Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5273:2010

Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 5273:2010 về Bệnh động vật - Quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn thay thế TCVN 5273:1990. Tiêu chuẩn này quy định quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả lợn. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 5273:2010 BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH DỊCH TẢ LỢN Animal disease - Diagnostic procedure for classical swine fever disease Lời nói đầu TCVN 5273:2010 thay TCVN 5273:1990; TCVN 5273:2010 Cục Thú y biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục đo lường chất lượng thẩm định, Bộ khoa học Công nghệ công bố BỆNH ĐỘNG VẬT - QUY TRÌNH CHẨN ĐỐN BỆNH DỊCH TẢ LỢN Animal disease - Diagnostic procedure for classical swine fever disease CẢNH BÁO - Việc áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến vật liệu, thiết bị thao tác gây nguy hiểm Tiêu chuẩn đưa hết tất vấn đề an toàn liên quan đến việc sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn sức khỏe thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định quy trình chẩn đốn bệnh dịch tả lợn Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: Bệnh dịch tả lợn (diagnostic procedure for classical swine fever disease) Bệnh truyền nhiễm gây loại virus cấu trúc ARN thuộc giống Pestivirus, họ Flaviridae Virus dịch tả lợn có serotyp Bệnh xảy loài lợn mức độ khác tùy thuộc vào độc lực virus, tuổi động vật mẫn cảm thời gian nhiễm bệnh Lợn bị mắc bệnh lứa tuổi Thuốc thử vật liệu thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích sử dụng nước cất hai lần khử ion nước có độ tinh khiết tương đương khơng có Rnase, trừ có quy định khác - Axeton đậm đặc - Metanol - Natri clorua (NaCI) - Natri phosphat (Na2HPO4) - Natri hydroxit (NaOH) N - Dung dịch axit chlohydric (HCl) 1N - Dung dịch đệm phosphat glyxerin - Các loại thuốc kháng sinh: penixillin, streptomycxin, polymixin - Cồn 96%, 70% - Phcmơn (CH2O) - Kháng thể dịch tả lợn - Kit chiết tách ARN - Kit nhân gen - Nước tinh khiết khơng có Rnase - Mồi probe - Kháng sinh - Môi trường nuôi cấy tế bào: Hank's MEM, Eagle's MEM, Hank's BSS - Huyết thai bê - Tế bào thận lợn sơ cấp, tế bào dòng PK 15, SK - Chất gắn kết dịch tả lợn (Kháng thể huỳnh quang dịch tả lợn) - Chất gắn kết globulin thể kháng lợn - Virus cường độc dịch tả lợn gây bệnh lợn - Virus cường độc dịch tả lợn chủng hóa tế bào Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: - Tủ lạnh - Tủ ấm - Cân điện tử có mức cân nhỏ 1/10000 g - Tủ sấy - Nồi hấp - Buồng cấy - Máy ly tâm lạnh - Máy khuấy từ - Kính hiển vi đảo ngược (dùng soi tế bào) - Máy đọc ELISA - Máy Realtime RT-PCR - Hệ thống chiết tách - Bộ đồ mổ tiểu gia súc - Ống nghiệm vơ trùng, dung tích 10 ml - Giá đựng ống nghiệm - Ống effendorf chắt huyết - Ống effendorf, dung tích 0,2 ml - Pipet khắc độ ml, ml, 