Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7082-1:2002 trình bày về sữa và sản phẩm sữa – xác định dư lượng hợp chất clo hữu cơ (thuốc trừ sâu) - phần 1: xem xét chung và phương pháp chiết. Tiêu chuẩn này mô tả các xem xét chung và phương pháp chiết để xác định dư lượng của thuốc trừ sâu clo hữu cơ trong sữa và các sản phẩm sữa.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7082-1:2002 SỮA VÀ SẢN PHẨM SỮA – XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG HỢP CHẤT CLO HỮU CƠ (THUỐC TRỪ SÂU) PHẦN 1: XEM XÉT CHUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT Milk and milk products – Determination of residues of organochlorine compounds (pesticides) Part 1: General considerations and extraction methods Lời nói đầu TCVN 7082 – 1: 2002 hoàn toàn tương đương với ISO 3890 – : 2000; TCVN 7082 – : 2002 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ ban hành Cảnh báo – Khi áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến chất liệu, thiết bị thao tác nguy hiểm Tiêu chuẩn không đề cập đến vấn đề an toàn sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn quy định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn mô tả xem xét chung phương pháp chiết để xác định dư lượng thuốc trừ sâu clo hữu sữa sản phẩm sữa Phụ lục A quy định phương pháp chiết sản phẩm có hàm lượng chất béo cao Phụ lục B đưa hướng dẫn cho phép phân tích có mặt biphenyl polyclo hóa (PCB) Khả áp dụng phương pháp khác nêu bảng Bảng Khả áp dụng phương pháp hợp chất khác Phương α pháp -HCH HCH HCH Andrin/ dieldrin Heptaclo Heptaclo epoxit DDT Clodan DentaDDE Oxy – Endrin keto- HCB TDE clodan endrin lzome A + + + + + + + + - B + + + + + + + + - C + + + + + + + + + D + + + + + + + + + E + + + + + + + + + F + + + + + + + + + + G + + + + + + + + + + H + + + + + + + + + Ký hiệu: + Có khả áp dụng - Khơng có khả áp dụng Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 3890 – : 2002 (ISO 3890 – : 2000) Sữa sản phẩm sữa – xác định dư lượng hợp chất clo hữu (thuốc trừ sâu) – Phần 2: Các phương pháp làm dịch chiết thô thử khẳng định TCVN 6910 – : 2001 (ISO 5725 – : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa chung TCVN 6910 – : 2001 (ISO 5725 – : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau: 3.1 Hàm lượng hợp chất clo hữu (contents of organochlorine compounds): Phần khối lượng chất xác định quy trình quy định tiêu chuẩn Chú thích – Hàm lượng hợp chất clo hữu biểu thị miligam kilogam chất béo sản phẩm (đối với sản phẩm có hàm lượng chất béo thấp) Nguyên tắc Chú thích – Các phương pháp dựa quy trình bốn giai đoạn; đơi hai giai đoạn kết hợp toàn phần 4.1 Chiết Dư lượng chất mẫu chiết dung mơi thích hợp, cho thu phần dư lượng tối đa dịch chiết lượng tối thiểu chất khác bị chiết đồng thời mà gây nhiễu phép xác định 4.2 Làm Loại bỏ chất gây nhiễu khỏi dịch chiết để thu dung dịch chứa phần dư lượng chiết dung mơi thích hợp cho việc kiểm tra định lượng phương pháp xác định chọn 4.3 Xác định Hàm lượng hợp chất clo hữu xác định phương pháp sắc ký khí lỏng có dị điện tử - E.C.D (electron-capture-detection) 4.4 Thử khẳng định Phải khẳng định dư lượng thuốc trừ sâu nhận dạng được, đặc biệt trường hợp dư lượng thuốc trừ sâu vượt mức tối đa cho phép Sự gây nhiễu PCB thuốc trừ sâu vấn đề thường gặp cột nhồi mức độ ảnh hưởng cột mao dẫn Khi nồng độ PCB tương đối cao, nên xác định PCB theo IDF 130A [14] Yêu cầu thuốc thử vật liệu 5.1 Khái quát Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, nước cất nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương Chưng cất lại nước dung môi sử dụng kiểm tra độ tinh khiết chúng (xem 5.2) Giới hạn tạp chất loại thuốc thử sử dụng không vượt giới hạn quy định 14.4 Tuy nhiên, tổng lượng tạp chất tất thuốc thử sử dụng phương pháp lớn giới hạn Làm định kỳ hoạt hóa chất hấp thụ theo yêu cầu phương pháp phân tích khác Kiểm tra độ tinh khiết chúng (xem 5.2.5) Chú ý không để nước, dung môi, chất hấp thụ v.v bị nhiễm bẩn vật liệu chất dẻo cao su Bảo quản tất thuốc thử, chất hấp thụ… làm chai lọ thủy tinh có nắp thủy tinh nút polytetrafloroetylen (PTFE) Khơng