Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7080:2002 giới thiệu nội dung về sữa và sữa bột – xác định hàm lượng iođua - phương pháp sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao. TCVN 7080:2002 do Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa và sản phẩm sữa biên soạn. Mời các bạn cùng tham khảo.
TIÊU CHUẨN VIỆT NAM TCVN 7080:2002 SỮA VÀ SỮA BỘT – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG IOĐUA PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Milk and dried milk – Determination of iodide content Method using high-performance liquid chromatography LỜI NĨI ĐẦU TCVN 7080: 2002 hồn tồn tương đương với ISO 14378 : 2000; TCVN 7080: 2002 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F12 Sữa sản phẩm sữa biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ ban hành Cảnh báo – Khi áp dụng tiêu chuẩn liên quan đến chất liệu, thiết bị thao tác nguy hiểm Tiêu chuẩn không đề cập đến vấn đề an toàn sử dụng chúng Người sử dụng tiêu chuẩn phải tự thiết lập thao tác an tồn thích hợp xác định khả áp dụng giới hạn qui định trước sử dụng tiêu chuẩn Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) để xác định hàm lượng iođua có mặt mức tương ứng 0,03 g/g đến g/g 0,3 m/g đến 10,0 g/g sữa nguyên chất trùng sữa bột gầy Chú thích – Phương pháp nghiên cứu cộng tác mẫu sữa nguyên chất dạng lỏng sữa bột gầy Phương pháp áp dụng cho sữa gầy sữa bột tách phần chất béo giống sữa bột nguyên chất Chú thích – Phương pháp dùng để định lượng iođua tự (dạng ion) Tuy nhiên, tổng hàm lượng iođua sữa tươi sữa bột chất lượng tốt, khơng có phát triển vi sinh vật, chứa từ 5% đến 10% khối lượng iođua liên kết hữu Hàm lượng iođua liên kết hữu nhiều sữa bị giảm chất lượng vi khuẩn phát triển Tiêu chuẩn viện dẫn TCVN 4851-89 (ISO 3696) Nước dùng để phân tích phòng thử nghiệm Yêu cầu kỹ thuật phương pháp thử Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng định nghĩa sau: 3.1 Hàm lượng iođua sữa nguyên chất trùng sữa bột gầy (iodide content of pasteurized whole milk or dried milk): Phần khối lượng chất xác định qui trình qui định tiêu chuẩn Chú thích – Hàm lượng iođua thường biểu thị microgram gam Nguyên tắc Pha loãng phần mẫu thử nước Lọc qua màng lọc xén mép 25000 D để loại bỏ chất khơng tan chất có khối lượng phân tử cao Các ion iođua tách cặp ion pha đảo HPLC có detector điện hóa điện cực bạc làm việc mV đến 50mV Hàm lượng iođua tính cách dùng đường chuẩn Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử đạt chất lượng tinh khiết phân tích, loại HPLC đặc biệt, phù hợp 5.1 Nước, phù hợp với nước loại TCVN 4851 – 89 (ISO 3696) 5.2 Dung dịch tiêu chuẩn iođua Cảnh báo – dung dịch iođua không bền tiếp xúc với ánh sáng cần bảo vệ tránh ánh sáng 5.2.1 Dung dịch gốc iođua, tương đương với 100mg iođua lít Hòa tan 130,8mg kali iođua (KI) nước đựng bình định mức 000 ml (6.2) Pha lỗng nước đến vạch lắc Dung dịch gốc iođua giữ vòng tháng bảo quản bóng tối nhiệt độ phòng 5.2.2 Dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua, có nồng độ tương đương 20 g, 50 g, 150 g 250 g iođua lít Dùng pipet lấy 20 l, 50 l, 150 l, 250 l dung dịch gốc iođua (5.2.1) cho vào bốn bình định mức 100ml riêng biệt (6.2) Pha loãng dung dịch bình nước vạch lắc Các dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua giữ vòng tuần bảo quản nơi tối nhiệt độ phòng 5.3 Axetonitril (CH3CN), loại dùng cho HPLC 5.4 Hexadexyltrimetylamoni clorua [CH3(CH2)15N(CH3)3Cl], dung dịch 25% (theo khối lượng) nước, loại