Tổng quan: Các hệ thống vector adenovirus trong nghiên cứu liệu pháp gen

Bài viết này thảo luận về những ưu điểm và hạn chế của vector adenovirus để phát triển các hệ vector ưu việt hơn cho những nghiên cứu về gen trị liệu trong tương lai. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 TỔNG QUAN: CÁC HỆ THỐNG VECTOR ADENOVIRUS TRONG NGHIÊN CỨU LIỆU PHÁP GEN Hoàng Quốc Trường*; Hồ Anh Sơn** Dương Thuận Thiên***; Nguyễn Lĩnh Tồn** TĨM TẮT Adenovirus vector sử dụng rộng rãi nghiên cứu liệu pháp gen, vắc xin virut tái tổ hợp nghiên cứu Adenovirus vector sử dụng để chuyển trở gen trị liệu vào tế bào (TB) bệnh để phục hồi chức bị số gen, tăng cường hệ thống miễn dịch vật chủ, làm tăng tính nhạy cảm TB ung thư với thuốc hóa trị liệu Một số hệ thống vector adenovirus nghiên cứu phát triển, bao gồm: hệ vector vector xóa bỏ gen E1a E1b, hệ vector thứ hai vector xóa bỏ vùng gen E1 gen khác virut, helper-dependent adenovirus vector thiết kế xóa bỏ tất trình tự mang mã hóa cho protein virut Thế hệ vector thứ thứ hai thiết kế sản xuất tương đối dễ dàng Thế hệ vector thứ ba ưu việt so với hệ thống adenovirus khác hiệu suất biểu thời gian biểu lâu dài gen chuyển đạt nghiên cứu in vivo Bài tổng quan thảo luận ưu điểm hạn chế vector adenovirus để phát triển hệ vector ưu việt cho nghiên cứu gen trị liệu tương lai * Từ khóa: Adenovirus; Liệu pháp gen; Vector REVIEW: ADENOVIRAL VECTOR SYSTEMS FOR GENE THERAPY summary Adenoviral (Ad) vectors are widely used in gene therapies, recombinant viral vaccine, and basic science studies The vectors can deliver therapeutic genes into cells to recover lost function of some genes, to enhance the ability of host immune systems, or to increase the sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic drugs Several adenoviral vector systems have been developed: first-generation vectors are those with deletion of the E1a and E1b genes, second-generation vectors with deletions of the E1 and another viral gene, and helperdependent adenovirus vectors removed all coding sequences for viral proteins The first- and second-generation vectors are relatively easy to construct and produce The helper-dependent adenovirus vectors are substantially superior to any other adenoviral systems for achieving high-level and longterm expression in vivo This review focuses on the advantages and limitations of adenovirus vectors and discusses potential strategies for further improvement of vectors for gene therapy * Key words: Adenovirus; Gene therapies; Vectors * Bệnh viện TWQ§ 108 ** Học viện Quân y *** Bệnh viện Quân y 103 Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Quốc Trường (hqtruong2002@yahoo.com) Ngày nhận bài: 16/01/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 04/04/2014 Ngày báo đăng: 07/04/2014 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 ®Ỉt vÊn ®Ị Adenovirus Rowe CS phát từ 1/2 kỷ trước qua thí nghiệm ni cấy virut phân lập từ vùng vòm họng [1] Mặc dù adenovirus gây bệnh đường hô hấp, mắt đường tiêu hóa, virut tập trung nghiên cứu nhiều năm mơ hình để tìm hiểu