để chúng ngồi khơng khí sau làm Trong nhiều trường hợp, nhơm rửa axeton có khả bảo vệ thích hợp 5.2 Kiểm tra độ tinh khiết thuốc thử 5.2.1 Dung môi Cô đặc dung môi với hệ số tương ứng phương pháp sử dụng Kiểm tra độ tinh khiết phương pháp sắc ký khí lỏng (GLC) (xem 6.2) Sắc ký đồ phải khơng hiển thị tín hiệu nhiễu chất tạp nhiễm có nồng độ vượt giới hạn xác định theo 14.4 Chiết cô đặc axetonitril, dimetylformamit (DMF) metylen clorua đến thể tích giống sử dụng phương pháp kiểm tra dung dịch cuối sắc ký khí 5.2.2 Nước Chiết 10 phần (theo thể tích) nước với phần (theo thể tích) n-hexan dầu nhẹ Tách pha hữu Cô đặc với hệ số tương ứng phương pháp sử dụng kiểm tra độ tinh khiết phương pháp GLC (xem 6.2) Sắc ký đồ phải không hiển thị tín hiệu nhiễu chất tạp nhiễm có nồng độ vượt giới hạn xác định theo 14.4 5.2.3 Muối vô Dùng n-hexan dầu nhẹ để chiết muối vơ (ví dụ muối natri clorua), sau làm theo yêu cầu phương pháp phân tích khác nhau, tất dung dịch lỏng sử dụng Cô đặc dịch chiết với hệ số tương ứng phương pháp sử dụng thử nghiệm sắc ký khí lỏng (GLC) Sắc ký đồ phải không hiển thị tín hiệu nhiễu tạp chất có nồng độ vượt giới hạn xác định 14.4 5.2.4 Bông cotton, thủy tinh thạch anh Sử dụng chiết Soxhlet để chiết chất n-hexan axeton chúng khơng cịn chứa chất gây nhiễu 5.2.5 Chất hấp thụ Rửa giải lượng chất hấp phụ lượng sử dụng phương pháp phân tích thể tích hỗn hợp dung môi tương ứng Cô đặc dịch rửa giải theo hướng dẫn phương pháp phân tích kiểm tra độ tinh khiết phương pháp GLC (xem 6.2) Sắc ký đồ khơng hiển thị tín hiệu nhiễu tạp chất có nồng độ vượt giới hạn xác định 14.4 Thường xuyên kiểm tra hoạt độ chất tạp phụ 5.2.6 Dung dịch tiêu chuẩn Sử dụng vật liệu có độ tinh khiết 95% để chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn dùng cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu Nếu bảo quản - 200C nhìn chung chúng bền từ năm đến năm Các dung dịch gốc có nồng độ mg/ml, bảo quản tủ lạnh nhiệt độ khoảng 0C thường bền vòng từ tháng đến tháng Chuẩn bị dung dịch pha lỗng ngày sử dụng Chú thích – Sự thay đổi thể tích bay dung mơi, ví dụ qua khe hở nắp cổ bình, ngun nhân gây sai số Bảo quản dung dịch tiêu chuẩn lọ thủy tinh tủ lạnh tránh nhiễm bẩn xảy vật liệu chất dẻo cao su Không để dung dịch tiêu chuẩn tiếp xúc với ánh sáng mặt trời tia cực tím thời gian dài Có thể sử dụng phương pháp khối phổ sắc ký khí – lỏng để kiểm tra chất chuẩn dùng phân tích độ nhiễm bẩn Kinh nghiệm cho thấy sai sót q trình chuẩn bị, xử lý bảo quản chất chuẩn dung dịch tiêu chuẩn nguyên nhân gây sai số Yêu cầu thiết bị, dụng cụ 6.1 Khái quát Làm kỹ tất dụng cụ thủy tinh dùng phép phân tích dư lượng Có thể dùng dung dịch axit cromic axit sunphuric nóng để làm Nếu sử dụng dung dịch này, cần rửa dụng cụ thủy tinh, sau tráng lại nước cất axeton trước sấy khô Ngay trước dùng, phải tráng lại dụng cụ thủy tinh dung môi sử dụng để phân tích Khơng sử dụng loại nút chất dẻo thơng thường [ví dụ nhựa polyvinyl clorua (PVC)] cho bình chứa chất chuẩn chúng làm nhiễm bẩn chất chuẩn Cần dùng nút thủy tinh polytetrafloroetylen (PTFE) Tương tự, khơng dùng phễu chiết có nút van khóa chất dẻo Chai rửa phải làm hoàn toàn thủy tinh Thay nút thông thường nút thủy tinh nút PTFE Hầu hết phương pháp quy định loại cột sắc ký riêng, chúng chế tạo đặc biệt có khóa thủy tinh PTFE Tại đỉnh cột sắc ký phải có khớp nối thủy tinh mài để nối với bình chứa dung mơi phận điều chỉnh áp lực Đôi khớp nối thủy tinh mài phía vịi có tác dụng việc ứng dụng sức hút dùng bình Buchner thích hợp Có thể sử dụng hai loại thiết bị cô dung môi Loại thứ thiết bị cô quay Kuderna – Danish 1) (hoặc tương tự), (xem tài liệu tham khảo [1]), thiết bị có khơng có cột phân đoạn gia nhiệt buồng Loại thứ hai loại thiết bị cô quay màng mỏng khác (có bán sẵn thị trường), loại thiết bị cần có nguồn chân khơng, tốt bơm chân khơng sử dụng nước, gia nhiệt đến nhiệt độ cao 50 0C Cần kiểm tra định kỳ ảnh hưởng loại thiết bị cô dung mơi thất thuốc trừ sâu dễ bay Có thể sử dụng “tác nhân bảo vệ” (propilen glycol, n-undecan hexadecan) để giảm thiểu thất thoát thuốc trừ sâu