Tiêu chuẩn Quốc gia TCVN 7851:2008 - ISO 22160:2007 trình bày về sữa và đồ uống từ sữa - xác định hoạt độ phosphataza kiềm - phương pháp dùng hệ thống quang hoạt bằng enzym (EPAS). Mời các bạn cùng tham khảo.
TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 7851 : 2008 ISO 22160 : 2007 SỮA VÀ ĐỒ UỐNG TỪ SỮA - XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PHOSPHATAZA KIỀM - PHƯƠNG PHÁP DÙNG HỆ THỐNG QUANG HOẠT BẰNG ENZYM (EPAS) Milk and milk-based drinks - Determination of alkaline phosphatase activity Enzymatic photoactivated system (EPAS) method Lời nói đầu TCVN 7851:2008 hồn tồn tương đương với ISO 22160:2007; TCVN 7851:2008 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố SỮA VÀ ĐỒ UỐNG TỪ SỮA - XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PHOSPHATAZA KIỀM - PHƯƠNG PHÁP DÙNG HỆ THỐNG QUANG HOẠT BẰNG ENZYM (EPAS) Milk and milk-based drinks - Determination of alkaline phosphatase activity Enzymatic photo-activated system (EPAS) method Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn qui định phương pháp xác định hoạt độ phosphataza kiểm sữa nguyên chất, sữa tách phần chất béo, sữa gầy, cream sữa có bổ sung hương liệu trùng phương pháp phát quang hóa học (EPAS) Phương pháp thích hợp cho mẫu dạng lỏng pha lỗng để có hoạt độ phosphataza kiềm pha lỗng nhỏ 7000 mili đơn vị lít CHÚ THÍCH Đã có thử nghiệm cộng tác thành cơng sữa bò, sữa cừu, sữa trâu sữa dê nguyên chất, sữa bò tách chất béo (< 0,5% chất béo), 20% cream béo % sữa socola béo (tính theo khối lượng) Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn áp dụng thuật ngữ định nghĩa sau đây: 2.1 Hoạt độ phosphataza kiềm (alkaline phosphatase activity) Hoạt độ APL (APL) Hoạt độ phosphataza kiềm có mặt sản phẩm, xác định quy trình quy định tiêu chuẩn CHÚ THÍCH Hoạt độ phosphataza kiềm biểu thị mili đơn vị hoạt độ enzym lít (mU/I) [4],[5] 2.2 Đơn vị hoạt độ phosphataza kiềm (unit of alkaline phosphatase activity) Lượng enzym phosphataza kiềm xúc tác để biến đổi mol chất thơm bền vững phút Nguyên tắc Hoạt độ phosphataza kiềm mẫu đo cách quang hoạt sản phẩm thủy phân dùng dụng cụ đo quang hoạt Khi có mặt phosphataza kiềm, chất dioxetan - phosphat thơm bền vững bị thủy phân nhiệt độ 35oC 1oC tạo thành sản phẩm quang hoạt (phát quang hóa học) Sự quang hoạt sản phẩm khuếch đại thành phần tăng cường phân tử lớn Phản ứng thủy phân bị dừng sau thời gian ủ quy định (3 min) Lượng sản phẩm phát quang hóa học tạo thành đo chuyển đổi theo đơn vị enzym máy đo độ sáng Hiệu chuẩn máy đo độ sáng dựa vào việc hiệu chuẩn sử dụng bảng có hoạt độ enzym biết Thuốc thử Tất thuốc thử sử dụng phải thuộc loại tinh khiết phân tích nước phải nước cất nước loại khống nước có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác 4.1 Cơ chất este dioxetan khơng phát quang hóa học [0,2 mol/l muối dinatri 3-(2'spiroadamantanan)-4-methoxy-4(3"phosphat phenyl-1,2 dioxetan) dung dịch đệm DEAE 1% fluorosin], có bán sẵn thị trường [ví dụ: dung dịch thuốc thử Charm AP 1)] Nên bảo quản chất nhiệt độ từ 0oC đến 7oC Nếu bảo quản lọ chất dẻo màu hổ phách nhiệt độ 4oC chất bền tháng Nếu bảo quản nhiệt độ 30oC bền 24h Khi sử dụng chất phép phân tích, giữ nhiệt độ từ oC đến 7oC để đá lạnh 4.2 Dung dịch hãm Chuẩn bị dung dịch hãm cách trộn lượng tương tự 0,15 mol/l 2-amino-2-metyl-1propanol dung dịch 0,02 % benzalkoni clorua, pH 10,7 Dùng dịch hãm phải bảo quản nhiệt độ phòng (từ 18oC đến 24oC) trước sử dụng Để ổn định phép thử không sử dụng đầu dò nhiệt, ghi lại trì nhiệt độ khoảng 0,5 oC nhiệt độ dung dịch dùng để hiệu chuẩn CHÚ THÍCH Dung dịch hãm sử dụng để dừng thủy phân chất este dioxetan (4.1) enzym Dung dịch hãm có bán sẵn thị trường có hạn sử dụng năm bảo quản oC, tháng bảo quản nhiệt độ phòng Để sử dụng hàng ngày, nên bảo quản dung dịch nhiệt