chế sinh học TB có nhân bậc cao, bao gồm: q trình phiên mã, xử lý ARN, khuếch đại ADN, dịch mã chế bệnh sinh ung thư Adenovirus thuộc họ adenoviridae với 51 kiểu huyết thanh, chia thành sáu nhóm (từ A - F) dựa trình tự tương đồng khả ngưng kết TB hồng cầu người [2] Hệ gen adenovirus chuỗi đơi có kích thước 36 Kb Ở hai đầu tận hệ gen hai trình tự lặp tận đảo ngược (ITR - inverted terminal repeat) với kích thước từ 100 - 400 bp, liên kết với protein kết thúc (TP - terminal protein) liên kết hóa trị Về hình thái, adenovirus có vỏ protein cấu trúc bao bọc hệ gen virut với cấu trúc hình khối 20 mặt Trên cấu trúc tiếp giáp hai mặt vỏ có cấu trúc penton base giữ vai trò neo giữ protein sợi (fibre protein) làm cho virut bám dính với bề mặt TB Mỗi mặt vỏ virut bao gồm 03 protein hexon protein pIIIa, pVI, pVIII pIX (hình 1) Protein VII, có trình tự peptide nhỏ gọi mu [3], liên kết chặt chẽ với ADN virut, protein V đóng gói với phức hợp ADN-protein cung cấp liên kết cấu trúc với vỏ qua protein VI [4] Các thành viên họ adenovirus có khả lây nhiễm TB sau phân bào, chí mơ biệt hóa cao vân, phổi, não tim Với khả vận chuyển hệ gen tới nhân hiệu khuếch đại cao, adenovirus ứng viên số để biểu chuyên chở gen trị liệu đến TB đích với phạm vi rộng Hình 1: Cấu trúc adenovirus: A) Cấu trúc mô adenovirus dựa hiểu biết thành phần polypeptide ADN B) Ảnh chụp kính hiển vi điện tử adenovirus [3] Chu kú nhân lên adenovirus Bỏm v xõm nhp vo bên TB Trong tất nhóm, loại trừ adenovirus nhóm B, hạt virut ban đầu bám vào bề mặt TB thông qua liên kết sợi Knob với thụ thể bề mặt TB tương thích cho coxsackie B virut [5] gọi thụ thể coxsackie/adenovirus receptor (CAR) Đây protein huyết tương màng có trọng lượng phân tử 46 kDa thuộc siêu họ immunoglobulin, cấu trúc bao gồm domain bên màng TB, xuyên màng domain TB chất [6], với phần domain ngoại bào cần thiết để liên kết virut với TB CAR có chức phân tử liên kết TB với TB bề mặt màng đáy TB biểu mơ [7] Phân tử CD46, protein điều hòa bổ trợ, biết đến thụ thể TB cho adenovirus nhóm B [8] Sau bám dính với bề mặt TB (hình 2), bộc lộ mơ típ RGD penton tương tác với họ protein αν integrin cho TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 phép virut vào bên TB theo chế phụ thuộc clathrin, thụ cảm thể qua trung gian nhập bào [8] Integrins hình thành họ lớn thụ cảm thể dimer dị hợp integrin ανβ3 ανβ5, hai hỗ trợ cho adenovirus xâm nhập vào bên TB, ανβ5 biểu TB biểu mô cuống phổi người, vị trí q trình lây nhiễm adenovirus in vivo [9] Tương tác virut với màng TB cảm ứng loạt đường truyền tín hiệu hoạt hóa đường phosphoinositide3-OH kinase (PI-3k), kích hoạt họ protein Rho GTPases polymer hóa, tái tổ chức cấu trúc actin thuận lợi cho trình nhập bào [10] Hình 2: Bám xâm nhập TB adenovirus: A) Tương tác virut thụ thể TB liên quan đến liên kết lực mạnh qua phần nhô sợi fibre Thụ thể bề mặt TB để adenovirus serotype nhận biết tương tự thụ thể nhận biết coxsackie B virut đặt tên thụ thể Coxsackie/ Adenovirus receptor (CAR) Sau tiếp xúc TB, B) Tương tác penton base αν integrin bề mặt TB cho phép virut