10 ml - Bơm tiêm loại ml kim tiêm 22G - Lọ đựng bệnh phẩm, dung tích 20 ml - Bộ cối chày sứ - Panh, kéo cắt tổ chức bệnh phẩm - Đèn cồn đèn ga - Hộp nhuộm tiêu - Hộp giữ ẩm cho lam kính - Bình nón, dung tích lít - Giấy nhơm bao gói - Bộ micropipet đầu hút - Khay chứa dung dịch làm ELISA - Bông cồn - Ống Leighton - Lọ nuôi tế bào loại T25, T75 - Đĩa nuôi tế bào loại giếng - Lam kính - Giấy dán nhãn Cách tiến hành 5.1 Chẩn đoán lâm sàng 5.1.1 Dịch tễ học Bệnh xảy lợn Bệnh dịch tả lợn có tính chất lưu hành mạnh, lây lan nhanh lợn mắc lứa tuổi, tỷ lệ ốm, chết cao mắc mạnh lợn con, khơng có vùng dịch rõ rệt mặt địa lý bệnh mắc quanh năm không theo mùa vụ Lợn thường nhiễm virus dịch tả lợn tự nhiên qua đường mũi, miệng Thời gian ủ bệnh từ đến 10 ngày, sau xuất triệu chứng sốt cao 41 °C, suy nhược thể, chán ăn, hay nghiến kêu rên khẽ, viêm kết mạc mắt có dử, giảm số lượng bạch cầu máu, lợn bị táo bón sau ỉa chảy phân thối khắm 5.1.2 Triệu chứng lâm sàng Thời gian ủ bệnh từ ngày đến ngày, bệnh xuất với thể sau: - Thể cấp tính Bệnh xảy nhanh Con vật khỏe mạnh tự nhiên giảm ăn bỏ ăn, ủ rũ, sốt cao từ 40 °C đến 42 °C Da mỏng phía đùi bụng có chỗ đỏ ứng lên tím lại Lợn giẫy dụa lúc chết, vật chết chưa có biểu đặc trưng bệnh ỉa chảy Bệnh tiến triển vòng từ ngày đến ngày tỷ lệ chết lên đến 100 % - Thể cấp tính Lợn ốm ủ rũ, buồn bã, biếng ăn bỏ ăn, chui ẩn rơm tìm nơi tối để nằm Hai ba ngày sau lợn bị sốt cao, thân nhiệt lên tới 41 °C đến 42 °C, sốt vòng ngày đến ngày liền, thời gian sốt vật bị táo bón sau thân nhiệt bị hạ xuống lúc lợn bị ỉa chảy, phân vật có mùi thối khắm vật bị kiệt sức Con vật thở mạnh thở hồng hộc, khát nước nhiều, bỏ ăn, phần da mỏng xuất nốt đỏ muỗi đốt Mắt có rử trắng mủ che lấp làm cho vật không trông thấy được, vật bị viêm kết mạc giác mạc mắt từ mắt có nước nhờn chảy Con vật có tượng nơn mửa Niêm mạc miệng, chân gốc lưỡi có mụn loét phủ bựa màu váng trắng Khi sờ bụng có cục sưng Lợn bị viêm niêm mạc mũi, vật chảy nước mũi, nước mũi lúc đầu lỗng sau đục đặc dần, vật bị ho khó thở nhịp thở bị rối loạn, rủ lưng cong, vật ngồi chó ngồi, thở khò khè ngáp Con vật có co giật thân thể bị sờ mó đến, bại liệt chân hai chân sau làm cho vật xiêu vẹo Lợn nái đẻ thường hay bị sẩy thai - Thể mãn tính Nếu thể cấp tính kéo dài vật chuyển sang thể mãn tính Con vật gầy còm lúc táo lúc ỉa chảy, ho khó thở, da lưng sườn có vết đỏ có loét mảng Bệnh tiến triển từ tháng đến tháng lợn chết kiệt sức khỏi gầy còm khó vỗ béo Những khỏi bệnh miễn dịch nguồn gieo rắc virus 5.1.3 Giải phẫu bệnh học - Thể cấp tính Bệnh tích không rõ, thấy niêm mạc viêm đỏ, thận xuất huyết, vùng vỏ hạch lâm ba sưng đỏ - Thể cấp tính Có nhiều điểm xuất huyết niêm mạc, niêm mạc miệng lở viêm xuất huyết, có có mụn loét nông hay sâu, phủ chất bựa màu vàng trắng Niêm mạc dày sưng màu đỏ gạch, niêm mạc ruột van hồi manh tràng có nốt loét, hạch lâm ba sưng tụ máu có