độ phòng 4.3 Mẫu hiệu chuẩn làm việc, ví dụ, viên hiệu chuẩn (sữa bột nguyên liệu có hàm lượng phosphataza biết dạng viên để hoàn nguyên sữa) có hoạt độ phosphataza 875 U/I 26 U/I Hòa viên ba thể tích khác đồ uống từ sữa cho thấy khơng có hoạt độ phosphataza mẫu âm tính (7.2) để dựng đường chuẩn Các viên hiệu chuẩn có bán sẵn thị trường bảo quản oC bền năm 4.3.1 Mẫu hiệu chuẩn sữa trắng dạng lỏng Hòa tan vào ba ống nghiệm 50 ml (5.9), ống chứa 100 l nước cất, đánh dấu tương ứng A1, B1 C1 ống viên hiệu chuẩn Thêm sản phẩm sữa trắng dạng lỏng (cho thấy khơng có hoạt độ phosphataza) vào ống tương ứng: A1 20 ml, B1 ml C1 2,5 ml mẫu thử âm tính (7.2), tạo dung dịch hiệu chuẩn A1, B1 C1 có hoạt độ phosphataza tương ứng: A1=44 mU/I, B1=175 mU/I C1=350 mU/I Đậy nắp ống nghiệm lắc mạnh ống nghiệm Để lượng chứa ống nghiệm hoàn nguyên điều kiện lạnh 10 Trộn kỹ trước sử dụng 4.3.2 Mẫu hiệu chuẩn sữa có bổ sung hương liệu cream 1) Các thuốc thử quy định điều dụng cụ quy định 5.1 có sẵn từ Charm Sciences Inc., 659 Andover St., Lawrence, MA 01843, USA Đây ví dụ sản phẩm thương mại phù hợp có sẵn Thơng tin đưa để tiện lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn ISO không ấn định phải sử dụng sản phẩm Có thể sử dụng sản phẩm tương đương cho kết tương tự Hòa tan vào ba ống nghiệm 50 ml (5.9), ống chứa 100 l nước cất, đánh dấu tương ứng A2, B2 C2 ống viên hiệu chuẩn Thêm sản phẩm sữa trắng có bổ sung hương liệu cream (cho thấy khơng có hoạt độ phosphataza) tương ứng vào ống A2 10 ml, B2 ml C2 2,5 ml mẫu thử âm tính (7.2), tạo dung dịch hiệu chuẩn A2, B2 C2 có hoạt độ phosphataza tương ứng là: A1 = 88 mU/I, B1 = 175 mU/I C1 = 350 mU/I Đậy nắp lắc mạnh ống nghiệm Để lượng chứa ống nghiệm hoàn nguyên điều kiện lạnh 10 Trộn kỹ trước sử dụng 4.4 Mẫu kiểm chứng dương tính Sử dụng phosphataza kiềm đơng khô đựng chai màu hổ phách 15 ml làm mẫu kiểm chứng dương tính Hồn ngun mẫu kiểm chứng dương tính 10 ml đồ uống từ mẫu sữa đại diện cho thấy khơng có hoạt độ phosphataza, mẫu thử âm tính chuẩn bị (7.2) Mẫu kiểm chứng dương tính hồn ngun chứa 450 mU/I enzym phosphataza Để mẫu kiểm chứng dương tính hồn ngun 10 Lắc mạnh mẫu kiểm chứng dương tính trước sử dụng Mẫu kiểm chứng dương tính hồn ngun ổn định 48 h bảo quản nhiệt độ từ 0oC đến 7oC Mẫu kiểm chứng dương tính hồn ngun mẫu sữa dạng lỏng ổn định tháng bảo quản nhiệt độ thấp -15 oC Làm tan băng mẫu kiểm chứng dương tính nước nhiệt độ phòng Lắc mạnh để đồng hóa mẫu kiểm chứng dương tính trước sử dụng Không làm đông lạnh lại Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thơng thường cụ thể sau: 5.1 Máy đo độ sáng, làm việc bước sóng 540 nm, có đường chuyển đổi sang hoạt độ enzym phần mềm [ví dụ, Charm Luminometer kiểu NovaLum, Luminator K T1)] Đối với kiểu NovaLum Lum-T cần có độ chuyển đổi Kiểu NovaLum Lum-T sử dụng tư thẳng đứng Đối với kiểu NovaLum cần có đầu dò nhiệt để đo nhiệt độ dung dịch hãm (4.2) Cần tối ưu hóa phép đo theo dẫn nhà sản xuất thiết bị 5.2 Lọ nhỏ, sử dụng lần, chất dẻo khơng phát quang, có nắp, dung tích ml 5.3 Pipet cố định thể tích, dung tích 100 l 5.4 Dụng cụ phân phối cố định thể tích, phân phối 1,0 ml Trước sử dụng, kiểm tra thể tích nước phân phối xác đến 1,00 g 0,05 g 5.5 Bình định mức vạch, dung tích 100 ml 5.6 Cân phân tích, cân xác đến mg 5.7 Tủ ấm tủ sấy, có khả trì nhiệt độ 35 oC kích thước nhỏ 5.8 Nồi cách thủy, có khả trì nhiệt độ 63oC 1oC 63oC 0,2 oC 95oC 0,2 oC có lọ với 2oC 5.9 Ống nghiệm, dung tích 50 ml, đường kính 13 mm dài 100 mm có nắp đậy khơng thấm nước 5.10 Máy in, có giây nối đầu để in kết Lấy mẫu Điều quan trọng mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện không bị thay đổi suy giảm chất lượng trình bảo quản vận chuyển Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nên lấy mẫu theo TCVN 6400 (ISO 707) Chuẩn bị 7.1 Mẫu thử 7.1.1 Yêu cầu chung Trộn kỹ tất mẫu thử trước sử dụng Nhiệt độ phòng phải khoảng từ 18 oC đến 24oC Các mẫu phải thử nghiệm nhiệt độ lạnh (từ đến 7) oC thực đá lạnh 7.1.2 Mẫu trùng Sử dụng mẫu thử trùng với lượng cần thiết 7.1.3 Mẫu trùng Sử dụng mẫu thử trùng với lượng cần thiết 7.1.3 Sữa nguyên liệu Dùng pipet lấy ml (hoặc lượng thích hợp để sau pha lỗng có hoạt độ nhỏ 7000 mU/I mẫu thử cho vào bình định mức vạch 100 ml (5.5) Pha lỗng đến vạch sữa khơng có phosphataza kiềm (7.2) Trộn kỹ 7.1.4 Sản phẩm sữa có bổ sung hương liệu sản phẩm cream Sử dụng mẫu thử với lượng cần thiết Các mẫu thử sản phẩm đặc sánh cần phải dùng đến pipet để xác định xác khối lượng (100 l = 100 mg) Lau khô tip pipet sau hút mẫu Có thể phải điều chỉnh tip pipet (cắt lỗ rộng hơn) để lấy lượng xác 7.2 Sữa không chứa phosphataza kiềm Chuẩn bị sữa khơng có phosphataza kiềm (mẫu âm tính cách đun nóng 35 ml thể tích cần thiết phần mẫu thử (7.1.2, 7.1.3 7.1.4) ống nghiệm nồi cách thủy (5.8) 95oC Để phần mẫu thử đạt đến 95oC giữ nhiệt độ Sau làm nguội nhanh Dùng mẫu thử âm tính làm mẫu chuẩn (zero) phải có giá trị trung bình nhỏ mU/I (hoặc nhỏ 15 mU/I với sản phẩm sữa có bổ sung hương liệu sản phẩm cream) kênh máy chiếu sáng đạt hiệu chuẩn thích hợp Nếu mẫu âm tính bảo quản 4oC bền 48 h Sữa trắng dạng lỏng bảo quản nhiệt độ đơng lạnh thấp -15 oC bền đến tháng Làm tan băng mẫu âm tính nước nhiệt độ phòng Lắc mạnh mẫu để đồng hóa trước sử dụng Khơng làm đơng lạnh lại Cần lưu ý số sản phẩm sữa ví dụ sữa cừu, chuẩn bị mẫu thử âm tính tạo kết tủa tách lớp 95oC Trong trường hợp này, cần đến nhiệt độ thấp thời gian dài hơn, ví dụ 63oC 30 Cách tiến hành (Xem Phụ lục A) 8.1 Hiệu chuẩn 8.1.1 Dựng đường chuẩn cho sản phẩm cần thử nghiệm Bắt đầu cách cài đặt (B g) máy đo độ sáng đến 100 chỉnh (Cr) đến 100 Chỉnh theo dẫn sổ tay máy đo độ sáng Các đường chuẩn phải ổn định cần cho chạy sử dụng lô mẻ mới/các lô chất este dioxetan (4.1) dung dịch đệm hãm (4.2) Sơ đồ đường hiệu chuẩn nêu Phụ lục A CHÚ THÍCH Phương thức hiệu chuẩn số máy đo độ sáng tự động hướng dẫn người sử dụng qua bước 8.1.1 đến 8.2.2 (Bảng chọn hiệu chuẩn số bảng chính) Chọn hiệu chuẩn phosphataza kiềm Chọn kênh hiệu chuẩn Chọn hiệu chuẩn Chọn phần mẫu thử để hiệu chuẩn, ví dụ sữa, cream socola (sản phẩm sữa bổ sung hương liệu) loại khác Máy đo độ sáng dẫn bước 8.1.2 Giới hạn ba ống cho phép thử hiệu chuẩn Dùng pipet cố định thể tích (5.3), có típ pipet sạch, để lấy 100 l chất este dioxetan (4.1) cho vào đáy ba lọ nhỏ (5.2) 8.1.3 Đối với phần mẫu thử thu 7.1.2 đến 7.1.4, dùng pipet cố định thể tích (5.3) có tip pipet sạch, để lấy 100 l mẫu âm tính (7.2) cho vào lọ Chuyển lượng mẫu sang đáy ống cho tất mẫu tiếp xúc với chất Trộn lượng chứa lọ để giá đỡ có chuyển động tiến lùi khoảng 10 lần s 8.1.4 Đặt lọ nhỏ (8.1.3) tủ ấm (5.7) 35 oC Sau ủ xong, dùng phận phân phối cố định thể tích (5.4) thêm 1,0 ml dung dịch hãm (4.2) vào tất lọ nhỏ, vòng 15 s 8.1.5 Lấy lọ nhỏ khỏi tủ ấm Đậy nắp lọ lắc mạnh lọ s Nếu cần, nới lỏng nắp gắn lọ vào chuyển đổi máy đo độ sáng Chèn lọ vào máy đo độ sáng Đọc ghi lại số đọc máy đo độ sáng (5.1) hoàn thành việc đếm (có tiếng bíp) Lặp lại thao tác với lọ Không để dung dịch lỏng chạm vào chuyển đổi để tránh nhiễm bẩn lọ sau Nếu dung dịch chạm vào lọ tráng nước sấy khơ trước sử dụng lại Tính giá trị âm trung bình (N) Lặp lại phép xác định theo 8.1.2 đến 8.1.5 có giá trị sai lệch 30% giá trị trung bình 8.1.6 Đối với phần mẫu thử thu 7.1.2 đến 7.1.3, lặp lại bước 8.1.2 đến 8.1.5 với dung dịch hiệu chuẩn C1 (4.3.1), mẫu lặp lại ba lần Đối với phần mẫu thử 7.1.4, lặp lại bước 8.1.2 đến 8.1.5 với dung dịch hiệu chuẩn C 2(4.3.2), mẫu lặp lại ba lần Tính giá trị trung bình (Cx) C1 C2 lặp lại phép xác định có giá trị sai lệch 30% giá