophosphat (KH2PO4) nước bình định mức vạch 000ml thêm nước đến vạch mức, trộn (dung dịch I) Hòa tan 11,88 g natri hydrophosphat ngậm hai phân tử nước (Na 2HPO4.2H2O) nước vào bình định mức vạch 000 ml thêm nước đến vạch mức, trộn (dung dịch II) Trộn 5,5 ml dung dịch I 94,5 ml dung dịch II để 100 ml dung dịch đệm phosphat 0,06 M, pH 8,0 4.8.2 Dung dịch đệm phosphat, 0,3 M, pH Hòa tan 40,8 g kali dihydrophosphat 900 ml nước Chỉnh pH đến axit o-phosphoric 85 % Thêm nước đến 000 ml 4.8.3 Dung dịch đệm phosphat, 0,3 M, pH Pha dung dịch đệm phosphat 0,3 M 4.8.2 điều chỉnh pH đến axit ophosphoric 85 % Thêm nước đến 000 ml 4.9 Pha động 4.9.1 Dung môi A: dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH (4.8.3) có chứa natri dodexyl sulfat (C12H25O4SNa) nồng độ 20 mM (5,76 g 000 ml dung dịch đệm phosphat 0,3 M) 4.9.2 Dung môi B: hỗn hợp axetonitril (4.2): metanol (4.3) với tỷ lệ 19 : (phần thể tích) 4.9.3 Pha động HPLC chuẩn bị cách trộn dung môi A dung môi B với tỷ lệ 50 : 50 (phần thể tích) Sau lọc hỗn hợp dung dịch thu qua màng lọc 0,45 m, siêu âm đuổi khí 30 4.10 Dung dịch chuẩn 4.10.1 Dung dịch chuẩn gốc, 000 g/ml Cân 28 mg chất chuẩn Zn-bacitracin, xác đến 0,1 mg, vào bình định mức 25 ml (lượng cân điều chỉnh theo hàm lượng Zn-bacitracin), hòa tan định mức dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH Các dung dịch chuẩn gốc bảo quản lọ sẫm màu oC, bền tuần 4.10.2 Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc kí, 200 g/ml, 400 g/ml, 500 g/ml 000 g/ml Lấy xác ml, ml, ml 10 ml dung dịch chuẩn gốc 000 g/ml (4.10.1) cho vào bình định mức dung tích 10 ml, pha loãng định mức đến vạch dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH (4.8.3), thu dung dịch có nồng độ tương ứng 200 g/ml, 400 g/ml, 500 g/ml 000 g/ml Chuẩn bị dung dịch ngày sử dụng CHÚ THÍCH: Nếu sau pha h mà chưa sử dụng, bảo quản dung dịch chuẩn 4oC Tốt pha dung dịch chuẩn bảo quản oC 30 trước phân tích đưa trước chạy sắc kí Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường thiết bị, dụng cụ cụ thể sau: 5.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg 5.2 Cân, cân xác đến 0,01 g 5.3 Máy li tâm, tốc độ 000 r/min có ống li tâm dung tích 50 ml 5.4 Ống li tâm, dung tích 50 ml polypropylen thủy tinh, có nắp đậy 5.5 Máy lắc tròn máy lắc ngang đạt tốc độ 250 r/min 5.6 Máy đo pH, đo xác đến 0,05 đơn vị 5.7 Bình định mức, dung tích 10 ml, 100 ml 000 ml 5.8 Pipet tự động, điều chỉnh từ ml đến 10 ml 5.9 Micropipet, dung tích từ 10 l đén 100 l từ 200 l đến 000 l 5.10 Pipet tự động, dung tích ml, 10 ml 20 ml 5.11 Rây, có kích thước lỗ mm 5.12 Ống đong, dung tích 000 ml 5.13 Bình nón, dung tích 125 ml, có nắp thủy tinh 5.14 Bể siêu âm 5.15 Bơm hút chân không 5.16 Cột chiết pha rắn C18, loại 500 mg/3 ml 5.17 Màng lọc, có cỡ lỗ 0,45 m 5.18 Lọ nhỏ dùng cho HPLC, có nắp vặn PTFE 5.19 Thiết bị trộn mẫu phòng thử nghiệm loại Hobart Model C 100 T tương đương 5.20 Ống nghiệm, kích thước 10 mm x 100 mm 5.21 Thiết bị thổi khí nitơ, dùng để thổi dung mơi sử dụng dòng khí nitơ 5.22 Thiết bị chia mẫu Thiết bị chia đôi chia tư mẫu, ví dụ thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu phòng thử nghiệm thành mẫu thử đồng 5.23 Hộp đựng mẫu, có nắp đậy kín 5.24 Hệ thống HPLC, gồm có: 