Nếu sử dụng thiết bị đồng hóa, phải thận trọng để đảm bảo chúng hồn tồn khơng bị nhiễm bẩn Kiểm tra phận làm ẩm đĩa đáy để phát khe hở xung quanh đĩa Các chất hàn kín nguồn gây nhiễm bẩn Các ống hình gắn với khớp nối thủy tinh mài tiêu chuẩn 14 mm có dung tích khoảng 15 ml (nghĩa có chiều dài ống từ 80 mm đến 90 mm) cần cho phân đoạn cô đặc cuối Các ống gắn khít với cột micro – Snyder 1) (xem tài liệu tham khảo [2]) Các dung dịch thường giảm đến thể tích nhỏ cuối cách thổi luồng khơng khí khí nitơ qua chúng1) Không dùng ống cao su chất dẻo PVC cho mục đích này: ống PTFE nylon thường cho thấy có nguy bị nhiễm bẩn Có thể xử lý giấy lọc dung môi Bồn nồi cách thủy cần có giá đỡ tương thích với thiết bị sử dụng Đôi cần sử dụng máy ly tâm có khả xử lý khoảng vài trăm mililit nhũ tương với tần số quay từ 2000 vòng/phút đến 4000 vịng/phút 6.2 Thiết bị sắc ký khí lỏng (GLC) Sử dụng hệ thống sắc ký khí lỏng thích hợp, tốt trang bị kèm theo gia nhiệt riêng cho bơm, detectơ lị cột Nhìn chung, thiết bị bơm mẫu trực tiếp lên cột sắc ký khí lỏng (GLC) thích hợp Mặc dù lựa chọn phận khác hệ thống sắc ký khí lỏng GLC tùy thuộc kinh nghiệm người phân tích, cần xem xét khuyến nghị sau đây: a) Các E.C.D (3H, 63Ni) chứng minh phù hợp để xác định hợp chất clo hữu Điều chỉnh detectơ theo dẫn nhà sản xuất Định kỳ kiểm tra lệch độ nhạy detectơ cách kiểm tra độ tuyến tính đồ thị hiệu chuẩn dùng dung dịch tiêu chuẩn thuốc trừ sâu (xem 5.2.6) Không dùng detectơ 3H yêu cầu nhiệt độ 2250C 1) Đây ví dụ sản phẩm phù hợp sẵn có Thơng tin đưa để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn tổ chức ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm b) Tốt dùng cột silica nóng chảy thủy tinh có độ dài từ 1,5m đến 3m đường kính từ mm đến mm s) Sử dụng vật liệu phụ trợ thích hợp, có chất lượng tốt (Các vật liệu phụ trợ thích hợp Gaschrom Q, Chromosorb W – HP, Anachrom Q tương ứng 60/80, 80/100 100/120 mesh ứng dụng có hiệu quả)1) d) Rất nhiều pha tĩnh hỗn hợp pha tĩnh sử dụng có hiệu phụ thuộc vào số lượng chủng loại thuốc trừ sâu clo hữu cơ, ví dụ: - hydrocacbon: Apiezon L - metylsillicon: DC - 11, DC - 200, OV - 1, QC - 101, SP - 2100, SE - 30 - metylphenylsillion: OV – 17, OV – 61, OV – 25, SP – 2250, SE - 52 - trifloropropylmetysillicon: QF – 1, OV – 210, SP - 2401 - phenylxianopropylmetylsillicon: OV – 225, XE – 60 Làm lắng cách cẩn thận pha tĩnh cột phụ, tỷ lệ phụ thuộc vào kết hợp cột phụ/pha chọn Trong trường hợp, ổn định cột nhồi 24 h nhiệt độ gần với nhiệt độ tương thích tối đa loại pha tĩnh sử dụng Kiểm tra hiệu tính chọn lọc chúng nhiệt độ hoạt động yêu cầu sử dụng hỗn hợp tiêu chuẩn hợp chất clo hữu Sắc ký khí mao dẫn kỹ thuật quan trọng có khả chiết tốt so với cột nhồi Kỹ thuật mao dẫn khuyến nghị sử dụng đặc biệt trường hợp chất chiết phức tạp Tuy nhiên, ý sử dụng ống mao dẫn thủy tinh khử hoạt tính, khơng, mức nồng độ picogam, hợp chất quan tâm bị thất thoát bị hấp phụ lên bề mặt thủy tinh Để tránh tượng này, loại cột silica nóng chảy khuyến nghị sử dụng Sử dụng nitơ khô, tinh khiết (không chứa oxy, sử dụng E.C.D), hỗn hợp khí argon/metan (khi dùng E.C.D dạng xung) làm khí mang cho cột nhồi, với tốc độ dịng khí phụ thuộc vào kích cỡ loại cột sử dụng Kiểm soát tốc độ dịng khí theo đặc tính cột detectơ Nhìn chung, phải đảm bảo tốc độ dịng khí kiểm sốt xác tốt [±(0,5 đến 1,0)% giá trị tốc độ dịng khí] Đặt lọc rây phân tử mạch nguồn định kỳ phục hồi chúng Nói tóm lại, cần đảm bảo điều kiện sắc ký khí lỏng (GLC) (nghĩa chiều dài cột, loại pha tĩnh, bơm, detectơ, nhiệt độ cột tốc độ dịng khí v.v…) cho việc tách hợp chất clo hữu gần với lượng thực có mặt tốt Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo phương pháp TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) [3] Điều quan trọng phòng thử nghiệm phải nhận mẫu đại diện khơng bị hỏng bị biến đổi q trình vận chuyển bảo quản Chuẩn bị mẫu thử 8.1 Sữa Điều chỉnh nhiệt độ mẫu thử 350C đến 400C, cách sử dụng nồi cách thủy, cần trộn kỹ mẫu thử cách nhẹ nhàng cách lật lật lại hộp chứa mẫu mà không tạo bọt đánh kem làm nguội nhanh đến nhiệt độ khoảng 