trị trung bình 8.1.7 Tính giá trị hiệu chỉnh, Cr, sử dụng giá trị hiệu chuẩn trung bình Cx (xem 8.1.6) giá trị âm tính trung bình, N (xem 8.1.5) Công thức (1) Nhập Cr máy đo độ sáng Thay đổi hiệu chỉnh máy đo độ sáng sang giá trị hiệu chỉnh C r theo dẫn sổ tay máy đo độ sáng Cr = (Cx - N) x 0,286 (1) CHÚ THÍCH Các máy đo độ sáng tự động in giá trị N Cx tự động tính, điều chỉnh in giá trị Cr Bg 8.1.8 Tính giá trị sử dụng giá trị Cr giá trị âm tính trung bình N Cơng thức (2) nhập giá trị Bg vào máy đo độ sáng Thay đổi máy đo độ sáng sang giá trị B g theo dẫn sổ tay máy đo độ sáng: Bg = [ N/(Cr/100)] + 100 (2) CHÚ THÍCH Các máy đo độ sáng tự động in giá trị N C x tự động tính điều chỉnh in giá trị Cr Bg 8.1.9 Lặp lại bước 8.1.2 đến 8.1.5 với mẫu âm tính (7.2), lặp lại ba lần Kiểm tra giá trị trung bình với sữa (tính theo mU/I) nhỏ mU/I, sữa có bổ sung hương liệu cream nhỏ 15 mU/I Nếu giá trị trung bình nằm ngồi dải bắt đầu bước 8.1.1 8.1.10 Lặp lại bước 8.1.6 với hiệu chuẩn C1 C2 Dải mục tiêu số đọc trung bình từ 320 mU/I đến 400 mU/I C (C1 C2) Lặp lại phép xác định có giá trị sai lệch 30% giá trị trung bình Nếu giá trị trung bình nằm ngồi dải bắt đầu bước 8.1.1 8.1.11 Tiến hành phân tích hiệu chuẩn (8.1.2 đến 8.1.5) 8.1.3 thay mẫu âm tính mẫu hiệu chuẩn làm việc A (A1 A2 tùy thuộc vào phần mẫu thử 4.3) Xác định giá trị trung bình A1 A2 Lặp lại phép xác định có giá trị sai lệch 40% giá trị trung bình 8.1.12 Tiến hành phân tích hiệu chuẩn (8.1.6) 8.1.6 thay mẫu hiệu chuẩn C mẫu chuẩn làm việc B (B1 B2) tùy thuộc vào phần mẫu thử 4.3 Xác định giá trị trung bình B Lặp lại phép xác định có giá trị sai lệch 30% giá trị trung bình 8.1.13 Các giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn làm việc A phải khoảng từ 32 mU/I đến 55 mU/I mẫu hiệu chuẩn làm việc A2 phải khoảng từ 45 mU/I đến 110 mU/I Giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn làm việc B (B B2) phải khoảng từ 145 mU/I đến 205 mU/I Khi hai mẫu hiệu chuẩn nằm dải quy định, tiến hành theo 8.3 Nếu mẫu hiệu chuẩn nằm dải quy định tiến hành theo 8.2.1 8.2.2 8.2 Điều chỉnh hiệu chuẩn 8.2.1 Điều chỉnh hiệu chuẩn mẫu hiệu chuẩn A B CHÚ THÍCH Việc hiệu chuẩn tự động tự tính tốn điều chỉnh hướng dẫn thử nghiệm lại (8.2.2) 8.2.1.1 Trong trường hợp giá trị trung bình trung bình giá trị mẫu hiệu chuẩn A1, A2 B cao thấp dải quy định (trong khoảng 10 mU/I), điều tăng giảm để đưa giá trị trung bình dải quy định mà khơng làm cho giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn khác lệch khỏi dải quy định (nghĩa tăng làm giảm giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn, giảm làm tăng giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn) Trong trường hợp này, thay đổi máy đo độ sáng theo công thức sau đây: a) Sử dụng Công thức (3) mẫu hiệu chuẩn A nằm ngồi dải: 32 (A1m - NA1) 55 (3) NA1 giá trị điều chỉnh để đưa giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A dải quy định; A1m giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A1 (tính 8.1.11); 32 giá trị giới hạn mẫu hiệu chuẩn A1; 55 giá trị giới hạn mẫu hiệu chuẩn A1 b) Sử dụng Công thức (4) mẫu hiệu chuẩn A nằm dải: 45 (A2m - NA2) 110 (4) NA2 giá trị điều chỉnh để đưa giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A dải quy định; A2m giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A2 (tính 8.1.11); 45 giá trị giới hạn mẫu hiệu chuẩn A2; 110 giá trị giới hạn mẫu hiệu chuẩn A c) Sử dụng công thức (5) mẫu hiệu B1 B2 nằm dải: 145 (Bm - NB) 205 (5) NB giá trị điều chỉnh để đưa giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn B B2 dải quy định; Bm giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn B1 B2 (tính 8.1.12); 145 giá trị giới hạn mẫu hiệu chuẩn B B2; 205 giá trị giới hạn mẫu hiệu chuẩn B B2 Sau xác định NAB từ công