xâm nhập vào TB qua trình nhập bào [10] Sau 20 phút xâm nhập, đường truyền tín hiệu Raf/mitogen hoạt hóa protein kinase (MAPK) kích hoạt sản xuất IL-8 [11] Đối với Ad2 Ad5, pH axit thể nội bào (endosome) cảm ứng giải phóng hạt virut (virions) vào bên TB chất theo chế chưa biết rõ Trong TB chất (hình 3), protein dynein chuyên trở hạt virions theo suốt vi ống TB (microtubeles) tới nhân, chúng tiếp xúc với phức hệ lỗ nhân (nuclear pore complex, NPC) Loại bỏ vỏ capsid NPC cho phép hệ gen virut xâm nhập bắt đầu q trình phiên mã Hình 3: Mơ vận chuyển vào nhân TB Ad2: Hạt virut Ad2 tập trung sợi TB chất lỗ nhân cách bám với phức hợp protein CAN/Nup214 Protein histone H1 giải phóng từ nhân bám vào protein hexon bề mặt gần vỏ capsid Protein importin  hình thành liên kết dimer với protein importin liên kết protein H1, cảm ứng xâm nhập phức hệ H1-hexon kích hoạt tháo bỏ vỏ capsid ADN virut giải phóng gần vị trí mở lỗ nhân để chuyển vào nhân TB [10] Gen sớm chép ADN Chu kỳ lây nhiễm adenovirus chia thành pha: Pha “sớm” “muộn” tương ứng trước sau trình chép ADN virut (hình 4) Pha sớm bao TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 gồm trình xâm nhập virut vào bên TB vận chuyển hệ gen virut vào nhân, tiếp đến trình phiên mã dịch mã lựa chọn gen “sớm” Quá trình thúc đẩy chức TB, tạo điều kiện chép ADN virut, dẫn đến kết phiên mã dịch mã gen “muộn” Điều dẫn đến hình thành protein cấu trúc hình thành virut hồn chỉnh Pha sớm kéo dài từ - giờ, pha muộn thường diễn nhanh, thời gian tạo virut từ - sau Vùng gen phiên mã E1A để tạo nhiều mARN protein trình xử lý mARN khác Hai vùng gen phiên mã E1A tạo suốt trình lây nhiễm sớm là: 13S mARN mã hóa cho 289R (R ký hiệu cho amino axit) protein virut Ad5 12S mARN mã hóa cho 234R Những protein tồn vĩnh viễn TB nuôi cấy, chúng biểu kết hợp với protein E1B, gây hình thành khối u động vật gặm nhấm Trong suốt trình xâm nhiễm, protein E1A có chức tăng cường hoạt hóa mức độ phiên mã vùng gen khác như: E1B, E2, E3 E4 cảm ứng TB vào pha S chu kỳ TB, tạo môi trường tối ưu cho trình chép virut Hình 4: Phiên mã hệ gen adenovirus Protein E1A biết đến qua chế tham gia vào trình kiểm sốt chu trình TB, E1A bám trực tiếp ức chế thành phần tham gia kiểm soát chu kỳ TB cyclin-dependent kinase inhibitor p21 E1A tương tác với số protein vật chủ liên quan đến hình thành cấu trúc chromatin p400 histone acetyltransferases (HATs) p300/CBP, pCAF TRRAP/GCN5 Giảm điều hòa chu kỳ TB E1A, kết làm tích lũy protein ức chế u p53 biểu E1A suốt trình lây nhiễm, thúc đẩy trình chết theo chương trình TB làm cho TB nhạy cảm với yếu tố hoại tử u (TNF-α) TRAIL (TNF - related apoptosisinducing ligand) theo đường truyền tín hiệu death receptor pathways Sản phẩm mã hóa E1B-19K có khả ngăn tín hiệu xúc tác cho hai đường truyền tín hiệu kể trên, ngăn TB chết theo chương trình Trong trường hợp TNF-α xúc tác trình apoptosis, protein E1B19K bám trực tiếp với protein tiền apoptotic Bak Bax để ngăn chặn ty thể xúc tác TB chết theo chương trình Bên cạnh chức ức chế TB chết theo chương trình, protein E1B-55K có vai trò