màu đỏ sẫm Lách khơng sưng sưng có tượng nhồi huyết, xuất huyết viền lách Thận xuất huyết lớp vỏ Phổi viêm tụ máu có nhiều vùng bị gan hóa, hoại tử cứng lại Màng phổi có chỗ chấm đỏ xuất huyết - Thể mãn tính Ruột viêm có mụn lt tròn Có thấy thành ruột già dày cứng lên, niêm mạc trở nên sần sùi Phổi dính vào lồng ngực tổ chức liên kết chứa cục hoại tử có vỏ liên kết cứng 5.2 Chẩn đốn phòng thí nghiệm 5.2.1 Lấy mẫu - Bệnh phẩm: Hạch amidan, hạch lympho, lách, thận, van hồi manh tràng, máu (huyết thanh) Mẫu bệnh phẩm lấy sau mổ khám - Bảo quản mẫu bệnh phẩm nhiệt độ °C đến °C gửi đến phòng thí nghiệm 24h, thời gian đó, bệnh phẩm phải bảo quản nhiệt độ đông băng Huyết huyết tương bảo quản nhiệt độ từ °C đến °C tối đa ngày Lưu mẫu bệnh phẩm nhiệt độ -20 °C đến -80 °C 5.2.2 Phát kháng nguyên 5.2.2.1 Xử lý bệnh phẩm Cắt nhỏ 1g đến g hạch amidan, lách, thận, hạch lympho, nghiền cối chày sứ vô trùng với dung dịch BSS Hank's MEM thành (Phụ lục A) huyễn dịch 10 % Bổ sung vào huyễn dịch 10 % kháng sinh/Glutamin đậm đặc (1 ml kháng sinh 10 ml huyễn dịch), sau ly tâm 380g 15 min, thu dịch Dịch dùng để phát virus phương pháp ELISA phát kháng nguyên, Realtime RT-PCR (rRT-PCR) phân lập virus tế bào 5.2.2.2 Phương pháp ELISA phát kháng nguyên Có thể sử dụng mẫu bệnh phẩm huyễn dịch nghiền bệnh phẩm huyết thanh/huyết tương lợn ốm Khi sử dụng kit ELISA, thực theo hướng dẫn nhà sản xuất 5.2.2.3 Phương pháp Realtime RT-PCR phát kháng nguyên Mẫu bệnh phẩm giống mẫu bệnh phẩm để thực phản ứng ELISA Tiến hành chiết tách ARN virus dịch tả lợn: theo hướng dẫn nhà sản xuất kit tiến hành phản ứng realtime RT-PCR (Phụ lục B) 5.2.2.4 Phân lập virus 5.2.2.4.1 Chuẩn bị tế bào Tách tế bào (thận lợn sơ cấp, PK 15, SK 6, ) trypsin % 37 °C khoảng từ đến 10 Cho dung dịch Eagle’s MEM % FSC vào đánh đều, ly tâm 60 g 10 Bỏ dịch nổi, hòa tan tế bào với dung dịch Eagle’ MEM % FCS theo tỷ lệ 2x106 tế bào/ml bổ sung 0,2 ml dung dịch kháng sinh/Glutamin đậm đặc 10 ml dung dịch tế bào 5.2.2.4.2 Gây nhiễm tế bào Trộn huyễn dịch bệnh phẩm xử lý với huyễn dịch tế bào theo tỷ lệ 1/10, ni cấy ống Leighton có sẵn lamen chai nuôi tế bào hay đĩa nuôi tế bào giếng Giữ môi trường tế bào phân lập virus tủ ấm 37 °C vòng ngày Thu hoạch huyễn dịch tế bào sau 24 h 72 h, giám định virus 5.2.2.4.3 Giám định virus Giám định virus phản ứng ELISA phản ứng rRT-PCR 5.2.3 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp 5.2.3.1 Chuẩn bị mẫu Dùng máy cắt lạnh cắt tổ chức bệnh phẩm (amiđan, lách, hạch ) thành lát mỏng từ mm đến mm đặt lên phiến kính, phiến từ lát đến lát Dùng bút kim cương đánh dấu ký hiệu số bệnh phẩm, chủng loại tổ chức lên phía góc trái phiến kính Để tiêu khơ tự nhiên Nếu khơng có máy cắt lạnh dùng phương pháp in tổ chức: dùng dao sắc mỏng cắt dứt khoát nhát miếng tổ chức (amiđan, lách ) dùng panh nhọn gắp miếng tổ chức thấm giấy lọc hết máu, ấn nhẹ mặt cắt tổ chức lên