20 0C 8.2 Sữa bột Lắc đảo chiều hộp chứa Mở nắp hộp, rót từ từ mẫu thử sang hộp chứa thứ hai (có nắp đậy kín khí) trộn cách chuyển qua chuyển lại mẫu thử, ý không để chất béo hay thành phần khác mẫu sót lại thành đáy hộp thứ Cuối cùng, chuyển hết mẫu sang hộp chứa thứ hai Trường hợp mẫu thử đựng hộp kín, đặt hôp chưa mở nồi cách thủy nhiệt độ khoảng từ 400C đến 600C, cần Cứ 15 phút, lấy hộp lắc mạnh Sau giờ, lấy hẳn hộp để nguội đến nhiệt độ phịng Mở hẳn nắp hộp, dùng thìa dao trộn để trộn kỹ lượng sữa hộp 8.3 Sữa đặc có đường Mở nắp hộp chứa trộn kỹ lượng sữa bên thìa dao trộn Sử dụng động tác vừa tạo chuyển động quay vừa tạo chuyển động lên - xuống cho lớp phần góc đáy hộp trộn lẫn với Không để chất béo thành phần khác mẫu sót lại thành đáy hộp Chuyển hết mẫu thử sang hộp chứa thứ hai (có nắp đậy kín khí) Đậy nắp hộp Trường hợp mẫu thử đựng hộp kín, đặt hộp chưa mở nồi cách thủy nhiệt độ khoảng từ 300C đến 400C, cần Mở nắp hộp, chuyển toàn lượng sữa bên đĩa có kích thước đủ rộng để trộn kỹ tiến hành trộn toàn lượng sữa đồng Trường hợp mẫu thử đựng ống gấp lại được, mở ống chuyển mẫu thử bình chứa Sau cắt mở ống, vét chuyển tồn lượng mẫu cịn dính lại ống vào bình chứa nói 8.4 Sản phẩm sữa bột Trộn kỹ mẫu thử cách quay đảo ngược vật chứa mẫu nhiều lần Chuyển toàn mẫu thử vào vật chứa kín khí có dung lượng đủ lớn, cần 8.5 Bơ butterfat Gia nhiệt mẫu thử đến nhiệt độ khoảg 600C chất béo tách Gạn mẫu qua nút thủy tinh vào phễu thủy tinh gia nhiệt 8.6 Phomat Tách chất béo khỏi mẫu thử theo quy định TCVN 7082 – 2: 2002 (ISO 3890 - 2) 8.7 Các sản phẩm sữa khác Đảm bảo mẫu thử đồng Cách tiến hành 9.1 Khái quát Những người thực phải tự làm quen kỹ với phương pháp phân tích trước bắt đầu phép phân tích qui định Cho chạy thử mẫu trắng thuốc thử chúng thỏa mãn yêu cầu phép phân tích Đồng thời tiến hành thử nghiệm phục hồi “sự hoạt tính” mức phù hợp chúng thỏa mãn yêu cầu phép phân tích (xem điều 13) Tuân thủ cách xác theo trình tự tiến hành cho phép phân tích khơng có thay đổi Nếu khơng thể hồn thành phép phân tích vịng ngày cần dừng chúng vào ban đêm, phải bảo quản dịch chiết mẫu dạng dung dịch dung môi khan đựng bình có nắp đậy kín, đặt tủ lạnh nhiệt độ từ 0C đến 50C Khơng dừng q trình chiết, sắc ký cột v.v… Chú thích – Cần phải liên tục xem xét áp dụng phương pháp khác, kỹ thuật cập nhật hay kỹ thuật cho kết chí cho kết xác 9.2 Chiết Cân lượng mẫu thử quy định, tốt tính gam (±1%) Để mẫu đơng lạnh rã đơng trước ngâm số trường hợp mẫu đơng lạnh gây khó khăn cho q trình chiết Thời gian ngâm mẫu phút 9.3 Làm Tiến hành trình tách phễu chiết lần phút, lắc mạnh phễu phải cân áp suất cách mở van khóa phễu chiết đảo ngược Nếu lắc mạnh tạo thể nhũ tương bền tốt nên lắc nhẹ khoảng thời gian dài Có thể phá vỡ thể nhũ tương cách thêm vào ml đến ml dung dịch natri clorua natri sunphat bão hòa, cách làm ấm vịi nước nóng, hay cho ly tâm (xem điều 6) Khi lớp phân tách, lấp lớp phân cách bị nhũ hóa để chiết lại loại bỏ Tốc độ rửa giải cột sắc ký thường quy định cụ thể nhìn chung phải nằm khoảng ml/min đến 5ml/min Tại giai đoạn quy trình nên bổ sung lượng biết pentaclobenzen dễ bay (hoặc 1,7 - dibromoheptan) chất chuẩn nội bay (ví dụ Mixex: 1,2,3,4 – tetracloronaphtalen izodrin) Sử dụng petaclorobenzen làm chất thị lượng thuốc trừ sâu dễ bị thất thoát giai đoạn bay cách so sánh chiều cao (diện tích) pic với chiều cao (diện tích) pic thu sử dụng chất chuẩn nội bay Có thể sử dụng chất chuẩn nội để nhận biết (thời gian lưu tương đối) để định lượng Không để bay dung môi hữu đến khơ hồn tồn, trừ quy định 10 Thử sơ Bơm vào sắc ký khí (xem 6.2) thể tích thích hợp từ 1,0 l đến 10 l , tùy thuộc vào hệ thống dịch chiết làm thu theo phương pháp phân tích sử dụng Sắc ký đồ thu hiển thị chất nồng độ gần hợp chất có mặt dịch chiết 11 Thử định lượng Nếu phép thử sơ cho thấy dư lượng đạt tới vượt mức cho phép, kiểm tra lại kết thu cách sử dụng thêm cột sắc ký khí lỏng phận khác Nếu kết thu cột giống lần trước, kiểm tra hai dịch chiết mẫu Đối với phép thử định lượng, chuẩn bị hai dung dịch tiêu chuẩn (xem 5.2.6) hợp chất clo hữu