Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8674:2011 trình bày nội dung về thức ăn chăn nuôi - xác định hàm lượng vitamin A - phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Mời các bạn cùng tham khảo.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 8674:2011 THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of vitamin A content - Method using high - performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 8674:2011 hồn tồn tương đương với ISO 14565:2000; TCVN 8674:2011 Cục Chăn nuôi biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố THỨC ĂN CHĂN NUÔI - XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN A - PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Animal feeding stuffs - Determination of vitamin A content - Method using high - performance liquid chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng vitamin A (retinol) tổng số thức ăn chăn nuôi thức ăn cho thú cảnh sắc ký lỏng hiệu cao Hàm lượng vitamin A hàm lượng all-trans-retinyl ancol đồng phân cis xác định phương pháp mô tả tiêu chuẩn biểu thị theo đơn vị quốc tế kilogam (IU/kg) Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nước dùng để phân tích phòng thí nghiệm - u cầu kỹ thuật phương pháp thử TCVN 6952 (ISO 6498), Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Hàm lượng vitamin A (vitamin A content) Hàm lượng all-trans-retinyl ancol đồng phân cis xác định theo tiêu chuẩn CHÚ THÍCH: Hàm lượng vitamin A biểu thị đơn vị quốc tế kilogam (IU/kg); IU vitamin A 0,300 g all-trans-retinol Nguyên tắc Mẫu xà phòng hóa với dung dịch kali hydroxit etanol vitamin A tách chiết dầu nhẹ Loại bỏ dầu nhẹ cách cho bay phần cặn hòa tan 2propanol Nồng độ vitamin A dịch chiết 2-propanol xác định sắc ký lỏng pha đảo điều kiện cho pic đơn lẻ tất đồng phân retinol Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích 5.1 Nước, phù hợp với loại TCVN 4851 (ISO 3696) 5.2 Dung dịch kali hydroxit (KOH) Hòa tan 500 g kali hydroxit nước (5.1) pha lỗng nước đến lít 5.3 Etanol, w(C2H5OH) = 95% (theo thể tích), dùng cồn metyl hóa cơng nghiệp tương đương 5.4 2-propanol (C3H7OH) 5.5 Dầu nhẹ, có điểm sơi khoảng từ 40 0C đến 60 0C Lượng cặn lại sau bay phải nhỏ 20 mg/l 5.6 Chất chuẩn vitamin A 5.6.1 All-trans-retinyl axetat, vitamin A axetat (C22H32O2) 328,5 g/mol, có độ tinh khiết 90% 5.6.2 All-trans-retinol, ancol vitamin A (C20H30O), 286,5 g/mol, có độ tinh khiết 90% 5.7 Metanol, dùng cho HPLC 5.8 Pha động dùng cho sắc ký lỏng Trộn metanol (5.7) với nước (5.1) theo tỷ lệ 770:30 (theo thể tích) Lọc qua lọc màng (6.6), cần 5.9 Natri sulfat (Na2SO4), dạng khan 5.10 Dung dịch natri ascorbat, = 100 g/l 5.11 Khí trơ, ví dụ: nitơ Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 6.1 Thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao, gồm phận sau: 6.1.1 Bơm, cài đặt tốc độ dòng ổn định ml/min 6.1.2 Bộ phận bơm HPLC 6.1.3 Cột, dài 250 mm, đường kính 4,6mm, nhồi pha tĩnh gồm nhóm octadecyl (C18) liên kết với silica Cột có 000 đĩa lý thuyết giá trị k' = 