thức (3), (4) (5), kiểm tra xem mẫu hiệu chuẩn khác, X, [mẫu hiệu chuẩn B1 B2 sử dụng Công thức (3) (4), mẫu hiệu chuẩn A A2 sử dụng Công thức (5)] nằm dải quy định chưa, sử dụng Công thức (6) (7): Rx1 Xpro Rx2 (6) Xpro = Xm - NAB (7) Rx1 giới hạn trung bình mẫu hiệu chuẩn khác X; Rx2 giới hạn trung bình mẫu hiệu chuẩn khác X; Xpro trung bình dự đốn mẫu hiệu chuẩn X sau điều chỉnh N AB; Xm giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn khác X (tính 8.1.11 8.1.12); NAB giá trị điều chỉnh mẫu hiệu chuẩn A1, A2, B1, B2 (tính Cơng thức (3), (4) (5) Nếu mẫu hiệu chuẩn, X, nằm dải quy định chỉnh giá trị máy đo độ sáng theo giá trị NAB để đưa mẫu hiệu chuẩn vào dải quy định theo Công thức (8): Bg1 = Bg + NAB (8) Bg1 giá trị máy đo độ sáng; Bg giá trị hành máy đo độ sáng 8.2.1.2 Trong trường hợp giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn nằm dải quy định (lớn 10), chia giá trị trung bình thu mẫu hiệu chuẩn có liên quan cho giá trị đích chúng (A1 = 44 mU/I A2 = 88 mU/I; B1 B2 = 175 mU/I) Lấy trung bình hai tỷ số thu mẫu hiệu chuẩn A B để xác định tỷ số trung bình hiệu chỉnh Bảng Bảng - Tỷ số mẫu hiệu chuẩn Mẫu hiệu chuẩn Giá trị đích Giá trị trung bình Tỷ số (trung bình/đích) A1 44 A1m RA1 = A1m/44 A2 88 A2m RA2 = A2m/88 B1 B2 175 B1m B2m RB = B1m B2m/175 Tỷ số trung bình (Rm) Rm = [RA1 RA2) + RB]/2 Nhân tỷ số trung bình thu mẫu hiệu chuẩn A B với hiệu chỉnh máy đo độ sáng sử dụng công thức (9): Cr1 = Cr x Rm (9) Cr1 hiệu chỉnh máy đo độ sáng ; Cr hiệu chỉnh máy đo độ sáng tính (xem 8.1.7); Rm tỷ số trung bình mẫu hiệu chuẩn A B (xem Bảng 1); Thay đổi hiệu chỉnh máy đo độ sáng thu giá trị nó, C r1 8.2.1.3 Trong trường hợp, giá trị trung bình nhỏ đáng kể (nhỏ 10 đơn vị) so với giá trị đích giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn khác lớn đáng kể (lớn 10 đơn vị) so với giá trị đích, xác định chênh lệch giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A (A = 44 mU/I A2 = 88 mU/I) Bổ sung giá trị vào giá trị máy đo độ sáng; giá trị nhỏ giá trị đích chênh lệch số âm kết dẫn đến giảm giá trị a) Tính giá trị Bg2 mẫu hiệu chuẩn A1 sử dụng công thức (10): Bg2 = Bg + (A1m - 44) (10) Bg giá trị máy đo độ sáng tính (xem 8.1.8); Bg2 giá trị máy đo độ sang; A1m giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A1 (xem 8.1.11); 44 giá trị đích mẫu hiệu chuẩn A1 b) Tính giá trị Bg3 mẫu hiệu chuẩn A2 sử dụng công thức (11): Bg3 = Bg + (A2m - 88) (11) Bg giá trị máy đo độ sáng tính (xem 8.1.8); Bg3 giá trị máy đo độ sáng; A2m giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn A2 (xem 8.1.11); 88 giá trị đích mẫu hiệu chuẩn A2 c) Chỉnh cài đặt máy đo độ sáng tính tốn Phân tích lại mẫu hiệu chuẩn B xác định giá trị trung bình [Bm (1 2)] Chia giá trị trung bình thu cho giá trị đích (B B2 = 175 mU/I) Nhân tỷ số với hiệu chỉnh máy đo độ sáng theo công thức (12): Cr2 = Cr x (12) Cr hiệu chỉnh máy đo độ sáng tính (xem 8.1.7); Cr2 hiệu chỉnh máy đo độ sáng mới; Bm (1 2) giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn B1 B2 đo phép xác định lại; 175 giá trị đích mẫu hiệu chuẩn B1 B2 Điều chỉnh máy đo độ sáng giá trị 8.2.2 Lặp lại bước 8.1.11 đến 8.1.13 Các số đọc trung bình máy đo độ sáng phải từ 32 mU/I đến 55 mU/I mẫu hiệu chuẩn làm việc A1, phải dải từ 45 mU/I đến 110 mU/I mẫu hiệu chuẩn A2 Lặp lại phép xác định có giá trị lớn nhỏ 40% giá trị trung bình Giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn làm việc B (B B2) phải dải từ 145 mU/I đến 205 mU/I Lặp lại phép xác định có giá trị sai lệch 30% giá trị trung bình Nếu hai giá trị nằm dải tiến hành 8.3.3 Nếu giá trị trung bình mẫu hiệu chuẩn nằm dải quy định tiến hành 8.1.1 8.3 Phép kiểm chứng kiểm tra hiệu chuẩn 8.3.1 Phép kiểm chứng âm tính Tiến hành kiểm chứng âm tính theo quy trình xác định (8.4) mà