nhận biết (xem điều 10) dung môi sử dụng cho dịch chiết cuối cùng, thường dầu nhẹ n-hexan Nồng độ chúng phải bao trùm dải nồng độ dự kiến có dịch chiết cuối (xem điều 10) Sau bơm hai dung dịch tiêu chuẩn dịch chiết cuối với thể tích vào sắc ký khí (xem 6.2) Tiến hành bơm phần dịch chiết mẫu thử làm trước sau bơm hai dung dịch tiêu chuẩn Đo chiều cao diện tích pic Kết thu từ hai lần bơm dung dịch tiêu chuẩn không lệch 5% Việc sử dụng chất chuẩn nộ dùng để định lượng (xem 9.3) 12 Thử khẳng định Sử dụng quy trình để thử khẳng định nhận dạng hợp chất clo hữu phát được, đặc biệt trường hợp hàm lượng chúng vượt giới hạn dư lượng tối đa (MRL) Phương pháp mô tả TCVN 7082 – (ISO 3890 - 2) cho phép nhận biết dư lượng thông qua thời gian lưu hợp chất clo hữu cột sắc ký lỏng (GLC) Sử dụng hai cột sắc ký có độ phân cực khác Ngồi ra, quy trình sắc ký mao dẫn thủy tinh, sắc ký lớp mỏng, khối phổ, độ tinh khiết (p-value), sắc ký khí lỏng q trình oxy hóa sản phẩm chuyển hóa khác kỹ thuật tương tự có giá trị Xem TCVN 7082 – (ISO 3890 - 2) 13 Đánh giá kết 13.1 Tính kết Tính nồng độ hợp chất clo hữu mẫu thử từ tỷ lệ phần tương ứng sắc ký đồ mẫu chất chuẩn dãy chất chuẩn Biểu thị nồng độ theo mẫu thử chất béo (xem 13.2.1) tùy theo quy trình, sản phẩm số lượng mẫu thử Độ thu hồi 80% không kết phải hủy bỏ (xem điều 9) 13.2 Trình bày biểu thị kết 13.2.1 Thông thường, hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu sản phẩm sữa biểu thị theo chất béo Tuy nhiên, trường hợp sản phẩm sữa có hàm lượng chất béo thấp, nên biểu thị theo mẫu thử tốt hàm lượng chất béo sản phẩm sữa chất béo dao động lớn, phụ thuộc vào phương pháp chiết chất béo sử dụng (xem phụ lục A chiết chất béo) 13.2.2 Nên xác định hàm lượng chất béo phương pháp thích hợp (xem tài liệu tham khảo) ghi lại kết với hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu Tiếp theo, nêu rõ hàm lượng thuốc trừ sâu clo hữu biểu thị theo cách nào, ví dụ miligam kilogam theo chất béo hay theo mẫu Chú thích – Điểm ngưỡng 2% chất béo giá trị thực tiễn thỏa thuận 13.2.3 Khi giá trị dư lượng không đạt hay vượt mức cho phép, phải ghi lại giá trị thu từ phép xác định đơn lẻ 13.2.4 Trong trường hợp có nhiều giá trị dư lượng đạt hay vượt mức cho phép, cần tiến hành sau: a) Nêu rõ nồng độ trung bình dải nồng độ hợp chất clo hữu Không hiệu chỉnh nồng độ trung bình phần trăm độ thu hồi hợp chất clo hữu b) Nêu rõ phần trăm thu hồi trung bình giới hạn xác định hợp chất clo hữu tương ứng c) Nêu chi tiết độ lặp lại thông thường nhận mức độ khác kết đo phịng thử nghiệm thơng qua liệu thu từ việc phân tích mẫu làm hoạt tính sản phẩm mẫu chứa dư lượng cịn hoạt tính d) Nêu chi tiết độ tái lập thường nhận nồng độ trung bình đo mẫu ngoại suy từ liệu cho 13.2.2 14 Độ chụm 14.1 Đánh giá độ chụm Đánh giá độ chụm phương pháp phân tích theo yêu cầu TCVN 6910 – 1: 2001 (ISO 5725-1 : 1994) TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Một vài tiêu chí chung, dựa kinh nghiệm, đưa 14.2 14.3 dẫn cho nhà phân tích 14.2 Độ lặp lại Mỗi phịng thử nghiệm nên định kỳ xác định độ lặp lại cách phân tích mẫu bị hoạt tính hợp chất clo hữu thích hợp, hoặc, tốt sử dụng mẫu chứa dư lượng cịn hoạt tính, nồng độ gần mức cho phép tối đa Các mẫu nên lấy từ sản phẩm nên dùng để làm mẫu thông thường khơng có dấu hiệu chất đặc biệt, Chênh lệch giá trị lớn giá trị nhỏ ba kết thử phải nhỏ giá trị đưa bảng Xác định giá trị trung gian cách nội suy từ đồ thị logarit – logarit Bảng Độ lặp lại Mức dư lượng mg/kg Chênh lệch mg/kg 0,01 0,005 0,1 0,025 0,125 Chú thích – Trong thí dụ 0,01 mg/kg gần với giới hạn xác định 14.3 Độ tái lập Sử dụng bảng 3, số liệu bảng dựa kết thực nghiệm Xác định giá trị trung gian cách nội suy từ đồ thị logarit – logarit Bảng Độ tái lập Mức dư lượng mg/kg Chênh lệch mg/kg 0,01 0,01 0,1 0,05 0,25 Chú thích – Trong thí dụ 0,01 mg/kg gần với giới hạn xác định 14.4 Giới hạn xác định Về lý thuyết, giới hạn xác định sản phẩm có liên quan xác định nồng độ hợp chất clo hữu (tính theo gam kilogam) tương ứng với độ cao h pic thấp đo được, sắc ký đồ dịch chiết sản phẩm, xác định phương