0,6, hai cho thấy thỏa mãn all-transretinol Cỡ hạt không nhỏ m khơng lớn 10 m Có thể sử dụng hệ thống khác với điều kiện tách hết vitamin A khỏi chất chiết khác 6.1.4 Detector, cho phép đo xạ cực tím 325 nm trang bị máy tích phân/hệ thống xử lý liệu 6.2 Máy đo phổ UV (hoặc UV-nhìn thấy), có khả đo độ hấp thụ bước sóng xác định 9.6, trang bị cuvet thạch anh có chiều dài đường quang 10 mm 6.3 Nồi cách thủy đun sôi 6.4 Bộ cô quay chân khơng, có nồi cách thủy 40 0C 6.5 Bộ chiết (Xem Hình 1) bao gồm phận sau đây: - ống chiết hình trụ dung tích lít có cổ thủy tinh mài có nút đậy; - khớp nối thủy tinh mài, gắn với ống chiết trang bị ống điều chỉnh qua tâm; - ống nối bên cạnh Ống điều chỉnh cần phải có đầu hình chữ U vòi phun phía cho lớp chất lỏng phía ống chiết chuyển sang phễu chiết dung tích lít Có thể sử dụng dụng cụ chiết khác bình nón phễu chiết thay cho thiết bị nêu Hình với điều kiện đạt độ thu hồi vitamin A 6.6 Bộ lọc màng, cỡ lỗ 0,45 m, để lọc pha động (5.8) dung dịch mẫu thử CHÚ DẪN Ống chiết hình trụ, dung tích lít có cổ thủy tinh mài Lớp dầu nhẹ Lớp dung dịch nước + nguyên liệu xà phòng hóa Vòi phun Chai, dung tích lít có khớp nối thủy tinh mài Ống nối bên cạnh Ống điều chỉnh Hình - Ví dụ thiết bị Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu Bảo quản mẫu cho không làm thay đổi thành phần giảm chất lượng mẫu Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN 6952 (ISO 6498) Thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử Ngay trước bắt đầu phân tích, nghiền phần mẫu phòng thử nghiệm cho lọt qua rây cỡ lỗ mm Trộn kỹ Đồng hóa thức ăn thú cảnh đóng hộp Nghiền nhỏ thức ăn cho thú cảnh bán ẩm để lọt qua đĩa đục lỗ với cỡ lỗ mm Cách tiến hành 9.1 Yêu cầu chung Vì vitamin A nhạy với xạ tia cực tím khơng khí, nên cần thực tất thao tác nhanh tránh ánh sáng huỳnh quang tự nhiên mạnh Sử dụng dụng cụ thủy tinh màu nâu Hồn thành phép thử ngày làm việc Thực việc xà phòng hóa chiết alltrans-retinyl axetat chuẩn mẫu thức ăn chăn nuôi lúc 9.2 Xà phòng hóa Cân khoảng 50 g mẫu thử nghiệm chuẩn bị (xem Điều 8), xác đến 0,1 g, cho vào bình nón lít Thêm 200 ml etanol (5.3) Xoay bình để làm phân tán mẫu Thêm ml natri ascorbat (5.10) 50 ml dung dịch kali hydroxit (5.2) xoay bình để trộn Lắp bình ngưng hồi lưu vào bình cầu nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sôi (6.3) Để lượng chứa bình cầu hồi lưu 60 min, xoay bình Tháo bình cầu để nguội đến nhiệt độ phòng nhanh tốt dòng nước lạnh 9.3 Chiết xuất vitamin A (retinol) Chuyển lượng chứa bình cầu sang ống chiết hình trụ (xem 6.5) Rửa bình cầu hai lần, lần dùng 25 ml etanol cồn metyl công nghiệp (5.3) chuyển nước tráng sang ống chiết hình trụ Lặp lại việc rửa bình cầu hai lần, lần dùng 125 ml dầu nhẹ (5.5) phần 250 ml nước (5.1), lần tráng chuyển nước rửa sang ống chiết hình trụ Đậy nắp ống chiết hình trụ lắc min, ý giải phóng áp suất Làm nguội ống chiết hình trụ dòng nước lạnh đợi tách hai pha lỏng, trước tháo bỏ nắp Khi tách lớp, tháo bỏ nắp, rửa mặt nắp vài mililit dầu nhẹ (5.5) chèn ống điều chỉnh (xem 6.5), chỉnh vị trí đầu cho mức phân lớp Bằng cách áp dụng áp lực nhẹ khí trơ (5.11) vào ống bên cạnh, chuyển lớp dầu nhẹ phía sang phễu chiết lít (xem 6.5) Thêm 125 ml dầu nhẹ (5.5) vào ống chiết hình trụ, đậy nắp lắc Để tách lớp lại chuyển lớp sang phễu chiết cách sử dụng ống điều chỉnh (xem 6.5) Thêm tiếp 125ml dầu nhẹ (5.5) vào ống chiết hình trụ, đậy nắp lắc Lại tách lớp chuyển lớp sang phễu chiết cách sử dụng ống điều chỉnh Rửa dịch chiết dầu nhẹ với bốn phần, phần 100 ml nước, lúc đầu nhẹ nhàng đảo ngược sau lắc nhẹ để giữ cho việc hình thành nhũ tương mức tối thiểu Chuyển dịch chiết rửa qua giấy lọc trung bình/nhanh có chứa 60 g natri sulfat khan (5.9), vào bình cầu thích hợp để bay chân khơng Rửa phễu chiết hai lần, lần dùng 20 ml dầu nhẹ (5.5) cho nước rửa qua lọc vào bình cầu làm bay Rửa lọc tiếp hai lần, lần dùng 25 ml dầu nhẹ (5.5) cho nước rửa vào bình làm bay Làm bay dịch chiết dầu nhẹ đến khô chân không nhiệt độ không 40 0C Khôi phục lại áp suất khí cách nạp khí trơ (5.11) 9.4 Sắc ký lỏng hiệu cao 9.4.1 Hòa tan cặn lượng tối thiểu 2-propanol (5.4) chuyển định lượng sang bình định mức 20 ml Rửa bình cầu làm bay có ba phần nhỏ 2-propanol (5.4), chuyển nước rửa vào bình định mức Pha loãng đến vạch 2-propanol (5.4) trộn Đối với vật liệu có chứa 100 000 IU/kg, cần phải pha lỗng tiếp CHÚ THÍCH: IU = Đơn vị quốc tế; IU vitamin A = 0,300 m all-trans-retinol Nếu cần, lọc dịch chiết mẫu qua lọc màng (6.6) 9.4.2 Nếu tránh khỏi việc trì hỗn, bảo quản dịch chiết khí trơ (5.11) tủ lạnh nhiệt độ 0C sau đưa trở lại nhiệt độ phòng nơi tối 9.4.3 Bơm 10 l dịch chiết mẫu vào cột sắc ký lỏng (6.1) đo diện tích pic retinol 9.4.4 Tính diện tích pic trung bình thu từ lần bơm lặp lại dịch chiết mẫu xác định nồng độ retinol dịch chiết cách so sánh với diện tích pic trung bình tìm lần bơm lặp lại chuẩn retinol có nồng độ tương tự Thời gian lưu retinol khoảng Thực lần bơm thay dịch chiết mẫu dung dịch chuẩn 9.5 Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn Chuẩn bị dung dịch all-trans-retinyl axetat (5.6) etanol (5.3) cho ml chứa khoảng 15 000 IU vitamin A CHÚ THÍCH: IU vitamin A = 0,344 m all-trans-retinyl axetat Dùng buret ml với vạch chia 0,02 ml, chuyển 2,5 ml ± 0,02 ml dung dịch sang bình cầu 150 ml Thêm 20 ml etanol (5.3), ml dung dịch kali hydroxit (5.2) ml dung dịch natri ascorbat (5.10) Lắp bình ngưng vào bình cầu Nhúng bình cầu vào nồi cách thủy đun sơi để hồi lưu 60 Làm nguội bình cầu đến nhiệt độ phòng dòng nước lạnh chuyển lượng chứa bình sang phễu chiết (xem 6.5) Tráng bình cầu 50 ml nước (5.1), 25 ml etanol (5.3), cho nước tráng sang phễu chiết Chiết pha nước phần 80 ml dầu nhẹ (5.5) sau chiết tiếp hai lần lần 50 ml dầu nhẹ (5.5) Gộp tất dịch chiết dầu nhẹ, sau rửa hai lần lần 50 ml nước Thêm g natri sulfat khan (5.9) Chuyển dịch chiết dầu nhẹ sang bình định mức 250 ml pha loãng đến vạch Nồng độ retinol dung dịch (dung dịch 1) khoảng 150 IU/ml 9.6 Chuẩn hóa dung dịch retinol để hiệu chuẩn Dùng pipet lấy