phiến kính, dùng bút đánh dấu, để khơ tự nhiên 5.2.3.2 Chuẩn bị mẫu thử môi trường tế bào - Bệnh phẩm gan, nghiền chày cối, xử lý dung dịch kháng sinh, pha với môi trường tế bào thành dịch huyền phù 10-1 ly tâm 2000 r/min 15 lấy nước - Cấy mẫu bệnh phẩm lên tế bào thận lợn chuẩn bị sẵn ống nghiệm laighton có kính, mẫu bệnh phẩm cấy ống đến ống Sau cấy bệnh phẩm 24h đến 48 h, lấy kính ra, để khô tự nhiên chờ tiến hành bước sau CHÚ Ý: Khi cấy bệnh phẩm lên tế bào cần có ống đối chứng tế bào khỏe, ống đối chứng nhiễm virus dịch tả lợn Đánh dấu ống tế bào 2.2.3.3 Cố định tiêu Các tiêu chuẩn bị 5.2.3.1 sau đánh dấu đem cố định axeton Các lam kính chuẩn bị đặt vào cốc nhuộm, đổ axeton vào Các kính chuẩn bị 5.2.3.2 để ngun ống Leighton đổ bỏ mơi trường đi, cho axeton vào cố định, để -20 °C nhiệt độ phòng 30 Sau nhấc tiêu để khơ tự nhiên Axeton đổ vào bình tái sử dụng cho việc khác 5.2.3.4 Nhuộm mẫu thử Dùng chất gắn kết pha loãng nồng độ sử dụng nhỏ lên phiến kính kính gắn bệnh phẩm cho thuốc nhuộm phủ kín tổ chức Đặt phiến kính, kính vào khay ấm (giữ cho bề mặt ln ướt suốt q trình nhuộm) để vào tủ ấm 37 °C 30 Rửa bỏ chất gắn kết Sau lấy tủ ấm ra, đổ bỏ chất gắn kết đi, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) pH = 7,2 vào tiêu cho chất gắn kết, đặt tiêu vào cốc có rãnh, đổ ngập PBS vào ngâm rửa lần đến lần, lần thay PBS vào ngâm Sau lần cuối tráng lại Nước cất hai lần Đặt nghiêng tiêu giấy lọc thấm nhẹ cho khô Nhỏ giọt dung dịch đệm glyxerin lên phiến kính tiêu đậy kính lên nhỏ giọt dung dịch lên phiến kính đậy kính lên 5.2.3.5 Đọc kết Dùng kính hiển vi huỳnh quang đọc mẫu từ đối chứng trước, mẫu bệnh phẩm sau Lúc đầu sử dụng vật kính 10 để tìm vi trùng, sau dùng vật kính 40 CHÚ Ý: Kháng nguyên virus dịch tả lợn cấu trúc rõ ràng, huỳnh quang dương tính (+) đám phát quang màu xanh (nhuộm FITC) nguyên sinh chất Khi sử dụng phương pháp nhuộm huỳnh quang thiết phải có đối chứng 5.2.3.6 Các đối chứng phương pháp huỳnh quang trực tiếp - Đối chứng âm tính (-): tiêu tế bào thận lợn hạch, lách lợn khỏe mạnh nhuộm chất gắn kết Kết không phát quang - Đối chứng dương tính (+): tiêu dịch tả lợn dương tính nhuộm chất gắn kết Kết có phát quang sáng rõ đám nguyên sinh chất có virus dịch tả lợn - Đối chứng miễn dịch đặc hiệu: tiêu bệnh phẩm sau cố định axeton nhỏ giọt kháng huyết dịch tả lợn đặc hiệu, để 37 °C 30 Đổ bỏ huyết thanh, rửa PBS trước gắn chất gắn kết Kết tiêu không phát quang phát quang yếu Đọc trả lời kết theo Bảng Bảng - Cách đọc kết Các tiêu Kết huỳnh quang Kết luận Bệnh phẩm Có Có virus dịch tả lợn Bệnh phẩm Khơng Khơng có virus dịch tả lợn 5.2.