trình sau: h = hB1 + 2WB1 đó: hB1 giá trị trung bình số chiều cao pic thử mẫu trắng phía đường thơng thường thời gian lưu tương ứng; WB1 giá trị số biên độ trung bình tín hiệu thử mẫu trắng thời gian lưu tương ứng (WB1 xác định đồ thị theo độ rộng tín hiệu trung bình thứ mẫu trắng) Giới hạn xác định phụ thuộc vào độ tinh khiết, chất chất điều kiện sắc ký khí lỏng (đặc biệt loại cột nhiệt độ cột, khí mang độ nhậy detctor) Vì điều kiện quy định cách xác, nên giới hạn xác định phải thiết lập cho quy trình phịng thử nghiệm Về nguyên tắc chung, giới hạn xác định dư lượng thuốc trừ sâu nên nhỏ 10% giới hạn dư lượng tối đa Tuy nhiên, giới hạn dư lượng tối đa 0,05 mg/kg nhỏ hơn, giới hạn xác định 20% giá trị phù hợp, ngoại trừ trường hợp giới hạn dư lượng tối đa quy định gần mức xác định 15 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải nêu rõ: - tất thơng tin cần thiết để nhận biết hồn tồn mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn này, coi tùy ý lựa chọn, với tất chi tiết bất thường ảnh hưởng đến kết thử; - hiệu chỉnh thực hiện, giá trị thu lớn 2,5 mg thử mẫu trắng phương pháp; - kết thu được; kiểm tra độ lặp lại nêu kết cuối thu PHỤ LỤC A (quy định) CHIẾT CHẤT BÉO VÀ CÁC HỢP CHẤT CLO HỮU CƠ VÀ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT BÉO A.1 Khái quát Các hợp chất clo hữu liên kết với pha chất béo thường biểu thị miligam kilogam chất béo, sản phẩm chứa hàm lượng chất béo cao (lớn 2%) Trong trường hợp vậy, không cần thiết phải xác định hàm lượng chất béo mẫu cần xác định dư lượng clo hữu khối lượng biết chất béo chiết Nếu hàm lượng chất béo mẫu thấp (dưới 2%), ngồi việc ghi lại hàm lượng clo hữu theo mẫu, cần xác định phần trăm chất béo có mẫu A.2 Xác định hàm lượng chất béo Tiến hành xác định hàm lượng chất béo mẫu có hàm lượng chất béo thấp (nhỏ 2%) theo tiêu chuẩn thích hợp với sản phẩm tương ứng (xem danh mục tài liệu tham khảo) theo phương pháp cho kết tương đương Phương pháp dùng chiết Soxhlet không phù hợp để xác định chất béo sữa bột Có thể dùng phương pháp phân tích sử dụng thiết bị hấp thụ hồng ngoại ứng dụng rộng rãi sữa sản phẩm sữa để xác định chất béo mẫu có hàm lượng chất béo thấp A.3 Chiết chất béo hợp chất clo hữu Các phương pháp chiết bao gồm: a) Chiết Soxhlet, áp dụng cho sản phẩm sữa không dạng lỏng; b) Chiết cột, áp dụng cho tất sản phẩm sữa; c) Phương pháp chiết theo AOAC, áp dụng cho sữa sản phẩm dạng lỏng Chú ý – không làm bay dung mơi hữu đến khơ hẳn, làm thất thoát hợp chất clo hữu A.4 Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử loại phân tích, trừ có quy định khác sử dụng nước cất, nước khử khống nước có độ tinh khiết tương đương A.4.1 Xe lit 5452) Trước sử dụng, đốt nóng đến 6000C Bảo quản bình có nắp kín khí A.4.2 Natri sunphat, khan (Na2SO4) Trước sử dụng, nung nóng đến 6000C sau làm nguội bình hút ẩm A.4.3 Cát biển, rửa axit (ví dụ Merk No.7712)2) Trước sử dụng, đốt nóng đến 6000C sau làm nguội bình hút ẩm A.4.4 Dầu nhẹ, nhiệt độ sôi khoảng từ 40 0C đến 600C Trước sử dụng, cho hồi lưu ngược hạt natri hydroxit chưng cất A.4.5 Metanol, (CH3OH) etanol (CH3CH2OH) A.4.6 Dietyl ete (C2H5OC2H5), không chứa peroxit Chưng cất lại trước sử dụng A.4.7 n-Hexan [CH3(CH2)4CH3] Chưng cất lại hạt natri hydroxit trước sử dụng 2) Xelit 545 Merck số 7712 ví dụ sản phẩm phù hợp sẵn có Thơng tin đưa để thuận tiện cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm A.4.8 Axeton (CH3COCH3) Chưng cất lại hạt thủy tinh trước sử dụng A.4.9 Natri oxalat (Na2C2O4) kali oxalat (K2C2O4) A.5 Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị dụng cụ thử nghiệm thông thường, đặc biệt dụng cụ, thiết bị A.5.1 Tủ sấy, có khả trì nhiệt độ khoảng 1020C± 20C đến 2500C±250C A.5.2 Máy ly tâm, loại chống nổ, trang bị ống thủy tinh dung tích 200 ml đến 300 ml, có khả quay với tần số 2000 vòng/phút đến 4000 vòng/phút A.5.3 Thiết bị chiết Soxhlet, bao gồm: a) Bình đáy trịn, dung tích 500 ml b) Bình chiết, dung tích khoảng 200 ml; c) Bộ sinh hàn ngược; d) Nguồn nhiệt (ví dụ đèn măng sơng đốt nóng) A.5.4 Bể cát, dầu nước, cơng suất 400 W A.5.5 Xylanh, chứa khí