ml ± 0,03 ml dung dịch (9.5) cho vào bình định mức 50 ml loại bỏ dung môi nhiệt độ môi trường dòng khí trơ (5.11) Hòa tan cặn 2-propanol (5.4) sau thêm 2-propanol đến vạch Đo độ hấp thụ (A) dung dịch, sử dụng 2-propanol làm đối chứng, bước sóng 310 nm, 325 nm 334 nm Các giá trị độ hấp thụ phải xấp xỉ từ 0,7 đến 0,8 Có thể sử dụng dung dịch trung gian, cần Sử dụng công thức sau đây, tính hấp thụ hiệu chỉnh bước sóng 325 nm: A325, corr = 6,815 x A325 - 2,555 x A310 - 4,26 x A334 Nếu A325,corr/A325 nhỏ 0,97, sử dụng giá trị A325,corr để chuẩn hóa, khơng sử dụng A325 Nồng độ retinol dung dịch đưa bằng: nồng độ (IU/ml) = A325 x 183 IU/ml, nồng độ (IU/ml) = A325,corr x 183 IU/ml 9.7 Chuẩn bị chuẩn retinol cho sắc ký Chuẩn bị dung dịch retinol 2-propanol (5.4) có nồng độ xấp xỉ nồng độ dự kiến dịch chiết mẫu (9.4.1) Đối với 000 IU vitamin A kilogam mẫu, nồng độ retinol dự kiến có dịch chiết 2,5 IU/ml Cho bay thể tích dung dịch (9.5) đến khơ nhiệt độ mơi trường dòng khí trơ (5.11) Hòa tan cặn lượng thích hợp 2-propanol để có nồng độ retinol theo yêu cầu trộn Lọc dung dịch chuẩn qua lọc màng (6.6), cần Cách khác để hiệu chuẩn, sử dụng dung dịch chuẩn vitamin A (retinol) 2propanol (5.4) chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc all-trans-retinol cách hòa tan lượng thích hợp chất chuẩn all-trans-retinol (5.6.2) trực tiếp 2propanol (5.4) Trong trường hợp này, kiểm tra chuẩn vitamin A cách đo hấp thụ dung dịch chuẩn cuvet thạch anh (6.2) bước 300 nm, 325 nm, 350 nm 370 nm với 2-propanol làm đối chứng Xác định tỷ lệ A/A325 bước sóng all-trans-retinol Nếu tỷ lệ không vượt 0,602, 0,432 0,093 bước sóng 300 nm, 350 nm 370 nm tương ứng, chất chuẩn phù hợp cho sử dụng (xem tài liệu tham khảo [5], [6]) CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng hiệu chuẩn nhiều điểm để tạo thuận lợi cho phép phân tích trường hợp, ví dụ, nồng độ vitamin A dự kiến mẫu chiết chưa biết 10 Biểu thị kết Tính hàm lượng vitamin A mẫu thử, công thức sau: WA = 20 000 x c m Trong đó: wA hàm lượng vitamin A mẫu thử, tính đơn vị quốc tế kilogam (IU/kg); c nồng độ retinol dịch chiết, tính đơn vị quốc tế mililit (IU/ml); m khối lượng mẫu thử, tính gam (g) 11 Độ chụm 11.1 Thử nghiệm liên phòng Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp nêu Phụ lục A Các giá trị thu từ phép thử liên phòng thử nghiệm khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Bảng - Giới hạn lặp lại (r) giới hạn tái lập (R) Mẫu Hàm lượng vitamin A r R IU/kg IU/kg IU/kg Thức ăn cho gia cầm dạng viên 888 860 068 Khẩu phần ăn cho gia súc lớn 10 812 099 549 Thức ăn cho cá 15 879 800 672 Thức ăn cho thú cảnh bán ẩm 33 250 536 446 Khẩu phần ăn đậm đặc cho lợn 40 661 049 941 11.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử độc lập, đơn lẻ thu sử dụng phương pháp vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm, người thực hiện, sử dụng thiết bị, thực khoảng thời gian ngắn, không % trường hợp lớn giới hạn gặp lại r nêu Bảng 11.