vận chuyển mARN virut đến TB chất suốt pha muộn trình lây nhiễm Vùng gen E2 mã hóa cho số protein cần thiết cho trình nhân lên hệ gen virut như: ADN polymerase, protein tiền kết thúc protein với kích thước 72 kDa bám chuỗi đơn ADN Những protein bắt buộc cho chế nhân lên virut, trình chép gen muộn, tồn q trình xúc tác qua tương tác với yếu tố nội bào Sản phẩm vùng gen E3 virut loại bỏ cho mục đích TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 nhân lên virut mơi trường ni cấy mơ, với vai trò phá vỡ đáp ứng miễn dịch vật chủ Hệ thống miễn dịch phát triển chế tiêu diệt TB nhiễm virut, bao gồm ly giải TB TB lympho T gây độc hoạt hóa thụ thể xúc tác đường chết bào chemokines Protein E3gp19k hoạt động theo cách để ngăn chặn trình diện kháng nguyên virut phức hợp hòa hợp mơ tổ chức lớp I (MHC class I), sau ly giải TB TB T gây độc (cytotoxic T cells) E3-gp19k lần đầu phát khả ngăn chặn trình chuyển vị phân tử MHC lớp I tới bề mặt TB cách cô lập chúng mạng lưới nội chất Nhiều nghiên cứu gần cho thấy E3gp19k liên kết với TAP (transporter associated with antigen processing), protein chịu trách nhiệm vận chuyển kháng nguyên TB chất lòng ống, protein ảnh hưởng trực tiếp đến tải lượng peptide phức hệ hòa hợp mô tổ chức lớp I (MHC class I molecules) Các protein E310.4K, 14.5K 14.7K có chức ức chế cảm ứng chết bào chemokines TNF-α Fas ligand (FasL) TRAIL Vùng gen chép E4 mã hóa protein (ký hiệu orfs 1-6/7), protein giữ vai trò điều khiển chu trình TB chuyển dạng Protein E4orf1 Ad9 chứng minh có khả cảm ứng hình thành ung thư vú phụ thuộc estrogens chuột Ở Ad2 Ad5, E4orf3 E4orf6 có hoạt tính đa dạng, hai protein làm tăng chức gen E1 gây chuyển dạng TB động vật gặm nhấm, làm tăng mức độ biểu gen muộn virut ức chế hệ gen hình thành concatemerization enzym đọc sửa ADN nội bào Trong trường hợp protein E4orf6, làm tăng chuyển dạng TB protein ngăn chặn protein p53 xúc tác trans-activation cách ức chế liên kết yếu tố phiên mã nội bào p53 Với nhiều chức sinh học liệt kê, protein E4orf3 xúc tác cho hình thành cấu trúc nhân gọi PML oncogenic domains Mặc dù chức domain chưa biết rõ, số liệu nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng chúng chuyển dạng TB, chép chết theo chương trình TB lây nhiễm virut Phần lớn sản phẩm vùng gen E4 có hoạt tính kháng apoptotic, riêng protein E4orf4 tương tác với phosphatase 2A thúc đẩy trình chết bào không phụ thuộc p53 Biểu gen muộn đóng gói virut Promoter muộn (MLP, major late promoter) phiên mã cho gen muộn adenovirus biểu từ vùng gen (L1 - L5) Đơn vị chép muộn (MLTU - The major late transcription unit) mã hóa cho khoảng 15 - 20 mARN khác nhau, có nguồn gốc từ tiền mARN trình cắt lối khác polyadenylation Những đơn vị phiên mã ban đầu mã hóa cho protein cấu trúc virut protein khác tham gia vào trình đóng gói virut Sự điều khiển gen muộn mã hóa cho cấu trúc lớp vỏ capsid nghiên cứu phát chiến lược để thay đổi định hướng vector liệu pháp gen Protein L1-52/55k bắt buộc cho q trình đóng gói virut, protein L4-33K tham gia vào trình lắp ráp virut, đột biến phần hay đột biến đoạn gen