dùng cho sắc ký cặp ion 5.5 Chất rửa giải dùng cho HPLC: Hỗn hợp dinatri hydro phosphat hexadexyltrimetylamoni clorua hỗn hợp axetonitril nước (tỷ lệ 68 : 32 thể tích), pH = 6,8 Hòa tan 1,42 g dinatri hydro phosphat (Na2HPO4) khoảng 600ml nước bình định mức 1000 ml (6.2) Thêm 1,3 ml dung dịch hexadexyltrimetylamoni clorua (5.4) lắc Rồi thêm 320 ml axetonitril (5.3) lắc lại Chỉnh pH đến 6,8 axit ortophosphoric (H 3PO4) đậm đặc Pha loãng nước đến vạch lắc Làm dung dịch cách lọc qua màng lọc 1,2 m lọc tiếp qua màng lọc 0,5 m Khuấy dung dịch để trộn đồng thời loại khí thiết bị hút chân không siêu âm phút trước bắt đầu sử dụng Chất rửa giải thay đổi cách thêm nước axetonitril để việc chỉnh thời gian lưu iođua khơng đáng kể Chất rửa giải giữ năm, bảo quản vật chứa có nắp đậy kín 5.6 n-Pentanol Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị phòng thử nghiệm thơng thường đặc biệt sau: 6.1 Cân phân tích, cân xác đến 0,01g, đọc đến số thập phân thứ ba 6.2 Bình định mức, dung tích 100ml 1000 ml 6.3 Micropipet, phân phối thể tích tương ứng 20 l, 50 l, 150 l 250 l 6.4 Pipet chia độ, dung tích 2ml, chia độ đến 0,1 ml 6.5 Ống đong chia độ, dung tích 500ml 6.6 pH-met, có điện cực thủy tinh kết hợp 6.7 Bộ lọc màng, cỡ 1,2 m 0,5 m, Nylon-6-61) vật liệu tương đương, có thiết bị lọc chất rửa giải PHLC 6.8 Máy ly tâm, giữ ống ly tâm 50ml tạo gia tốc quay 1000g 6.9 Ống ly tâm, hình nón dung tích 50ml, đường kính 27 mm, chất dẻo dùng lần, có nắp vặn 6.10 Dụng cụ đỡ màng lọc hình nón, để đỡ phễu lọc màng (6.11) ống ly tâm (6.9) Amicon CS1A1), tương đương) 6.11 Phễu lọc màng, cỡ từ 25000 D đến 30000 D (Amicon Centreflo 1) CF-25, tương đương) Chuẩn bị phễu lọc trước sử dụng sau Ngâm phễu hỗn hợp etanol nước (tỷ lệ 2:8 thể tích) vòng 1h Lấy phễu để nước Đặt phễu vào dụng cụ đỡ màng lọc hình nón (6.10) đặt dụng cụ đỡ vào ống ly tâm 50ml Ly tâm phễu gia tốc quay 900g đến 1000g phút đến 10 phút Đảo ngược phễu lọc màng để làm khơ hết phần dung mơi sót lại Đặt phễu chuẩn bị vào dụng cụ đỡ ống ly tâm dán nhãn (6.9) dùng cho mẫu phân tích Sau lần sử dụng, ngâm phễu vào nước nóng, bảo quản hỗn hợp etanol nước (tỷ lệ 1:5 thể tích) Loại bỏ dung môi trước sử dụng phễu cho lần miêu tả phễu Chú thích – Để thay dùng lọc Milipore Ultrare –PF 1) (UFP1, ngưỡng 10.000 D) Bộ lộc dùng lần không cần phải xử lý trước, q trình lọc thực áp suất nhẹ chân không không cần máy ly tâm 6.12 Thiết bị HPLC, bao gồm: 6.12.1 Máy bơm, phân phối tốc độ dòng thể tích 2ml/min 6.12.2 Dụng cụ bơm mẫu, tay tự động, dung tích bơm từ 50 l đến 200 l 6.12.3 Cột phân tích, PARTISPHERE C-182), m, đường kính 4,7 mm, dài 110mm, tương đương 6.12.4 Cột chắn (tùy chọn), ống SPHERI-5 C-183), đường kính 3,2 mm, dài 15 mm, tương đương 6.12.5 Detector điện hóa, dùng d.c mode loại chuẩn ampe xung có điện cực làm việc bạc điện từ 0mV đến + 50mV 6.12.6 Bộ ghi băng biểu đồ tích phân, đo diện tích pic; tốt dùng máy tích phân điện tử có chức đo “pic âm” (ví dụ Spectra Physics 4) thích hợp) Lấy mẫu Việc lấy mẫu không qui định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400: 1998 (ISO 707) [1] Điều quan trọng phòng thử nghiệm nhận mẫu đại diện không bị hỏng không bị biến đổi chất lượng trình vận chuyển bảo quản Bảo quản mẫu để tránh bị hỏng biến đổi thành phần Chuẩn bị mẫu thử 8.1 Khái quát Tránh nhiễm khuẩn suốt trình chuẩn bị mẫu 8.2 Sữa 1) Nilon 6-6 Amicon CS1A, Amicon Centreflo Milipore Ultrafre-PF ví dụ sản phẩm phù hợp sẵn có 2) PARTISPHERE C-18 ví dụ sản phẩm phù hợp