khơng bổ sung phần mẫu thử (8.4.2) Phép thử kiểm chứng âm tính để kiểm tra việc hiệu chuẩn máy đo độ sáng thuốc thử Kiểm tra hệ thống (kết âm tính) mức hoạt độ phosphataza kiềm thu nhỏ mU/I kênh máy đo độ sáng hiệu chuẩn thích hợp 8.3.2 Phép kiểm chứng dương tính Hồn ngun mẫu kiểm chứng dương tính (4.4) với mẫu thử kiểm tra trước (đồ uống từ sữa) cho thấy trung bình hoạt độ phosphataza kiềm nhỏ mU/I (nhỏ 15 mU/I sữa có bổ sung hương liệu sản phẩm cream) sữa âm tính chuẩn bị (7.2) Tiến hành phép kiểm chứng dương tính hàng ngày, để kiểm tra hiệu chuẩn máy đo độ sáng thuốc thử Nếu giá trị vượt 585 mU/I nhỏ 300 mU/I lặp lại với mẫu kiểm chứng dương tính hồn ngun khác Nếu giá trị thu lần nằm dải quy định hiệu chuẩn lại máy đo độ sáng (xem 8.1) 8.3.3 Kiểm tra hiệu chuẩn 8.3.3.1 Sau thực bước hiệu chuẩn 8.1 8.2, tiến hành phép thử kiểm chứng âm tính (8.3.1) tiến hành ba phép thử lặp lại với mẫu kiểm chứng dương tính (8.3.2) để kiểm tra xác nhận kết hiệu chuẩn 8.3.3.2 Phép kiểm chứng âm tính phải cho giá trị nhỏ mU/I phép thử kiểm chứng dương tính (N = 3) phải cho giá trị trung bình dải từ 380 mU/I đến 510 mU/I Nếu kết kiểm chứng âm tính nằm ngồi dải sử dụng chất (4.1) lặp lại phép thử Nếu kết kiểm chứng dương tính nằm ngồi dải có giá trị vượt 585 mU/I nhỏ 300 mU/I, kiểm tra nhiệt độ dung dịch hãm (4.2) lặp lại phép thử với mẫu kiễm chứng dương tính hồn ngun khác Nếu giá trị thu lần nằm dải phép thử hiệu chuẩn lại (xem 8.1.1) CHÚ THÍCH Phép xác định lặp lại ba lần mẫu kiểm chứng chương trình dùng để kiểm tra hiệu chuẩn Sau kiểm tra hiệu chuẩn, hàng ngày cần thực phép xác định đơn lẻ dải quy định (xem 8.3) 8.3.3.3 Sau mẫu hiệu chuẩn mẫu kiểm chứng nằm dải quy định, tiến hành phép xác định (8.4) Trong máy đo độ sáng (5.1), cài đặt đến 10 kênh hiệu chuẩn riêng rẽ sản phẩm sữa khác Đọc kết phần mẫu thử nghiệm (7.1.2 7.1.4) kênh tương ứng với phần mẫu thử Mẫu sữa nguyên liệu (7.1.3) đọc kênh hiệu chuẩn cho phần mẫu thử sử dụng làm dịch pha loãng (7.2) 8.4 Xác định 8.4.1 Giới hạn bốn lọ cho phép thử Dùng pipet cố định thể tích (5.3), lấy 100 l chất este dioxetan (4.1) cho vào bốn lọ nhỏ thử nghiệm (5.2), bốn lọ dán nhãn nửa phía lọ 8.4.2 Đối với tất phần mẫu thử (7.1.1 đến 7.1.4), dùng pipet cố định thể tích (5.3), lấy 100 l mẫu thử chuẩn bị cho vào lượng chứa lọ nhỏ (8.4.1), lần sử dụng tip pipet 8.4.3 Trộn lượng chứa lọ giá đỡ lọ cách dịch chuyển tiến lùi 10 lần s Đặt lọ (8.4.2) vào tủ ấm (5.7) 35oC 8.4.4 Chọn kênh đo độ sáng thích hợp hiệu chuẩn cho phần mẫu thử Sau min, dùng phận phân phối cố định thể tích (5.4) thêm 1,0 ml dung dịch hãm (4.2) vòng 15 s 8.4.5 Lấy lọ nhỏ khỏi tủ ấm Đậy nắp lọ Lắc mạnh lọ s Tháo nắp lọ gắn lọ vào chuyển đổi máy đo độ sáng, cần Đặt lọ vào máy đo độ sáng (5.1) Bật máy phân tích độ sáng ghi lại kết sau tiếng bíp Lặp lại việc đếm với lo Đối với phần mẫu thử cho giá trị cao 000 mU/I pha lỗng mẫu lặp lại phép phân tích CHÚ THÍCH Khi kết thúc phản ứng enzym, ánh sáng đầu ổn định nhiệt độ từ 18 oC đến 24oC Số đọc máy đo độ sáng tính theo đơn vị enzym mU/I 8.5 Phép thử kiểm chứng phosphataza vi khuẩn bền nhiệt Nếu quy trình xác định (8.4) cho kết dương tính ( 350 mU/I thường sử dụng để nhận dạng mẫu trùng chưa đúng), tiến hành sau: Cho ml phần mẫu khác (7.1.1 đến 7.1.4) vào lọ nhỏ gia nhiệt tủ ấm (5.7) nồi cách thủy (5.8) 63oC Giữ nhiệt độ 30 min, sau làm nguội nhanh Xác định hoạt độ phosphataza sót lại theo 8.4 Hoạt độ sót lại có mặt phosphataza kiềm vi khuẩn bền nhiệt Nếu việc xác định mẫu thử gia nhiệt cho kết nằm khoảng 30% so với kết gốc tồn hoạt độ phosphataza vi khuẩn Tính biểu thị kết 9.1 Khái quát Các kết tính sử dụng phần mềm máy đo độ sáng (5.1) Việc tính tốn số đọc từ máy đo độ sáng khác thực tay dùng máy tính nhỏ cầm tay Nếu kết cần phải tính tốn tay tiến hành theo 9.2 