Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 8741:2011 trình bày về vi sinh vật nông nghiệp – phương pháp bảo quản ngắn hạn. Tiêu chuẩn này áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn giống vi sinh vật nông nghiệp có hoạt tính cố định nitơ, phân giải phốt phát khó tan, phân giải xenluloza, ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn bằng phương pháp bảo quản trên môi trường thạch nghiêng và bảo quản dưới lớp parafin lỏng.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8741:2011 VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP – PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NGẮN HẠN Agricultural microorganism – Method for short term preservation Lời nói đầu TCVN 8741:2011 chuyển đổi từ 10 TCN 348:99 theo quy định khoản Điều 69 Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật điểm a khoản Điều Nghị định số 127/2007/NĐ-CP ngày 1/8/2007 Chính phủ qui định chi tiết thi hành số điều Luật Tiêu chuẩn Quy chuẩn kỹ thuật TCVN 8741:2011 Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8741:2011 VI SINH VẬT NÔNG NGHIỆP – PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN NGẮN HẠN Agricultural microorganism – Method for short term preservation Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn giống vi sinh vật nông nghiệp có hoạt tính cố định nitơ, phân giải phốt phát khó tan, phân giải xenluloza, ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ trồng cạn phương pháp bảo quản môi trường thạch nghiêng bảo quản lớp parafin lỏng Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6167:1996, Phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phốt phát khó tan TCVN 6168:2002, Chế phẩm vi sinh vật phân giải xenlulo TCVN 8564:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính cố định nitơ vi khuẩn nốt sần họ đậu TCVN 8565:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính phân giải phốt phát vi sinh vật TCVN 8566:2010, Phân bón vi sinh vật - Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ trồng cạn Thuật ngữ, định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Bảo quản vi sinh vật nông nghiệp (preservation of agricultural microorganism) Bảo quản giống vi sinh vật nông nghiệp thuần, điều kiện phù hợp, bảo đảm không bị tạp nhiễm, tỷ lệ sống không nhỏ 50% bảo tồn hoạt tính sinh học ban đầu 3.2 Hoạt tính sinh học vi sinh vật (bioactivity of agricultural microorganism) Khả vi sinh vật thông qua hoạt động sống chúng có tác động đến q trình sinh trưởng, phát triển trồng, kiểm soát sinh học sinh thái môi trường 3.3 Vi sinh vật tạp (contaminated microorganism) Quần thể vi sinh vật không đồng hình thái tế bào khuẩn lạc so với giống vi sinh vật ban đầu 3.4 Tỷ lệ sống vi sinh vật (survival rate of microorganism) Tỷ lệ phần trăm lượng tế bào/bào tử thời điểm kiểm tra mẫu bảo quản thời điểm bắt đầu bảo quản Môi trường nuôi cấy thuốc thử 4.1 Mơi trường Có thể sử dụng mơi trường có bán sẵn thị trường môi trường đây: 4.1.1 Môi trường để nuôi cấy vi khuẩn - Môi trường YMA (Yeast Mannitol Agar) Xem Điều A.1 Phụ lục A - Môi trường Ashby Xem Điều A.2 Phụ lục A - Môi trường DAC Xem Điều A.3 Phụ lục A - Môi trường Pikovskya Xem Điều A.4 Phụ lục A - Môi trường SPA (Sucrose Peptone Agar) Xem Điều A.5 Phụ lục Auẩn lạc (CFU) ml) 6.2.3.2 Xác định hoạt tính sinh học vi sinh vật Xác định hoạt tính cố định nitơ vi sinh vật theo TCVN 8564:2010 Xác định hoạt tính phân giải phốt phát vi sinh vật theo TCVN 8565:2010 hay TCVN 6167:1996 Trong xác định hoạt tính phân giải phốt phát theo TCVN 8565:2010 phương pháp trọng tài Xác định hoạt tính phân giải xenlulo vi sinh vật theo TCVN 6168:2002 Xác định hoạt tính ức chế nấm gây bệnh trồng cạn vi sinh vật theo TCVN 8566:2010 Xác định hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh trồng cạn vi sinh vật (xem phụ lục B) 6.3 Bảo quản lớp dầu khống 6.3.1 Ni cấy Cấy vòng que cấy giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường ni cấy thích hợp chuẩn bị sẵn (6.1.2.1), tiến hành tủ cấy vô trùng (5.1) - Nuôi cấy điều kiện thích hợp (từ 28 OC đến 30 OC khơng ngày vi khuẩn, từ 28 OC đến 30 O C khơng ngày nấm sợi từ 35 OC đến 37 OC khơng ngày xạ khuẩn) để vi sinh vật phát triển đồng vết cấy - Đổ parafin lỏng chuẩn bị sẵn (6.1.3) lên bề mặt thạch nghiêng cấy giống vi sinh vật cho dựng đứng ống thạch lên bề mặt lớp parafin lỏng cách mép lớp thạch khoảng cm, tiến hành tủ cấy vô trùng (5.1) 6.3.2 Bảo quản Bảo quản điều kiện nhiệt độ từ OC đến 10 OC Định kỳ sau tháng - tháng bảo quản, kiểm tra tỷ lệ sống, độ tạp vi sinh vật Nếu tỷ lệ sống vi sinh vật khơng lớn 50 % phải tiến hành cấy truyền lại Nếu mẫu vi sinh vật bị tạp nhiễm loại bỏ 6.3.3 Kiểm tra mẫu 6.3.3.1 Tỷ lệ sống vi sinh vật (xem 6.2.3.1) CHÚ THÍCH 3: Cần loại bỏ toàn lớp parafin lỏng trước lấy sinh khối vi sinh Dùng micropipet hút hết lớp parafin lỏng ống bảo quản, sau dùng giấy lọc thấm khơ hết parafin lỏng dính bề mặt ống bảo quản 6.3.3.2 Hoạt tính sinh học vi sinh vật (xem 6.2.3.2) PHỤ LỤC A (Tham khảo) THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG NI CẤY VÀ THUỐC THỬ A.1 Mơi trường YMA (Yeast Mannitol Agar) K2HPO4 0,5 g MgSO 7H2O 0,2 g NaCl 0,1 g Mannitol 10,0 g Cao nấm men 0,5 g CaCO 0,5 g Dung dịch công gô đỏ 1% 2,5 ml Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 6,8 đến 7,0 A.2 Môi trường Ashby Mannitol (Glucoza) 20,0g K2HPO4 0,2 g MgSO 7H2O 0,2 g NaCl 0,2 g K2SO 0,1 g CaCO 5,0 g Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 6,8 đến 7,0 A.3 Môi trường DAC Axit malic 5,0 g KH2PO4 0,5 g FeSO 7H2O 0,05 g MnSO H2O 0,01 g MgSO 7H2O 0,1 g NaCl 0,02 g CaCl 0,01 g Na 2MoO 0,002 g Dung dịch Bromotymol xanh (5%) 2,0 ml Hoặc dung dịch công gô đỏ 1% 2,5 ml Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 6,8 đến 7,0 CHÚ THÍCH A.3: pH mơi trường điều chỉnh KOH A.4 Môi trường Pikovskaya Glucoza 10,0 g Ca (PO )2 5,0 g (NH )2SO 0,5 g KCl 0,2 g MgSO 7H2O 0,1 g MnSO vết FeSO vết Cao nấm men Thạch Nước cất vừa đủ pH 0,5 g 20,0 g 1000 ml 6,8 đến 7,0 A.5 Môi trường SPA (Sucrose Peptone Agar) Sacaroza 20,0 g Pepton 5,0 g K2HPO4 0,5 g MgSO 7H2O 0,25 g Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 6,8 đến 7,0 A.6 Môi trường Czapek NaNO Sacaroza 3,0 g 30,0 g KH2PO4 1,0 g MgSO 7H2O 0,5 g Thạch Nước cất vừa đủ pH 20,0 g 1000 ml 6,0 đến 6,5 CHÚ THÍCH A.6: pH mơi trường điều chỉnh HCl NaOH A.7 Môi trường Czapek-Dox NaNO 2,0 g KCl 1,0 g KH2PO4 1,0 g MgSO 7H2O 0,5 g FeSO 0,01 g Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 6,0 đến 6,5 CHÚ THÍCH A.7: pH mơi trường điều chỉnh HCl NaOH A.8 Môi trường PDA (Potato Dextrose Agar) Dextroza 20,0 g Khoai tây 20,0 g Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 6,7 đến 6,8 CHÚ THÍCH A.8: - khoai tây thái nhỏ, cho vào l nước đun sôi 20 min, - sau lọc lấy nước để sử dụng làm môi trường A.9 Môi trường Gauze Tinh bột tan 20,0 g KNO 1,0 g KH2PO4 0,5 g MgSO 7H2O 0,5 g NaCl 0,5 g FeSO 0,01 g Thạch 20,0 g Nước cất vừa đủ pH 1000 ml 7,0 đến 7,2 CHÚ THÍCH A.9: pH môi trường điều chỉnh HCl NaOH A.10 Môi trường ISP- (Inorganic Salts Starch) Tinh bột tan 10,0 g KH2PO4 1,0 g MgSO 7H2O 1,0 g NaCl 1,0 g (NH )2SO 2,0 g CaCO 1,0 g Thạch Nước cất vừa đủ pH 20,0 g 1000 ml 7,0 đến 7,2 CHÚ THÍCH A.10: pH môi trường điều chỉnh HCl NaOH A.11 Dung dịch pha loãng (dung dịch natri clorua) Natri clorua (NaCl) 8,5 g Nước cất vừa đủ 1000 ml pH 6,8 đến 7,0 PHỤ LỤC B (Qui định) PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ỨC CHẾ VI KHUẨN GÂY BỆNH CÂY TRỒNG CẠN B.1 Xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng thơng qua kích thước vòng đối kháng B.1.1 Cách tiến hành Lấy 0,1 ml dung dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ tế bào vi sinh vật đạt 10 CFU/ml) cấy vào đĩa Petri chứa 30 ml môi trường SPA (lớp thạch thứ nhất) chuẩn bị sẵn (6.1.2.2) Dùng que gạt vô trùng gạt dung dịch vi khuẩn gây bệnh thấm hoàn toàn bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch; Sau bề mặt thạch khô (khoảng h), tiếp tục phủ khoảng 15 ml đến 20 ml mơi trường thích hợp với vi sinh vật đối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ Các đĩa thạch để khô 45 min; CHÚ THÍCH 2: Nhiệt độ mơi trường phủ lên lớp thạch thứ từ 35 lớp thạch thứ hai từ mm đến mm O C đến 45 OC Độ dày Lấy 0,1 ml dung dịch huyền phù ban đầu (xem 6.2.3.1.a) cấy lên bề mặt lớp thạch thứ hai Dùng que gạt vô trùng gạt dịch mẫu thấm hoàn toàn bề mặt lớp thạch thứ hai; Các đĩa thạch nuôi cấy điều kiện nhiệt độ từ 28 OC đến 32 OC thời gian từ ngày đến ngày; Mỗi mẫu lặp lại khơng lần B.1.2 Tính kết Hoạt tính đối kháng vi sinh vật thể thơng qua kích thước vòng đối kháng (vòng tròn suốt bao quanh khuẩn lạc), tính mm theo cơng thức (3): Kích thước vòng đối kháng = D d (3) D đường kính vòng đối kháng, tính mm; D đường kính khuẩn lạc, tính mm Kết giá trị trung bình cộng lần lặp lại B.2 Xác định hoạt tính đối kháng vi sinh vật đối kháng thông qua tỷ lệ bị bệnh B.2.1 Tiến hành thử nghiệm Thử nghiệm tiến hành với công thức: Công thức đối chứng (nhiễm vi khuẩn gây bệnh), cơng thức thí nghiệm (nhiễm vi sinh vật đối kháng vi khuẩn gây bệnh ) Mỗi cơng thức lặp lại khơng lần với tổng số khơng 50 cây; Dung dịch vi sinh vật đối kháng bón vào đất vô trùng trước gieo trồng, đảm bảo mật độ vi sinh vật đối kháng đạt 10 CFU/g đất; Ngâm hạt củ giống dịch vi khuẩn gây bệnh (mật độ đạt 10 CFU/ml) thời gian 30 Gieo (trồng) hạt (hoặc củ) nhiễm vi khuẩn gây bệnh vào đất công thức đối chứng đất nhiễm dịch vi sinh vật đối kháng cơng thức thí nghiệm; Thí nghiệm chăm sóc theo qui trình phù hợp với đối tượng chủ; đảm bảo phát triển, phát sinh vi khuẩn gây bệnh; Sử dụng nước vô trùng để giữ ẩm độ tương đối (RH) không nhỏ 70 % nhiệt độ đạt từ 25 oC đến 30 oC; Trong thời gian từ 30 đến 45 ngày kể từ gieo trồng, phải quan sát ghi nhận hàng ngày tình trạng sức khỏe trồng (khơng có triệu chứng bệnh có triệu chứng bệnh) CHÚ THÍCH 4: 1) Đất khử trùng phương pháp khử trùng ngưng đoạn [khử trùng ngày liên tiếp 121 OC khơng 20 nồi hấp áp lực (5.2)] 2)Hạt, củ giống khử trùng bề mặt cách ngâm dung dịch H 2O %, thời gian từ đến min, sau rửa - lần nước vô trùng 3) Thử nghiệm phải bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưởng yếu tố phi thí nghiệm B.2.2 Tính kết Tỷ lệ bị bệnh (%) tính theo cơng thức (4): Tỷ lệ bị bệnh (%) = Trung bình cộng số bị bệnh Trung bình cộng số điều tra x 100 (4) So sánh tỷ lệ bị bệnh cơng thức thí nghiệm với cơng thức đối chứng đánh giá hoạt tính đối kháng vi sinh vật theo cấp độ nêu Bảng Bảng – Mức độ hoạt tính đối kháng vi sinh vật Tỷ lệ bị bệnh (%) Cấp độ đối kháng Mức độ hoạt tính đối kháng Không lớn 30 Cao Từ 31 đến 50 Khá Từ 51 đến 70 Trung bình Từ 71 đến 80 Yếu Khơng nhỏ 80 Khơng có ... nitơ vi sinh vật theo TCVN 8564:2010 Xác định hoạt tính phân giải phốt phát vi sinh vật theo TCVN 8565:2010 hay TCVN 6167:1996 Trong xác định hoạt tính phân giải phốt phát theo TCVN 8565:2010 phương... tài Xác định hoạt tính phân giải xenlulo vi sinh vật theo TCVN 6168:2002 Xác định hoạt tính ức chế nấm gây bệnh trồng cạn vi sinh vật theo TCVN 8566:2010 Xác định hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh... 6.3.1 Ni cấy Cấy vòng que cấy giống vi sinh vật vào ống nghiệm chứa môi trường ni cấy thích hợp chuẩn bị sẵn (6.1.2.1), tiến hành tủ cấy vô trùng (5.1) - Nuôi cấy điều kiện thích hợp (từ 28 OC