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp 5.2.4.1 Chuẩn bị mẫu, xem 5.2.3.1 5.2.4.2 Cố định tiêu bản, xem 5.2.3.3 5.2.4.3 Gắn kháng huyết dịch tả lợn lên tiêu Nhỏ từ 0,1 ml đến 0,2 ml kháng thể dịch tả lợn lên tiêu đặt khay ấm để nhiệt độ 37 °C 30 (tiêu ln ln ướt suốt q trình ủ) Đổ bỏ huyết thanh, dùng bình có vòi bơm nhẹ dung dịch đệm (PBS) lên phiến kính tiêu cốc dung dịch đệm 10 min, thay PBS nhiều lần liên tục lắc nhẹ phiến kính Lấy để tiêu khô, nhỏ chất gắn kết globulin thỏ kháng lợn lên tiêu bản, đặt vào khay ẩm 37 °C 30 Sau thực bước 5.2.3.4 5.2.4.4 Đọc kết - Tiêu kháng nguyên dương tính gắn với chất gắn kết: Kết (+) - Tiêu tổ chức khỏe gắn chất gắn kết: kết (-) - Tiêu bệnh phẩm cần kiểm tra nhỏ globulin miễn dịch khơng gắn FITC sau nhỏ tiếp chất gắn kết: kết đọc huỳnh quang giảm nhiều - Đọc kết theo Bảng 5.2.5 Phương pháp tiêm truyền qua thỏ 5.2.5.1 Chuẩn bị mẫu Chọn thỏ mạnh khỏe từ 1,8 kg/con đến kg/con Chia thỏ làm lô: - Lô 1: tiêm dịch huyết phù bệnh phẩm nghi dịch tả lợn (máu lợn bệnh khử fibrin hạch lách lợn bệnh pha loãng 10-1 xử lý kháng sinh) ml vào tĩnh mạch tai thỏ Theo dõi nhiệt độ ngày lần ngày (thỏ phải không sốt) - Lô 2: sau ngày lấy thêm thỏ mạnh khỏe lô với thỏ lô tiêm thử thách vắc xin nhược độc dịch tả lợn chủng C pha loãng 10-1, ml vào tĩnh mạch tai 5.2.5.2 Đọc kết - Lô (đối chứng): thỏ sốt có nhiệt độ điển hình (đặc điểm chủng vắc xin nhược độc dịch tả lợn qua thử) - Lơ 1: có sốt, bệnh phẩm âm tính; khơng sốt, bệnh phẩm dương tính (+) 5.2.6 Phát kháng thể Phát kháng thể dịch tả lợn có ý nghĩa chẩn đốn lợn ốm có triệu chứng bệnh dịch lợn chưa tiêm phòng, nhiễm virus dịch tả lợn từ trước Phương pháp ELISA phát kháng thể: sử dụng kitELISA phát kháng thể, thực theo hướng dẫn nhà sản xuất Phương pháp trung hòa tế bào (NPLA - Neutralising Peroxidase - Linked Assay) Ngồi việc sử dụng với mục đích chẩn đốn bệnh, phương pháp phát kháng thể phương pháp trung hòa tế bào có ý nghĩa đánh giá hiệu giá kháng thể tiêm phòng vắc xin dịch tả lợn Phương pháp để xác định hàm lượng kháng thể có huyết nhờ ức chế kháng thể virus dịch tả lợn gây nhiễm tế bào Các bước tiến hành: xem Phụ lục C Kết luận Lợn xác định mắc bệnh dịch tả lợn có đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng lâm sàng bệnh dịch tả lợn kết dương tính với phương pháp xét nghiệm sau: - Phản ứng ELISA phát kháng nguyên dương tính - Phản ứng rRT-PCR phát virus dương tính - Phân lập virus môi trường tế bào, giám định virus dịch tả lợn dương tính - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp dương tính - Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp - Phản ứng tiêm truyền qua thỏ dương tính - Phản ứng ELISA phát kháng thể dương tính gia súc chưa tiêm phòng - Phản ứng trung hòa kháng thể tế bào dương tính (chỉ áp dụng lợn chưa tiêm phòng trường hợp chẩn đốn) PHỤ LỤC A (Quy định) Chuẩn bị dung dịch để chẩn đoán bệnh dịch tả lợn A.1 Dung dịch Glutamin/kháng sinh đậm đặc 100 lần (100x) - Dung dịch A: Glutamin 2,92 g Nước cất hai lần 50 ml Hòa tan thành phần lọc qua lưới lọc cỡ lỗ 0,45 m - Dung dịch B: Penicillin 1.000.000 U Steptomycin 1g Mycostatin 500.000 U Polymixin 150.000 U Kanamycin 