ảnh hưởng đến khả đóng gói virut TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QN SỰ SỐ 4-2014 Trình tự đóng gói adenovirus chuỗi trình tự lặp (A1 - A7) vị trí tận trái hệ gen Sau lắp ráp đóng gói ADN, adenovirus protease cắt protein cấu trúc thành protein thành thục để sản xuất hạt virut hoàn chỉnh TB ly giải giải phóng hạt virut hồn chỉnh sau 30 lây nhiễm với tham gia protein E3-11.6K, gọi ADP (adenovirus death protein) Không giống protein mã hóa vùng gen E3, ADP tạo thành suốt pha muộn trình lây nhiễm chúng chép từ MLP Vector adenovirus Adenovirus lây nhiễm nhiều loại TB mơ TB phân chia không phân chia, đặc tính kết hợp với phương pháp chuẩn bị tinh chế đơn giản cho phép sử dụng vector vật liệu di truyền chuyên trở gen Các vector hình sử dụng cho: 1) Liệu pháp ung thư cách vận chuyển gen có khả ức chế khối u; 2) Liệu pháp gen; 3) Liệu pháp bổ sung vận chuyển gen, biểu gen chống bệnh tiến triển Hình 5: Sơ đồ cấu trúc hệ gen adenovirus serotype hệ adenovirus vector Vùng gen phiên mã sớm muộn đánh dấu tương ứng với vùng E1 - E4 L1 - L5 MLP: promoter muộn chính; : tín hiệu đóng gói Vector adenovirus hệ thứ Trong hệ vector thứ nhất, vùng gen E1 cần thiết để hoạt hóa promoter virut biểu gen sớm muộn loại bỏ, virut khơng khả chép Việc thay vùng gen E1 gen trị liệu ban đầu sử dụng chiến lược thiết kế vector adenovirus hệ Vùng gen E1 bị loại bỏ adenovirus hệ bổ trợ dòng TB mang vùng gen E1 để cung cấp chức in trans Về cơng nghệ, dòng TB 293 nghiên cứu phát triển ứng dụng cho mục đích trên, TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 293 dòng TB thận phơi thai người chuyển biểu vùng gen E1 adenovirus Việc sản xuất vector xóa vùng gen E1 adenovirus ban đầu thực chế tái tổ hợp tương đồng bên TB động vật có vú thiết kế mang trình tự tận đầu bên trái phải hệ gen Việc loại bỏ vùng gen E1 cho phép chèn đoạn gen trị liệu có kích thước lên đến 5,1 Kb vào vùng gen này, không ảnh hưởng đến hiệu giá virut tốc độ tăng trưởng adenovirus đóng gói kích thước đoạn gen đến 38 Kb Nhiều hệ vector thứ bao gồm thiết kế xóa vùng gen E3, để tối ưu hiệu tạo vector virut thí nghiệm sử dụng chế tái tổ hợp chồng lấp, nhà khoa học sử dụng virut đột biến dl309 Ad týp biến thể chúng, virut mà vùng gen E1 có chứa hai vị trí enzym cắt giới hạn xóa phần vùng gen E3 Như vậy, khả tái tạo virut kiểu dại ban đầu q trình tạo virut tái tổ hợp xảy cắt enzym hạn chế khơng hồn toàn tái gắn nối ADN virut bên TB giảm thiểu Hơn thế, gen E3 cần thiết cho trình nhân lên virut in vitro, việc loại bỏ chúng với việc xóa gen E1 cho phép tách dòng kích thước biểu gen trị liệu lên đến 8,2 Kb Mặc dù hệ vector adenovirus thứ chứng minh đầy triển vọng cho mục đích gen trị liệu, nhiều vấn đề tồn Hạn chế bộc lộ trình sản xuất hệ vector này, tái tổ hợp trình tự vùng gen E1 dòng TB mang vùng gen virut tái tổ hợp làm tăng số lượng virut với vùng gen chức E1 không bị loại bỏ, nhân lên trình sản xuất virut Do vậy, virut tái tổ hợp sau tạo thành công cần phải kiểm tra có hay khơng có chép virut xóa bỏ vùng gen E1 (replication competent viruses) Các dòng