5.24.1 Máy sắc kí lỏng hiệu cao 5.24.2 Bình chứa dung mơi 5.24.3 Hệ thống bơm mẫu 5.24.4 Detector UV, đo bước sóng 254 nm 5.24.5 Bộ tích phân, máy tính xử lý liệu 5.24.6 Cột phân tích HPLC pha đảo, Hypersyl ODS 200 mm x 2,1 mm, cỡ hạt m loại tương đương 5.24.7 Cột bảo vệ, Hypersyl ODS 10 mm x 2,1 mm, cỡ hạt m loại tương đương Lấy mẫu chuẩn bị mẫu 6.1 Lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu [1] Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện, không bị hư hỏng bị biến đổi chất lượng trình vận chuyển bảo quản 6.2 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952:2001 (ISO 6498:1998) Nghiền mẫu phòng thử nghiệm (không nhỏ 500 g) để lọt qua rây có cỡ lỗ mm (5.11) Trộn mẫu thiết bị trộn phòng thử nghiệm (5.19) thời gian 10 Sau chia hỗn hợp thiết bị chia đôi thiết bị chia tư (5.23) đến thu lượng mẫu thử không nhỏ 100 g Các mẫu thử bảo quản hộp đựng mẫu (5.23) điều kiện nhiệt độ oC đến 25 oC, nơi khô LƯU Ý: Nên nghiền, trộn mẫu phòng có thơng gió, nên đeo kính, trang găng tay bảo vệ Cách tiến hành 7.1 Chiết làm mẫu thử 7.1.1 Chiết mẫu Cân khoảng g đến 10 g phần mẫu thử chuẩn bị theo 6.2 (tùy theo hàm lượng kháng sinh có mẫu), xác đến 0,1 mg, cho vào bình nón 125 ml (5.13), thêm từ 10ml đến 15ml dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH (4.8.2) Lắc mạnh bình nón máy lắc (5.5) thời gian 20 thêm 20 mg natri suflit (4.6) Chuyển dịch chiết vào ống li tâm thứ dung tích 50 ml (5.4), đậy nắp li tâm 10 tốc độ 000 r/min Gạn phần dịch vào ống li tâm thứ hai Phần cặn lại bình nón rửa thêm hai lần, lần dùng ml dung dịch đệm phosphat 0,3 M, pH (4.8.2), li tâm cho tất phần dịch chiết vào ống li tâm thứ hai 7.1.2 Làm 7.1.2.1 Chiết pha lỏng-lỏng Toàn dịch chiết ống li tâm thứ hai (7.1.1) chỉnh pH đến 8,0 dung dịch natri hydroxit 0,1 M (4.7), li tâm với tốc độ 000 r/min Chuyển phần dịch chiết vào ống nghiệm (5.20), phần kết tủa ống li tâm thứ hai xử lý hai lần, lần dùng 0,5 ml dung dịch đệm phostphat 0,3 M, pH (4.8.2), li tâm với tốc độ 000 r/min gộp phần dịch chiết vào ống nghiệm nêu Dịch chiết thu đem chiết lỏng-lỏng ba lần, lần dùng ml etyl axetat (4.4), loại bỏ lớp etyl axetat sau chiết 7.1.2.2 Chiết pha rắn Cột SPE (5.16) hoạt hóa ml diclometan (4.5), ml metanol (4.3), ml dung dịch đệm phosphat pH (4.8.1), sau chuyển dịch chiết thu 7.1.2.1 qua cột với tốc độ dòng ml/min Zn-bacitracin rửa giải ml metanol với tốc độ dòng 1ml/min, dịch rửa giải cho vào ống nghiệm khác cho bay đến khơ, sử dụng thiết bị thổi khí nitơ (5.21) nhiệt độ không lớn 30 oC Phần lại hòa tan 0,2 ml hỗn hợp gồm dung dịch đệm phosphat (0,3 M, pH 2) : axetonitril (4.2) theo tỷ lệ 70 : 30 (phần thể tích) lắc Lọc dịch thu cho qua màng lọc (5.17) vào lọ nhỏ dùng cho HPLC (5.18) để phân tích HPLC 7.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng mẫu thức ăn chăn nuôi xác định khơng có Zn-bacitracin Mẫu trắng chuẩn bị tương tự mẫu thử theo 7.1 7.