1g Nước cất hai lần 10 ml Hòa tan thành phần cách lắc - Dung dịch C: Hòa tan 50 ml dung dịch A, 10 ml dung dịch B 40 ml nước cất hai lần bảo quản âm 20 °C A.2 Dung dịch muối đệm Hank's (BSS) môi trường Hank’s MEM Pha theo dẫn hãng sản xuất Hấp vô trùng Bảo quản °C A.3 Môi trường Eagle’s MEM Môi trường Eagle’s MEM 9,4 g Canh thang TPB (Tryptose Phosphat Broth) 2,95 g Nước cất hai lần 1000 ml Hòa tan thành phần Hấp vô trùng 121 °C 15 Bảo quản °C A.4 Pha dung dịch Trypsin % (10x) Trypsin 1:250 5g Nước cất hai lần 100 ml Khuấy que khuấy từ, để qua đêm °C Lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 m Bảo quản âm 20 °C A.5 Dung dịch muối đệm phosphat (PBS) pH 7,2 NaCl 8,5 g Na2HPO4 1,07 g NaH2PO4 0,39 g Nước cất hai lần 000 ml Hòa tan thành phần Chỉnh pH đến 7,2 NaOH N HCl N, hấp vô trùng 121 °C 30 A.6 Dung dịch đệm glyxerin pH = 8,3 Natri dihydrocacbonat (NaHCO3) 0,0715 g Dinatri cacbonat (Na2CO3) 0,00160g Nước cất vô trùng 10 ml Glyxerin vừa đủ 100 ml Hòa tan thành phần Bảo quản nhiệt độ °C, dùng đọc huỳnh quang A.7 Dung dịch kháng khuẩn Penixillin bột Streptomyxin Polymixin bột Nước cất vơ trùng Hòa tan thành phần Bảo quản nhiệt độ °C -20 °C PHỤ LỤC B (Quy định) Quy trình phản ứng rRT-PCR B.1 Cách tiến hành Pha master mix (hỗn hợp phản ứng) Qiagen RT-PCR kit Nguyên liệu Invitrogen SS3 qRT-PCR kit Lượng Nguyên liệu l Lượng l DW 10,5 DW 5,5 Hỗn hợp đệm phản ứng 5x 5,0 Dung dịch đệm phản ứng 2x 1,5 MgCI2 (25 mM) 1,2 PPP 1,5 dNTP 0,8 Hỗn hợp enzym 0,5 PPP 1,5 Hỗn hợp enzym 1,0 20,0 Cho 20 ul master mix cho ul mẫu ARN vào ống PCR (hoặc ống Smart); 20,0 Ly tâm nhanh; Đặt ống PCR (hoặc ống Smart) vào máy real-time PCR; Chọn chương trình chạy; Chọn màu đọc (tùy theo probe); Lựa chọn giếng cần chạy; Chạy phản ứng: Qiagen one-step RT-PCR Kit Invitrogen SS3 qRT-PCR Kit RT PCR RT PCR 50 °C-30 min, 95 °C-15 40 x (95 °C-10s + 60 °C-50s) 50 °C-15 min, 95 °C-2 40 x (95 °C-10 s + 0°C-50 s) B.2 Đọc kết - Mẫu coi dương tính có Ct 35 - Mẫu coi âm tính khơng có Ct - Mẫu coi nghi ngờ Ct > 35 Danh mục trình tự mồi probe dùng cho phương pháp RRT/PCR Mồi/ Probe Trình tự nucleotide (5'-3') Modification 5' 3' TGATGG GGGTAC GAC CTGATA GGG T HEX BHQ1 Mồi xuôi ATGCCCWTAGTAGGACTAGCA None None Mồi ngược TCAACTCCATGTGCCATGTAC None None Probe PHỤ LỤC C (Quy định) Phản ứng trung hòa kháng thể dịch tả lợn mơi trường tế bào C.1 Chuẩn bị Pha loãng huyết cần chẩn đốn với mơi trường MEM có chứa % huyết thai bê (khơng có kháng thể bệnh dịch tả lợn kháng thể trung hòa với virus dịch tả lợn) Cho lượng không đổi virus dịch tả lợn (100 TCID50) vào tất giếng (trừ giếng đối chứng) Cho tế bào PK15 CPK SK6 vào tất giếng Ủ đĩa ngày đến ngày 37 °C Kháng nguyên virus phát phương pháp nhuộm miễn dịch Chuẩn bị nguyên liệu: - Kháng thể 1: Pig polyclonal antibody pha loãng 1/200 dung dịch PBS pH = 7,2 - Kháng thể 2: Anti-pig IgG peroxidase conjugate (DAKO P0164) pha loãng 