TB trợ giúp PERC6 911, đó, chồng lấp trình tự gen E1 TB trình tự gen có mặt nhiễm sắc thể virut tái tổ hợp thiết kế giảm thiểu cho trùng lặp trình tự E1 thấp Hạn chế thứ hai liên quan đến việc sử dụng hệ vector Ad hệ khả kích hoạt phản ứng miễn dịch TB dẫn đến TB chuyển gen trị liệu bị tiêu diệt chế miễn dịch TB chuyển gen Thực tế, số nghiên cứu sớm chứng minh tiêm vector loại bỏ vùng gen E1 vào động vật, biểu gen trị liệu sau chuyển vào TB mang tính chất tạm thời Có giả thiết cho đáp ứng miễn dịch kích hoạt số chép virut mức độ thấp, chí trường hợp khơng có gen E1 Giả thiết củng cố thí nghiệm chứng minh chép hệ gen biểu gen muộn Ad hệ xảy từ vector loại bỏ vùng gen E1 nghiên cứu in vivo Mặc dù hệ vector Ad thứ gây đáp ứng miễn dịch mạnh, làm cản trở việc sử dụng hệ vector này, hệ vector đầy hứa hẹn cho nghiên cứu ứng dụng, đòi hỏi dẫn chuyển biểu gen trị liệu thời gian ngắn, nghiên cứu liên quan đến liệu pháp ung thư vắc xin Vector hệ thứ hai Để hạn chế đáp ứng miễn dịch gây mức độ chép thấp virut xóa TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 bỏ vùng gen E1, vector thiết kế xóa bỏ nhiều gen để ức chế hiệu mức độ biểu gen virut Thế hệ vector thứ hai ban đầu thiết kế với việc loại bỏ trình tự mã hóa E2 E4, cung cấp lợi ích cho tách dòng gen trị liệu với kích thước lớn Hạn chế lớn gặp phải q trình thiết kế virut xóa bỏ nhiều vùng gen cần tạo dòng TB mang trình tự gen chức in trans bị xóa adenovirus Mặc dù hạn chế khắc phục, tốn nhiều thời gian công sức, vector đóng gói dòng TB có khả tiếp tục tái tổ hợp để tạo nên virut có khả chép Ví dụ, trường hợp gen E2, dòng TB phải tạo để biểu ổn định protein cần thiết cho việc đóng gói Ad như: single stranded ADN-binding protein, preterminal protein ADN polymerase Các vector virut xóa bỏ gen khơng có khả chép hệ gen, trường hợp vector thiếu polymerase, khơng xảy q trình chép, chí có biểu mức độ mạnh gen E1A Vector hệ thứ ba (Helperdependent adenovirus) Hệ vector Helper-dependent adenoviral (HdAd) ưu việt tất hệ vector chuyển gen khác thí nghiệm liệu pháp gen, khả kéo dài thời gian biểu quan sát chuột khỉ, độc tính virut giảm đáng kể, chí khơng gây độc HdAd thiết kế cách loại bỏ tất gen gây độc virut, giữ lại trình tự lặp đảo ngược (ITRs) hai đầu tận cần thiết cho vector virut nhân lên trình tự Ψ cần thiết để đóng gói thành virut tái tổ hợp hồn chỉnh Tồn trình tự gen bị xóa bỏ virut thay thiết kế mang gen trị liệu trình tự ADN không mang mã gọi “stuffer”, để giữ cho vector có kích thước tương thích cho việc đóng gói Quy trình sản xuất tinh chế HdAd tái tổ hợp bắt buộc cần hai yếu tố: (1) Helper virut (ΔE1/ΔE3) virut xóa bỏ vùng gen E1 E3 với trình tự Ψ xen hai vị trí trình tự nhận biết loxP; (2) Dòng TB 293Cre4, dòng TB thiết kế để biểu protein tái tổ hợp Cre recombinase, protein xúc tác cho trình tái tổ hợp trình tự loxP cắt vị trí đóng gói virut helper Như vậy, việc cắt bỏ trình tự Ψ khiến virut helper khơng thể đóng gói, tất gen chức khác virut giữ nguyên, giúp trì khả chép cung cấp chức trợ giúp cho vector HdAd chép đóng gói thành virut tái tổ hợp