9.2 Cách tính thủ cơng Ghi lại giá trị RLU (đơn vị ánh sáng tương đối) mẫu hiệu chuẩn làm việc A, B C (4.3) mẫu âm tính (7.2) tính trung bình kết thu (từ 8.1.1 đến 8.1.13) Tính hoạt độ phosphataza kiềm cách sử dụng hồi quy tuyến tính đơn vị ánh sáng tương đối mẫu âm tính mẫu hiệu chuẩn A, B C, hoạt độ phosphataza kiềm đích có liên quan (tính mU/I) (ví dụ: mẫu kiểm chứng âm tính = mU/I, A = 44 mU/I A2 = 88 mU/I, B1 B2 = 175 mU/I, C1 C2 = 350 mU/I) Sử dụng giá trị RLU trung bình làm trục y giá trị đích mU/I làm trục x Tính độ dốc m điểm cắt trục tung y, b, từ trùng khớp tuyến tính theo cơng thức (13) sau: y = mx + b (13) x hoạt độ phosphataza kiềm mẫu, tính mU/I; m giá trị độ dốc đường hồi qui; y giá trị RLU máy đo độ sáng; b giá trị điểm cắt trục tung để thu giá trị x Sử dụng giá trị m b tính được, việc xác định đơn vị enzym phần mẫu thử xác định cách sử dụng giá trị RLU làm giá trị y tính x (mU/I) cơng thức (14) sau: x= (14) 9.3 Biểu thị kết Biểu thị kết đến đơn vị số nguyên gần mili đơn vị lít (mU/I) 10 Độ chụm 10.1 Phép thử liên phòng thử nghiệm Các chi tiết phép thử liên phòng thử nghiệm độ chụm phương pháp đưa Phụ lục B Các giá trị biểu thị mức xác xuất 95% khơng áp dụng cho dải nồng độ chất khác với dải nồng độ chất nêu Giới hạn lặp lại giới hạn tái lặp làm tròn 10.2 10.3 áp dụng mức enzym (trung bình) hoạt độ phosphataza xấp xỉ 50 mU/I 100 mU/I dao động từ 350 mU/I đến 2500 mU/I 10.2 Độ lặp lại Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử độc lập riêng rẽ thu sử dụng phương pháp thử, tiến hành nguyên liệu thử, phòng thử nghiệm, sử dụng thiết bị, khoảng thời gian ngắn, không 5% trường hợp lớn hơn: - mức enzym từ 350 mU/I đến 2500 mU/I 21 % giá trị trung bình; - mức enzym xấp xỉ 100 mU/I 30 mU/I; - mức enzym xấp xỉ 50 mU/I 18 mU/I; - mức enzym từ mẫu âm tính mU/I 10.3 Độ tái lập Chênh lệch tuyệt đối hai kết thử riêng rẽ thu áp dụng phương pháp, tiến hành mẫu thử, thực phòng thử nghiệm khác nhau, kỹ thuật viên khác thực hiện, sử dụng thiết bị khác nhau, không 5% trường hợp lớn hơn: - mức enzym từ 350 mU/I đến 2500 mU/I 41 % giá trị trung bình; - mức enzym xấp xỉ 100 mU/I 50 mU/I; - mức enzym xấp xỉ 50 mU/I 34 mU/I; - mức enzym từ mẫu âm tính 14 mU/I 11 Báo cáo thử nghiệm Báo thử nghiệm phải ghi rõ: a) thông tin cần thiết nhận biết đầy đủ mẫu thử; b) phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; c) phương pháp thử sử dụng, viện dẫn tiêu chuẩn này; d) tất điều kiện thao tác không quy định tiêu chuẩn này, xem tùy ý, với tình bất thường ảnh hưởng đến kết e) kết thử nghiệm thu đáp ứng yêu cầu độ lặp lại ghi kết cuối thu Phụ lục A (tham khảo) Sơ đồ quy trình Phụ lục B (tham khảo) Kết phép thử liên phòng thử nghiệm Các giá trị giới hạn lặp lại giới hạn tái lặp thu từ kết phép thử liên phòng thử nghiệm bao gồm 15 phòng thử nghiệm từ quốc gia (Úc, Canada, Pháp, Ailen, Israel, Niuzilan, Anh Mỹ) tham gia thực theo TCVN 6910-1 (ISO 5725-1) TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) kết thúc vào tháng năm 2005 CHÚ THÍCH Các kết thống trước nghiên cứu sơ nghiên cứu cộng tác năm 2003 2004 đồ uống từ sữa bò mà xuất Tạp chí IDF Nghiên cứu đánh giá sữa nhiều lồi (bò, dê, cừu trâu) sữa gầy (< 0,5 % chất béo), cream 20% socola với 2% sữa (tất tính theo khối lượng) Các kết thu đưa vào phân tích thống kê theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2) đưa liệu độ chụm Bảng B.1 B.2, giá trị trung bình enzym nêu Bảng B.3 Các giá trị độ lệch chuẩn sr sR giá trị âm tính hệ số biến thiên giá trị trung bình mức enzym nghiên cứu, CV(r) CV(R) nêu Bảng B.4 Các giới hạn lặp lại tái lập (xem điều 10) giá trung bình r R chất đa dạng giá trị trung bình r R giá trị tính theo phần trăm Các kết xuất [7] Giới hạn phát phương pháp tính từ trung bình tổng thể cộng với sR 20 mU/I Bảng B.1 - Giá trị lặp lại (r) mức enzym đích thu từ phép thử năm 2005 Sản phẩm từ sữa Mức enzym đích a (mU/I) Âm tính 50 100 350 500 Sữa bò nguyên chất 14,1 16,0 37,8 126,1 95,4 Sữa dê nguyên chất 5,7 13,5 22,8 56,6 68,6 Sữa cừu nguyên chất 0,6 18,0 28,2 81,4 76,3 Sữa trâu nguyên chất 1,5 12,5 21,0 49,1 158,7 Sữa bò gầy 2,9 12,4 14,3 40,8 88,2 20 % cream 5,1 15,8 22,9 43,9 48,8 Có bổ sung hương liệu (socola, % sữa) 9,3 36,0 62,2 60,9 150,6 Giá trị trung bình r 5,6 17,7 29,9 65,5 98,1 a chênh lệch tuyệt đối mẫu giống hệt thử nghiệm phòng thử nghiệm, khoảng thời gian ngắn không 5% trường hợp vượt giá trị nêu Bảng B.2 - Giá trị tái lập (R) mức enzym đích thu từ phép thử năm 2005 Sản phẩm từ sữa Mức enzym đích a (mU/I) Âm tính 50 100 350 500 Sữa bò nguyên chất 40,8 40,3 45,9 156,6 194,7 Sữa dê nguyên chất 19,0 26,1 53,1 138,6 171,9 Sữa cừu nguyên chất 6,8 51,3 61,2 194,2 225,0 Sữa trâu nguyên chất 3,5 20,5 30,0 100,7 217,6 Sữa bò gầy 3,0 22,4 38,6 81,0 127,8 20 % cream 13,3 26,6 38,0 112,5 179,4 Có bổ sung hương liệu (socola, % sữa) 10,5 51,2 84,5 131,5 244,3 Giá trị R trung bình 13,8 34,1 50,2 130,7 194,4 a chênh lệch tuyệt đối mẫu giống hệt thử nghiệm phòng thử nghiệm khác nhau, khoảng thời gian ngắn không 5% trường hợp vượt giá trị nêu Bảng B.3 - Giá trị trung bình enzym (mU/I) mức nghiên cứu chất Sản phẩm từ sữa Mức enzym đích (mU/I) Âm tính 50 100 350 500 Sữa bò nguyên chất 17 58 110 325 451 Sữa dê nguyên chất 39 92 340 486 Sữa cừu nguyên chất 43 80 335 475 Sữa trâu nguyên chất 48 90 330 529 Sữa bò gầy 53 100 288 371 20 % cream 61 111 337 475 Có bổ sung hương liệu (socola, % sữa) 53 117 307 412 Giá trị trung bình 4,7 50,7 100,0 323,2 456,8 Bảng B.4 - Hệ số biến thiên giá trị enzym trung bình, CV (r) CV (R) (ngoại trừ mẫu âm tính) Mức enzym đích (mU/I) Sản phẩm từ sữa Âm tính 50 100 350 500 Sr SR CV(r) CV(R) CV(r) CV(R) CV(r) CV(R) CV(r) CV(R) (mU/I) (mU/I) % % % % % % % % Sữa bò nguyên chất 5,1 14,6 9,8 24,8 12,3 14,9 13,8 17,2 7,6 15,4 Sữa dê nguyên chất 2,0 6,8 12,4 24,1 8,8 20,6 5,9 14,6 5,0 12,6 Sữa cừu nguyên chất 0,2 2,4 15,0 42,7 12,5 27,2 8,7 20,7 5,7 16,9 Sữa trâu nguyên chất 0,5 1,2 9,2 15,1 8,3 11,9 5,3 10,9 10,7 14,7 Sữa bò gầy 1,0 1,1 8,2 15,3 5,1 13,8 5,1 10,0 8,5 12,3 20 % cream 1,8 4,8 9,2 15,5 7,4 12,2 4,7 11,9 3,7 13,5 Có bổ sung hương liệu (socola, % sữa) 3,3 3,7 24,2 34,5 19,0 25,9 7,1 15,3 13,1 21,2 Giá trị R trung bình 2,0 4,9 12,6 24,6 10,5 18,1 7,2 14,4 7,8 15,2 THƯ MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 6910-1 : 2001 (ISO 5725-1:1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần : Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 6910-2 : 2001 (ISO 5725-2 : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lặp phương pháp đo tiêu chuẩn [4] TCVN 6506 : 2007 (ISO 11816-1 : 2006) Sữa sản phẩm sữa - Xác định hoạt độ phosphataza kiềm - Phần - Phương pháp Đo huỳnh quang sữa đồ uống từ sữa [5] ISO 11816-2 : 2003, Milk and milk products - Determination of alkaline phosphataza activity Part 2: Fluorometric method for cheese [6] International Union of Blochemistry Nomenclature J Am Med Assoc., 260, 1988, p.73 [7] J.AOAC International, 89, 2006, p 1061 ... nghiệm bao gồm 15 phòng thử nghiệm từ quốc gia (Úc, Canada, Pháp, Ailen, Israel, Niuzilan, Anh Mỹ) tham gia thực theo TCVN 691 0-1 (ISO 572 5-1 ) TCVN 691 0-2 (ISO 572 5-2 ) kết thúc vào tháng năm 2005 CHÚ... TCVN 6400 (ISO 707), Sữa sản phẩm sữa - Hướng dẫn lấy mẫu [2] TCVN 691 0-1 : 2001 (ISO 572 5-1 :1994), Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần : Nguyên tắc định nghĩa chung [3] TCVN 691 0-2 ... 691 0-2 : 2001 (ISO 572 5-2 : 1994) Độ xác (độ độ chụm) phương pháp đo kết đo Phần 2: Phương pháp xác định độ lặp lại độ tái lặp phương pháp đo tiêu chuẩn [4] TCVN 6506 : 2007 (ISO 1181 6-1 : 2006)