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Việc xác định độ thu hồi thực cách cho lượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp pha từ dung dịch gốc vào g mẫu trắng (7.2) để đảm bảo mẫu có hàm lượng Zn-bacitracin nằm dãy đồ thị chuẩn, mẫu để yên 30 trước tiến hành chiết Sau tiếp tục trình chiết mẫu tương tự mẫu thử theo 7.1 7.4 Phân tích HPLC 7.4.1 Điều kiện sắc kí Nhiệt độ cột: 30oC; DetectorUV: bước sóng 254 nm; Pha động: theo 4.9; Tốc độ dòng: 0,5 ml/min; Thể tích bơm mẫu: 10 l 7.4.2 Phương pháp xác định 7.4.2.1 Nên sử dụng cột bảo vệ, việc sử dụng cột bảo vệ khơng có ảnh hưởng đến kết phân tích 7.4.2.2 Cân hệ thống sắc kí pha động (4.9) 30 trước bơm mẫu 7.4.2.3 Quy trình bơm mẫu theo thứ tự sau: dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu hồi, dịch mẫu thử, dung dịch chuẩn Cần bơm dịch chuẩn trước sau đợt phân tích, khơng nên để q 20 lần bơm mẫu cho đợt phân tích Nếu 20 lần phải bơm dung dịch chuẩn thêm lần vào khoảng đợt bơm mẫu 7.4.2.4 Xác định diện tích pic Zn-bacitracin dung dịch chuẩn mẫu thử tương ứng Tính nồng độ Zn-bacitracin mẫu thử dựa vào đường chuẩn 7.4.2.5 Sau chạy máy phải làm hệ thống HPLC hỗn hợp gồm nước : axetonitril (4.2) theo tỷ lệ 40 : 60 (phần thể tích) 30 trước tắt máy Tính kết 8.1 Dựng đường chuẩn 8.1.1 Phải đảm bảo diện tích pic mẫu thử khơng vượt q diện tích pic mẫu chuẩn nồng độ lớn nhất, trường hợp vượt tiến hành thử nghiệm lại với độ pha loãng phù hợp 8.1.2 Xây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu dung dịch chuẩn với nồng độ Zn-bacitracin theo quan hệ tuyến tính bậc 1: y = ax + b Trong đó: y diện tích pic (hoặc chiều cao pic); x nồng độ tylosin; a hệ số góc; b số 8.2 Tính tốn 8.2.1 Hàm lượng Zn-bacitracin có mẫu thử, X, tính miligam kilogam (mg/kg), tính dựa vào đường chuẩn hồi quy tuyến tính (8.1.2) theo cơng thức sau: X (Y b) V a m Trong đó: Y hiệu số diện tích Zn-bacitracin dịch chiết mẫu thử diện tích pic tương ứng mẫu trắng; a, b thông số đường chuẩn y = ax + b (xem 8.1.2); V thể tích dịch chiết mẫu (7.1.2.2), tính mililit (ml); m khối lượng mẫu thử, tính gam (g) 8.2.2 Kết cuối giá trị trung bình hai lần phân tích lặp lại Giá trị trung bình làm tròn đến chữ số thập phân 8.2.3 Xác định độ thu hồi, R, tính phần trăm (%), theo công thức sau: R C1 100 C Trong đó: C1 hàm lượng Zn-bacitracin xác định theo quy trình phân tích, tính miligam kigogam (mg/kg); C hàm lượng Zn-bacitracin bổ sung vào mẫu, tính miligam kilogam (mg/kg) Độ thu hồi xác định cho lần chạy mẫu phải nằm khoảng từ 80% đến 110% Báo cáo thử nghiệm Báo cáo kết phải bao gồm thông tin đây: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu dùng, biết; - phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002), Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu [4] AOAC 982.44 Bacitracin in premix feeds Liquid chromatographic [5] Capitan-Vallvey 2002 High-performance liquid chromatography determination of Znbacitracin in animal feed by post-column derivatization and fluorescence detection J Chromatography A 943 227-234  ... tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết quả; - kết thử nghiệm thu THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN. .. dung dịch chuẩn, dịch mẫu thu hồi, dịch mẫu thử, dung dịch chuẩn Cần bơm dịch chuẩn trước sau đợt phân tích, khơng nên để 20 lần bơm mẫu cho đợt phân tích Nếu 20 lần phải bơm dung dịch chuẩn thêm... 10 mm x 2,1 mm, cỡ hạt m loại tương đương Lấy mẫu chuẩn bị mẫu 6.1 Lấy mẫu Phương pháp lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325:2007 (ISO 6497:2002) Thức ăn chăn nuôi