1/600 dung dịch PBS pH = 7,2 (nếu sử dụng chất gắn kết khác cần chuẩn độ lại) C.2 Tiến hành phản ứng C.2.1 Chuẩn bị virus cho phản ứng NPLA Chuẩn bị tế bào PK15 CPK SK6 vào chai nuôi cấy với lượng x 104 tế bào/ml 15 ml môi trường (EMEM % FCS) Ủ đĩa 37 °C/CO2 24 h Nhiễm virus (100TCID50) vào chai Ủ đĩa 37 °C ngày đến ngày Lưu giữ tủ -80 °C Làm rã đông thu lấy môi trường vào ống 15 ml Ly tâm 3000 g vòng 20 °C Thu lấy mơi trường bên vào ống 50 ml Chia vào ống nhỏ (200 ml/týp) Lưu giữ -80 °C Chuẩn độ virus đĩa 96 giếng Chuẩn độ kháng thể dịch tả lợn phản ứng NPLA Dùng đĩa 96 giếng Nhỏ 100 l môi trường vào hàng đĩa Nhỏ 50 l môi trường vào giếng CHÚ Ý: Bớt lại hàng để chuẩn độ ngược virus làm đối chứng tế bào Pha loãng huyết thanh: Cho 10 l huyết vào hàng Trộn chuyển 50 l sang hàng bên cạnh Nhỏ dung dịch virus 50 l/giếng vào tất giếng (trừ hàng cuối cùng) Nhỏ 100 l đối chứng virus pha loãng 1,1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000 Lắc đĩa Ủ đĩa 37 °C có đến % CO2 24 h Nhỏ 100 l tế bào PK15 CPK SK6 vào tất giếng Ủ đĩa 37 °C có % đến % CO2 ngày đến ngày Nhuộm NPLA Cố định tế bào: Đổ bỏ môi trường đĩa rửa dung dịch PBS % tween 80 từ lần đến lần (200 l/ giếng) Dùng dung dịch cố định PBS % tween 20, 10 % formaline, % NP 40, cho vào giếng 100 l Ủ nhiệt độ phòng 30 Rửa đĩa lần PBS % tween 80 Cho 50 l kháng thể vào giếng, để tủ ấm 37 °C 30 Rửa đĩa lần PBS % tween 80 Cho 50 l kháng thể vào giếng, để tủ ấm 37 °C 30 Cho 50 l chất ACE vào giếng, để tủ ấm 37 °C từ 10 đến 20 CHÚ THÍCH: Cơ chất phải sử dụng sau pha C.3 Đọc kết - Quan sát đĩa kính hiển vi soi ngược - Nguyên sinh chất tế bào bắt phần đỏ đậm (màu ACE), kết luận khơng có kháng thể - Ngun sinh chất tế bào không bắt màu (màu hồng), kết luận có kháng thể THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 5273:1990 Bệnh dịch tả lợn [2] 10 TCN 716-2006 Qui trình chẩn đốn bệnh Dịch tả lợn Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn Cục Thú y 2006 [3] O.I.E., 2009 Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, Classical swine fever, chapter 2.8.3 [4] Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn bệnh gia súc Việt Nam, in lần thứ nhất, Bệnh dịch tả lợn, trang 104-105 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn - Viện Thú y, 2002  ... Đánh dấu ống tế bào 2.2.3.3 Cố định tiêu Các tiêu chuẩn bị 5.2.3.1 sau đánh dấu đem cố định axeton Các lam kính chuẩn bị đặt vào cốc nhuộm, đổ axeton vào Các kính chuẩn bị 5.2.3.2 để ngun ống Leighton... 5.2.3.1 5.2.4.2 Cố định tiêu bản, xem 5.2.3.3 5.2.4.3 Gắn kháng huyết dịch tả lợn lên tiêu Nhỏ từ 0,1 ml đến 0,2 ml kháng thể dịch tả lợn lên tiêu đặt khay ấm để nhiệt độ 37 °C 30 (tiêu luôn ướt suốt... (PBS) pH = 7,2 vào tiêu cho chất gắn kết, đặt tiêu vào cốc có rãnh, đổ ngập PBS vào ngâm rửa lần đến lần, lần thay PBS vào ngâm Sau lần cuối tráng lại Nước cất hai lần Đặt nghiêng tiêu giấy lọc thấm