hồn chỉnh Vì HDAds bị xóa tất mã di truyền virut, cần phải có virut trợ giúp cho chúng nhân lên Phương pháp hiệu để phát triển HDAds hệ thống Cre-loxP Graham CS phát triển năm 1996 (hình 6) Để việc đóng gói HDAds đạt hiệu quả, kích thước gen phải thiết kế cho chúng nằm phạm vi có kích thước từ 27,7 - 38 Kb Do vậy, ADN "chèn" thường có hệ vector HDAds Kích thước ADN chèn ảnh hưởng đến hiệu suất đóng gói vector Để giải TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 phóng vector HDAd (chuyển đổi gen HDAd từ “dạng plasmid" sang "dạng virut"), plasmid cắt với enzym giới hạn thích hợp để giải phóng gen HDAd từ trình tự dạng plasmid chuyển vào dòng TB 293Cre4 Dòng TB 293Cre4 dòng TB mang thiết kế biểu enzym recombinase nhận biết vị trí đặc hiệu loxP trình tự vector HDAd, đồng thời chuyển gen HDAd vào dòng TB 293Cre4, virut trợ giúp H14 gây đồng nhiễm vào dòng TB Các virut trợ giúp FGAd (bị xóa gen E1), mang trình tự tín hiệu đóng gói hai đầu tận thiết kế hai trình tự nhận biết loxP, vị trí nhận biết cho enzym cắt recombinase Khi TB 293Cre4 gây nhiễm H14, tín hiệu đóng gói cắt từ gen virut trợ giúp Kết quả, gen virut trợ giúp đóng gói, trải qua chép ADN, bổ sung trực tiếp cho chép đóng gói gen vector HDAd Tuy nhiên, việc sản xuất hiệu số lượng lớn vector chất lượng cao gặp nhiều khó khăn, chưa đáp ứng nghiên cứu tiền lâm sàng (trên mô hình động vật lớn) lâm sàng Để giải vấn đề này, người ta phát triển hệ thống cải biến gồm dòng TB sản xuất thích ứng dạng hỗn dịch có biểu Cre mức độ cao loại virut trợ giúp kháng đột biến, kèm theo phương pháp tinh chế đại (hình 7) Hình 6: Sơ đồ thiết kế tạo gutless adenovirus hay helper-dependent adenovirus sử dụng hệ thống Cre/loxP Hệ gen gutless helper chuyển gen vào dòng TB 293 biểu protein Cre, hai hệ gen khuếch đại protein TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 virut tạo thành Sau đồng chuyển gen, tín hiệu đóng gói helper genome cắt enzym Cre recombinase Kết quả, virut helper khơng thể đóng gói gutless genome đóng gói thành virut hồn chỉnh Hình 7: Quy trình sản xuất HDAds quy mơ lớn HV, helper virut; pHDAd, HDAd plasmid Với cải tiến này, dễ dàng sản xuất > x 1013 hạt virut (VP) từ lít TB vòng tuần Tiến cải thiện đáng kể khả ứng dụng công nghệ sản xuất virut tái tổ hợp nghiên cứu gen trị liệu, đặc biệt mơ hình thử nghiệm động vật lớn lâm sàng KẾT LUẬN Tại thời điểm tại, có hệ thống adenovirus sử dụng cho nghiên cứu gen trị liệu, hệ vector thứ nhất, thứ hai thứ ba (helper-dependent adenovirus) Thế hệ vector thứ thứ hai trì thời gian biểu lâu dài gen chuyển TB chủ, có lợi có hiệu lây nhiễm cao vào nhiều kiểu TB khác nhau, dễ dàng thiết kế sản xuất Do vậy, hai hệ thống vector sử dụng rộng rãi thí nghiệm gen trị liệu, liệu pháp gen ức chế ung thư, chủng ngừa, nghiên cứu không yêu cầu biểu lâu dài gen chuyển Hệ thống vector hệ thứ ba ưu việt hệ vector adenovirus chúng có khả đạt hiệu biểu cao trì mức độ biểu lâu dài gen chuyển in vivo Điểm yếu hệ thống quy trình sản xuất bắt buộc cần thành phần: dòng TB chuyên biệt, virut helper vector thu gọn adenovirus