sẵn có từ Whatman Inc 3) Ống SPHERI-5 C-18 ví dụ sản phẩm phù hợp sẵn có từ Brownlee 4) Spectra Physics ví dụ sản phẩm phù hợp sẵn có Thơng tin đưa thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn không ấn định sử dụng sản phẩm Đưa mẫu thử nhiệt độ 200C±20C trộn Nếu không thu phân tán đồng chất béo đung nóng mẫu từ từ đến 40 0C, trộn nhẹ cách đảo ngược dụng cụ chứa mẫu Sau làm nguội đến nhiệt độ 200±20C 8.3 Sữa bột Chuyển mẫu sang dụng cụ chứa có nắp đậy kín khí, dung tích lớn gấp hai lần thể tích mẫu Đậy dụng cụ chứa trộn mẫu cách lắc đảo ngược dụng cụ chứa nhiều lần Cách tiến hành 9.1 Phần mẫu thử 9.1.1 Sữa Cân 45g±5g phần mẫu thử, xác đến 0,1 g cho vào bình định mức 100ml (6.2) Pha loãng nước đến vạch trộn 9.1.2 Sữa bột Cân 4,2 g±0,2 g mẫu thử, xác đến 0,01 g cho vào bình định mức 100ml (6.2) Thêm 70ml đến 80ml nước lắc mạnh phút đến 10phút để hòa tan mẫu Cho giọt n-pentanol (5.6) để khử bọt trộn Pha loãng nước đến vạch trộn 9.2 Làm Từ phần mẫu thử pha loãng (9.1.1 9.1.2) rót đầy vào hai phễu màng lọc cách đỉnh khoảng mm cho li tâm gia tốc hướng tâm 900g đến 1000g 15 phút đến 20 phút Phần dịch lọc thu (nghĩa mẫu hai dung dịch thử) bơm trực tiếp lên hệ thống HPLC Chú thích – Về qui trình làm thay thế, xem thích 6.11 9.3 Xác định HPLC 9.3.1 Tối ưu hóa điều kiện HPLC Rửa cột HPLC cách bơm qua cột hỗn hợp axetonitril (5.3) nước (5.1) (tỷ lệ 1: thể tích), bơm tiếp 30ml chất rửa giải HPLC (5.5) Rồi bơm lại chất rửa giải với tốc độ 2ml/min vòng 1h Bật detector điện hóa (6.12.5) (điện 0mV đến + 50mV; đầu với thang đo từ 10nA đến 20nA) Tiếp tục bơm chất rửa giải HPLC (5.5) thu đường ổn định Bơm tiếp 50 l dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua với nồng độ iođua 250 l/l (5.2.2) thời gian lưu chiều cao pic ổn định; tức chênh lệch tuyệt đối chiều cao pic hai lần bơm không vượt 3% Thời gian lưu iođua nằm khoảng từ phút đến phút; khơng, chỉnh lại thành phần chất rửa giải (xem 5.5) Chỉnh điện điện cực khoảng 0mV đến + 50mV để tối ưu hóa dạng pic chiều cao pic (xem hình 1) Xác định thể tích bơm dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua 250 g/l (5.2.2) cho chiều cao pic khoảng 80% kích thước thực Sử dụng thể tích bơm cho tất dung dịch thử dung dịch tiêu chuẩn Dịch rửa giải HPLC (5.5) bơm lại lần phân tích mẫu có dung dịch tiêu chuẩn bơm Tuy nhiên, không bơm dịch rửa giải bơm dung dịch thử Khi sử dụng thông thường, dịch rửa giải bơm tốc độ 0,2 ml/min để trì tính sẵn sàng hệ thống Trong suốt trình sử dụng khoảng thời gian bị kéo dài, hệ thống HPLC rửa hỗn hợp axetonitril (5.3) nước (5.1) (tỷ lệ 1:1 thể tích) cân lại dịch rửa giải HPLC (5.5) trước dùng tiếp 9.3.2 Đo Bơm bốn dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua (5.2.2) Sau rửa giải iođua chờ phút bơm tiếp Đo chiều cao pic iođua diện tích pic dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua Bơm phần mẫu thử (hai lần thu 9.2) Sau rửa giải iođua chờ phút bơm tiếp Đo chiều cao pic iođua diện tích pic Sau lần đến lần bơm dung dịch thử, bơm lại dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua 150 g/l (5.2.2) Chiều cao pic diện tích pic iođua chênh lệch không 5% so với giá trị thu trước Tùy thuộc vào điều kiện làm sạch, chất lượng dung môi HPLC điện cực mà quan sát thấy pic iođua sắc phổ nằm đường theo hướng dốc xuống Máy tích phân phải chỉnh cho phần âm pic (dưới đường nền) không nằm phép đo chiều cao pic diện tích pic 9.4 Chuẩn bị đường chuẩn Thực phép phân tích bình phương tối thiểu tuyến tính mối tương quan nồng độ tín hiệu thu (chiều cao pic diện tích pic) bốn dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua Khơng tính điểm zero (0,0) phép tính Hệ số tương quan phải 0,99 10 Tính biểu thị kết 10.1 Tính tốn Hàm lượng iođua tính theo cơng thức: wI = x 0,1 Trong wI giá trị số học hàm lượng iođua mẫu thử, tính microgram gam; wt giá trị số học hàm lượng iođua dung dịch thử tính từ đường hồi qui đọc từ đường chuẩn, tính microgram lít; m giá trị số học khối lượng phần mẫu thử, tính gam 10.2 Biểu thị kết 10.2.1 Sữa Biểu thị kết thử nghiệm đến ba chữ số thập phân hàm lượng iođua nhỏ 0,1 g/g, đến hai chữ số thập phân với hàm lượng iođua từ 0,1 g/g đến g/g 10.2.2 Sữa bột Biểu thị kết thử nghiệm đến hai chữ số thập phân hàm lượng iođua nhỏ g/g, đến chữ số thập phân hàm lượng iođua từ g/g đến 10 g/g 11 Độ chụm 11.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị lặp lại tái lập thu từ kết phép thử liên phòng thử nghiệm theo ISO 57255) Các kết nêu tài liệu tham khảo [5] 11.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn, riêng rẽ thu sử dụng phương pháp, tiến hành vật liệu thử giống hệt phòng thử nghiệm, người thực sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, lớn 25% trung bình cộng hai kết không vượt 5% trường hợp 5) ISO 5725: 1986 (hiện hũy bỏ), dùng để thu lấy liệu độ chụm 10.1 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử nghiệm đơn, riêng rẽ, thu sử dụng phương pháp, tiến hành thử vật liệu giống phòng thử nghiệm khác nhau, nhà phân tích khác sử dụng thiết bị khác nhau, lớn 30% trung bình cộng hai kết không vượt 5% trường hợp 12 Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải được: - thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; - phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; - phương pháp thử dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết - kết thu được, kiểm tra độ lặp lại, nêu kết cuối thu a) Chuẩn iođua (102 g/l) b) Sữa bột gầy (2,3 g/l) Từ khóa Bơm Iođua Chú thích – Sắc phổ LC đặc thù dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua mẫu sữa bột phân tích cột PARTISHERE C-18 m, đường kính 4,7 mm, chiều dài 110mm Hình 1- Sắc ký đồ đặc thù dung dịch iođua Thư mục tài liệu tham khảo [1] TCVN 6400: 1998 (ISO 707) Sữa sản phẩm sữa – Hướng dẫn lấy mẫu [2] ISO 5725: 1986, Precision of test methods – Determination of repeatability and reproducibility for a standard test method by inter-laboratory tests [3] TCVN 6910-1: 2001 (ISO 5725-1:1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 1: Nguyên tắc định nghĩa [4] TCVN 6910-2: 2001 (ISO 5725-2:1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lập phương pháp đo tiêu chuẩn [5] SERTL D VÀ MALONE WW.J.AOAC Int., 76, 1993, phương pháp 711-719 [6] AOAC International, Offcial methods of analysis, 16 th edition, 1995, phương pháp số 922.22 ... tiêu chuẩn này; - tất chi tiết thao tác không qui định tiêu chuẩn này, tùy ý lựa chọn với chi tiết bất thường khác ảnh hưởng tới kết - kết thu được, kiểm tra độ lặp lại, nêu kết cuối thu a) Chuẩn. .. dùng tiếp 9.3.2 Đo Bơm bốn dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua (5.2.2) Sau rửa giải iođua chờ phút bơm tiếp Đo chiều cao pic iođua diện tích pic dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua Bơm phần mẫu... diện tích pic 9.4 Chuẩn bị đường chuẩn Thực phép phân tích bình phương tối thiểu tuyến tính mối tương quan nồng độ tín hiệu thu (chiều cao pic diện tích pic) bốn dung dịch tiêu chuẩn làm việc iođua