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối kết hai phép thử đơn lẻ, thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu giống phòng thử nghiệm khác nhau, người khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác thực hiện, không 5% trường hợp lớn giới hạn tái lập R nêu Bảng 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - chi tiết thao tác quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; - thể kết thử nghiệm thu được, hai kết thử nghiệm thu độ lặp lại kiểm tra PHỤ LỤC A (Tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm Độ chụm phương pháp thiết lập phép thử nghiệm liên phòng thực ISO 5725 [1] 1) Kết phép thử nghiệm công bố (xem Thư mục tài liệu tham khảo [7]) Trong phép thử có từ 12 phòng đến 14 phòng thử nghiệm tham gia mẫu nghiên cứu thức ăn thú cảnh bán ẩm, thức ăn cho gia cầm dạng viên, phần ăn cho gia súc lớn, phần ăn đậm đặc cho lợn thức ăn cho cá Bảng A.1 - Thống kê kết thử nghiệm liên phòng ISO 5725 (đã hủy bỏ) sử dụng để thu liệu độ chụm Mẫua Thông số Số lượng phòng thử nghiệm 14 12 13 12 13 Số lượng kết riêng lẻ 56 24 26 24 26 Số lượng kết chấp nhận 56 24 26 24 26 Hàm lượng vitamin A trung bình, IU/kg 33 250 888 10 812 40 661 15 879 Độ lệch chuẩn lặp lại (sr), IU/kg 668 304 742 1431 989 Hệ số biến thiên lặp lại, % 2,0 3,1 6,9 3,5 6,2 536 860 099 049 800 Độ lệch chuẩn tái lập (sR), IU/kg 864 731 254 806 651 Hệ số biến thiên tái lập, % 2,6 7,4 11,6 6,9 10,4 446 068 549 941 672 Giới hạn độ lặp lại (r) [r = 2,8 x sr), IU/kg Giới hạn tái lập (R) [R = 2,8 x sR), IU/kg a 1: thức ăn thú cảnh bán ẩm; 2: thức ăn cho gia cầm dạng viên; 3: phần ăn cho gia súc lớn; 4: phần ăn đậm đặc cho lợn; 5: thức ăn cho cá Thư mục tài liệu tham khảo [1] ISO 5725:1986, Precision of test methods - Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests [2] TCVN 6910-1:2001 (ISO 5725-1:1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2:2001 (ISO 5725-2:1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo - Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [4] TCVN 4325 (ISO 6497), Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu [5] Takashima, Y et al Stability of retinol analogs Chem Pharm Bull., 27, 1979, pp 1553 [6] Bolliger, M.R et al The monograph of vitamin A in the European Pharmacopoeia Pharm Acta Helv., 52 (8), 1977, pp 161-174 [7] Analytical Methods Committee, Analyst, 110, 1985, pp 1019-1026 ... định tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo TCVN 4325 (ISO 6497) Thức ăn chăn nuôi - Lấy mẫu Bảo quản mẫu cho không làm thay đổi thành phần giảm chất lượng mẫu Chuẩn bị mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử theo TCVN. .. lần bơm lặp lại chuẩn retinol có nồng độ tương tự Thời gian lưu retinol khoảng Thực lần bơm thay dịch chiết mẫu dung dịch chuẩn 9.5 Thủy phân all-trans-retinyl axetat để hiệu chuẩn Chuẩn bị dung... cầu trộn Lọc dung dịch chuẩn qua lọc màng (6.6), cần Cách khác để hiệu chuẩn, sử dụng dung dịch chuẩn vitamin A (retinol) 2propanol (5.4) chuẩn bị cách pha loãng dung dịch chuẩn gốc all-trans-retinol