Việc sản xuất virut tái tổ hợp helper-dependent adenovirus mang dẫn chuyển gen trị liệu lây nhiễm TB đích với hiệu cao, chất lượng tốt, loại bỏ tạp nhiễm virut helper, tiếp tục cần 10 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 tối ưu để có sản phẩm virut tái tổ hợp mang gen trị liệu an toàn, có độ tinh khiết cao nghiên cứu thử nghiệm điều trị động vật mục tiêu tương lai gần TÀI LIỆU THAM KHẢO Rowe WP, Huebner RJ, Gilmore LK, Parrot RH, Ward TG Isolation of a cytopathic agent from human adenoids undergoing spontaneous degradation in tissue culture Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 1953, 84, pp.570-573 Shenk T Adenoviridae: The viruses and their replication In Virology BN Fields, DM Knipe, PM Howley, eds (Lippincott-Raven, New York) 1996, pp.2111-2148 Anderson CW, Young ME, Flint SJ Characterization of the adenovirus virion protein, mu Virology 1989, 172, pp.506-512 Matthews DA, Russell WC Adenovirus protein-protein interactions: molecular parameters governing the binding of protein VI to hexon and the activation of the adenovirus 23K protease Journal of General Virology 1995, 76, pp.1959-1969 Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, Kurt-Jones EA, Krithivas A, Hong JS, Horwitz MS, Crowell RL, Finberg RW Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adenoviruses and Science 1997, 275, pp.1320-1323 Tomko RP, Xu R, Philipson L HCAR and MCAR: the human and mouse cellular receptors for subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses Proc Natl Acad Sci USA 1997, 94, pp.3352-3356 Honda T, Saitoh H, Masuko M, KatagiriAbe T, Tominaga K, Kozakai I, Kobayashi K, Kumanishi T, Watanabe YG, Odani S, Kuwano R The coxsackievirus–adenovirus receptor protein as a cell adhesion molecule in the developing mouse brain Brain Res Mol Brain Res 2000, 77, pp.19-28 Gaggar A, Shayakhmetov DM, Lieber A CD46 is a cellular receptor for group B adenoviruses Nat Med 2003, 9, pp.1408-1412 Mette SA, Pilewski J, Buck CA, Albelda SM Distribution of integrin cell adhesion receptors on normal bronchial epithelial cells and lung cancer cells in vitro and in vivo American Journal of Research in Respiratory Cell and Molecular Biology 1993, 8, pp.562-572 10 Li E, Stupack D, Bokoch GM, Nemerow GR Adenovirus endocytosis requires actin cytoskeleton reorganization mediated by Rho family GTPases Journal of Virology 1998, 72, pp.8806-8812 11 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2014 12 ... hai hệ thống vector sử dụng rộng rãi thí nghiệm gen trị liệu, liệu pháp gen ức chế ung thư, chủng ngừa, nghiên cứu không yêu cầu biểu lâu dài gen chuyển Hệ thống vector hệ thứ ba ưu việt hệ vector. .. minh chép hệ gen biểu gen muộn Ad hệ xảy từ vector loại bỏ vùng gen E1 nghiên cứu in vivo Mặc dù hệ vector Ad thứ gây đáp ứng miễn dịch mạnh, làm cản trở việc sử dụng hệ vector này, hệ vector đầy... pháp chuẩn bị tinh chế đơn giản cho phép sử dụng vector vật liệu di truyền chuyên trở gen Các vector hình sử dụng cho: 1) Liệu pháp ung thư cách vận chuyển gen có khả ức chế khối u; 2) Liệu pháp