trơ khơ, gắn với loại xy lanh có đường PTFE A.5.6 Pipet A.5.7 Cân, có độ xác đến 0,001 g dải đo từ 0,01 g đến 1000 g A.5.8 Bộ quay, có bình bay dung tích 500 ml A.5.9 Thiết bị làm nhỏ thực phẩm có nguồn gốc động vật (ví dụ máy trộn, máy khuấy, máy xay hình cầu) A.5.10 Cột chiết, bao gồm ống thủy tinh có đường kính 12 mm chiều dài tổng cộng 300 mm, có cấu trúc thoát mao dẫn chiều dài phần đỉnh 100 mm đường kính 50 mm ± mm A.5.11 Mặt kính đồng hồ, đường kính 100 mm A.5.12 Cối giã, có chày A.5.13 Giấy lọc có rãnh, đường kính khoảng 300 mm, rửa dung mơi A.5.14 Bầu chiết (tùy chọn), chiết sơ dung môi tinh khiết bảo quản hexan đựng bình thủy tinh Chú thích – Sử dụng bầu chiết thường dẫn đến có mặt tạp chất dịch chiết mẫu (xuất pic nhiễu sắc ký khí đồ) A.5.15 Bơng thủy tinh bơng cotton, tinh khiết thành phần hóa học Trước sử dụng, chiết hỗn hợp dung môi hexan/axeton bảo quản bình chứa hexan A.5.16 Phễu thủy tinh, loại dài ngắn A.5.17 Phễu chiết A.5.18 Bi thủy tinh đũa thủy tinh, rửa dung mơi A.5.19 Cốc, cỡ khác A.5.20 Bình định mức A.5.21 Dao kẹp A.5.22 Bơm nước A.6 Quy trình chiết A.6.1 Chiết Soxhlet Làm nóng bình đáy trịn dung tích 500 ml (A.5.3) chứa năm viên thủy tinh (A.5.18) tủ sấy (A.5.1) đến 1020C 30 phút Làm nguội đến nhiệt độ phòng cân Lặp lại q trình sấy khối lượng khơng đổi, nghĩa chênh lệch kết hai lần cân liên tiếp không 0,01 g Cân trực tiếp mẫu mặt kính đồng hồ (A.5.11) Đối với phomat cắt mẫu thành miếng nhỏ Chuyển mẫu vào gối giã (A.5.12) nghiền kỹ hỗn hợp cát (A.4.3) natri sunphat (A.4.2) (tỷ lệ 1:1 theo khối lượng) để thu dạng bột khơ Cũng sử dụng xelit 545 (A.4.1) Lượng natri sunphat (A.4.2) cát (A.4.3) yêu cầu phụ thuộc vào số lượng hàm lượng nước thực phẩm Chuyển lượng bột thu sang giấy lọc (A.5.13) Lau khơ cối giã, chày mặt kính đồng hồ miếng cotton (A.5.15) tẩm dầu nhẹ (A.4.4) Đặt miếng cotton vào giấy lọc chứa bột (A.5.13) chuyển toàn chúng (đã gói lại) vào bình chứa thiết bị chiết Soxlhet Sau cho vào bình (A.5.3) cân, 250 ml dầu nhẹ (A.4.4) lượng dịch chiết mẫu sau dịng đối lưu Cho dung mơi vào cô quay (A.5.8) nhiệt độ khoảng 50 0C điều kiện áp suất giảm sử dụng bơm nước (A.5.22) cân bình Lặp lại quy trình thu khối lượng bình không đổi, nghĩa chênh lệch kết hai lần cân liên tiếp không 0,01 g A.6.2 Chiết cột Trộn kỹ lượng mẫu thích hợp với lượng vừa đủ cát (A.4.3) natri sunphat (A.4.2) (tỷ lệ : theo khối lượng) cối giã (A.5.12) máy xay hình cầu (A.5.9) để thu sản phẩm dạng khơ Đối với trường hợp chiết sữa bột, hồn ngun hoàn toàn chúng nước cất (theo tỷ lệ : 1) trước trộn Chuyển hỗn hợp vào cột chiết (A.5.10) mà trước nhồi lớp natri sunphat dầy 2cm đậy nút nhỏ thủy tinh (A.15.5) Rửa cột khô hỗn hợp n-hexan (A.4.7) axeton (A.4.8) (tỷ lệ : theo thể tích) Lượng dung mơi phụ thuộc vào khối lượng chất mẫu Thu chất rửa giải qua đêm cô đặc chúng cô quay (A.5.8) mô tả A.6.1 A.6.3 Phương pháp chiết theo AOAC A.6.3.1 Lắc 100 ml sữa với 100 ml metanol (A.4.5) g natri oxalat (A.4.9) khoảng phút phễu chiết dung tích 500 ml (A.5.17) Thêm 50 ml dietyl ete (A.4.6) lắc thêm khoảng phút Lặp lại thao tác với 50 ml dầu nhẹ (A.4.4) A.6.3.2 Cách khác, lượng mẫu thuốc thử nói giảm nửa, thêm 50 ml hỗn hợp diety ete/dầu nhẹ (tỷ lệ : theo thể tích) Trong trường hợp này, hỗn hợp cần khuấy trộn mạnh phút Bước tiến hành theo cách tương tự A.6.3.3 Sau tách pha ly tâm với tần số quay 1500 vòng/phút phút, chuyển pha hữu sang phễu chiết khác (A.5.17) chiết pha lỏng hai lần phần 50 ml hỗn hợp diety ete (A.4.6) dầu nhẹ (A.4.4) (tỷ lệ : theo thể tích) Rửa pha dung mơi hỗn hợp 400 ml nước loại bỏ lớp dịch lỏng Làm khô dung dịch dung môi qua natri sunphat (A.4.2) làm bay đến khối lượng khơng đổi bình biết khối lượng cô quay (A.5.8) A.6.4 Chiết bơ Gia nhiệt mẫu đến khoảng 500C gạn qua lọc nóng khơ Hịa tan butterfat dung mơi thích hợp PHỤ LỤC B (tham khảo) PHÉP PHÂN TÍCH KHI CĨ MẶT BIPHENYL ĐÃ POLYCLO HĨA (PCB) B.1 Khái quát Dư lượng biphenyl polyclo hóa (một hỗn hợp đồng phân thu clo hóa biphenyl) thường xuyên tìm thấy thực phẩm, chủ yếu thực phẩm có nguồn gốc từ động vật, số vật liệu bao gói Cho đến giai đoạn chiết tách theo phương pháp đề cập, chúng thể nhiều đặc điểm giống với hợp chất trừ sâu clo hữu Trên sắc ký khí đồ, pic hợp chất biphenyl polyclo hóa (PCB) chồng lên pic số hợp chất trừ sâu clo hữu (đặc biệt pic sắc ký nhóm DDT) điều làm cho việc định lượng loại thuốc trừ sâu khó Ví dụ, trường hợp hàm lượng biphenyl polyclo hóa cao, mg/kg biphenyl polyclo hóa giống 0,1 mg/kg dư lượng thuốc trừ sâu p,p – DDT B.2 Tách PCB khỏi hợp chất trừ sâu clo hữu sắc ký cột cách điều chế dẫn xuất Có vài phương pháp xây dựng để tách PCB khỏi hợp chất trừ sâu clo hữu cơ, tách silicagen, Florisil, nhôm oxit/than củi than củi Các hợp chất PCB bị tách khỏi hợp chất trừ sâu clo hữu cách sử dụng dung mơi có độ phân cực khác Đầu tiên hợp chất PCB rửa giải, sau trình rửa giải thuốc trừ sâu clo hữu dung môi phân cực Việc tách PCB khỏi p,p – DDE đơi gặp khó khăn Các vết dung môi phân cực thay đổi hoạt tính silicagen dẫn đến tách đồng thời phần p,p – DDT với hợp chất PCB Các hợp chất PCB aldrin thường rửa giải khỏi cột silicagen dầu nhẹ, tiếp đến hợp chất trừ sâu clo hữu rửa giải hỗn hợp dung môi axetonitril/hexan/diclorometan (tỷ lệ : 90 : 80 theo thể tích) Trong trường hợp có mặt p,p – DDT gây khó khăn cho việc định lượng, tách DDT cách tạo dẫn xuất tách sản phẩm chuyển hóa Crom trioxit (Cr2O3) axit axetic băng oxi hóa p,p – DDT thành p,p – diclorobenzophenon Các hợp chất PCB lại không bị ảnh hưởng Xử lý dịch chiết dung dịch rượu kiềm tính trước thực xự oxy hóa axit anhydrit cromic khẳng định p,p – DDT có mặt hợp chất PCB Trong quy trình này, p,p - DDT cho phản ứng với kiềm để tạo thành p,p – DDE, sau hợp chất tiếp tục bị oxi hóa thành p,p – diclorobenzophenon Sử dụng phương pháp sắc ký khí cột mao dẫn không cần đến việc tách cột sắc ký có tác dụng tích cực đến định lượng hợp chất trừ sâu clo hữu có mặt hợp chất PCB THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Gunther F.A et al Anal Chem., 23, 1951, p 1835 [2] Burke.j.A.,Mills P.A and Bostwisk D.C.J AOAC, 49, 1966, p 999 [3] TCVN 6400 : 1998 (ISO 707) Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [4] TCVN 6508 : 1999 (ISO 1211) Sữa Xác định hàm lượng chất béo Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn) [5] TCVN 7084 : 2002 (ISO 1736) Sữa bột sản phẩm sữa bột – Xác định hàm lượng chất béo – Phương pháp khối lượng (Phương pháp chuẩn) [6] ISO 1737 Evaporated mlk and sweetened condensed milk – Determination of fat content – Gravimetric method (Reference method) [7] ISO 1854 Whey cheese – Determination of fat content – Gravimetric method (Reference method) [8] ISO 2450 Cream – Determination of fat content – Gravimetric method (Reference method) [9] TCVN 6833 : 2001 (ISO 7208) Sữa gầy, whey buttermilk Xác định hàm lượng chất béo Phương pháp khối lượng (phương pháp chuẩn) [10] TCVN 6687 : 2000 (ISO 8381) Thực phẩm từ sữa dùng cho trẻ em nhỏ Xác định hàm lượng chất béo phương pháp khối lượng Rose – Gottlieb (phương pháp chuẩn) [11] TCVN 6668 – : 2000 (ISO 8262-1), sản phẩm sữa thực phẩm từ sữa Xác định hàm lượng chất béo phương pháp khối lượng Weibull – berntrop (phương pháp chuẩn) Phần 1: Thực phẩm dành cho trẻ nhỏ [12] TCVN 6668 – 2: 2000 (ISO 8262 - 2), Sản phẩm sữa thực phẩm từ sữa Xác định hàm lượng chất béo phương pháp khối lượng Weibull – berntrop (phương pháp chuẩn) Phần 2: Kem lạnh kem lạnh hỗn hợp [13] TCVN 6668 – : 2000 (ISO 8262 - 3), Sản phẩm sữa thực phẩm từ sữa Xác định hàm lượng chất béo phương pháp khối lượng Weibull – berntrop (phương pháp chuẩn) Phần 3: Các trường hợp đặc biệt [14] IDF 130A, Milk and milk products – Determination of polychlorinated .. .TCVN 6910 – : 2001 (ISO 5725 – : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn. .. Thường xuyên kiểm tra hoạt độ chất tạp phụ 5.2.6 Dung dịch tiêu chuẩn Sử dụng vật liệu có độ tinh khiết 95% để chuẩn bị dung dịch tiêu chuẩn dùng cho phân tích dư lượng thuốc trừ sâu Nếu bảo quản... chuẩn dùng phân tích độ nhiễm bẩn Kinh nghiệm cho thấy sai sót q trình chuẩn bị, xử lý bảo quản chất chuẩn dung dịch tiêu chuẩn nguyên nhân gây sai số Yêu cầu thiết bị, dụng cụ 6.1 Khái quát Làm