Tổng quan: Các hệ thống vector adenovirus trong nghiên cứu liệu pháp gen

Bài viết này thảo luận về những ưu điểm và hạn chế của vector adenovirus để phát triển các hệ vector ưu việt hơn cho những nghiên cứu về gen trị liệu trong tương lai. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết của tài liệu.

1

TỔNG QUAN: CÁC HỆ THỐNG VECTOR ADENOVIRUS

TRONG NGHIÊN CỨU LIỆU PHÁP GEN

Hoàng Quốc Trường*; Hồ Anh Sơn**

Dương Thuận Thiên***; Nguyễn Lĩnh Toàn**

TÓM TẮT

Adenovirus vector được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về liệu pháp gen, vắc xin

virut tái tổ hợp và trong nghiên cứu cơ bản Adenovirus vector được sử dụng để chuyển trở các

gen trị liệu vào tế bào (TB) bệnh để phục hồi chức năng bị mất của một số gen, tăng cường hệ

thống miễn dịch của vật chủ, hoặc làm tăng tính nhạy cảm của TB ung thư với thuốc hóa trị

liệu Một số hệ thống vector adenovirus đã được nghiên cứu phát triển, bao gồm: thế hệ vector

đầu tiên là những vector được xóa bỏ các gen E1a và E1b, thế hệ vector thứ hai là những

vector được xóa bỏ vùng gen E1 và các gen khác của virut, helper-dependent adenovirus

vector được thiết kế xóa bỏ tất cả các trình tự mang mã hóa cho protein của virut Thế hệ

vector thứ nhất và thứ hai thiết kế và sản xuất tương đối dễ dàng Thế hệ vector thứ ba ưu việt

hơn cả so với bất kỳ hệ thống adenovirus nào khác do hiệu suất biểu hiện và thời gian biểu

hiện lâu dài của gen chuyển đạt được trong nghiên cứu in vivo Bài tổng quan này thảo luận

những ưu điểm và hạn chế của vector adenovirus để phát triển các hệ vector ưu việt hơn cho

những nghiên cứu về gen trị liệu trong tương lai

* Từ khóa: Adenovirus; Liệu pháp gen; Vector

REVIEW: ADENOVIRAL VECTOR SYSTEMS FOR GENE THERAPY

summary

Adenoviral (Ad) vectors are widely used in gene therapies, recombinant viral vaccine, and

basic science studies The vectors can deliver therapeutic genes into cells to recover lost

function of some genes, to enhance the ability of host immune systems, or to increase the

sensitivity of cancer cells to chemotherapeutic drugs Several adenoviral vector systems have

been developed: first-generation vectors are those with deletion of the E1a and E1b genes,

second-generation vectors with deletions of the E1 and another viral gene, and

helper-dependent adenovirus vectors removed all coding sequences for viral proteins The first- and

second-generation vectors are relatively easy to construct and produce The helper-dependent

adenovirus vectors are substantially superior to any other adenoviral systems for achieving

high-level and longterm expression in vivo This review focuses on the advantages and

limitations of adenovirus vectors and discusses potential strategies for further improvement of

vectors for gene therapy

* Key words: Adenovirus; Gene therapies; Vectors

* Bệnh viện TWQ§ 108

** Học viện Quân y

*** Bệnh viện Quân y 103

Người phản hồi (Corresponding): Hoàng Quốc Trường (hqtruong2002@yahoo.com)

Ngày nhận bài: 16/01/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 04/04/2014

Ngày bài báo được đăng: 07/04/2014

2

đặt vấn đề

Adenovirus được Rowe và CS phỏt

hiện từ 1/2 thế kỷ trước qua cỏc thớ

nghiệm nuụi cấy virut phõn lập từ vựng

vũm họng [1] Mặc dự adenovirus gõy cỏc

bệnh về đường hụ hấp, mắt và đường

tiờu húa, nhưng virut này đó được tập

trung nghiờn cứu trong nhiều năm như

một mụ hỡnh để tỡm hiểu cỏc cơ chế sinh

học của TB cú nhõn bậc cao, bao gồm: quỏ

trỡnh phiờn mó, xử lý ARN, khuếch đại

ADN, dịch mó và cơ chế bệnh sinh ung

thư Adenovirus thuộc họ adenoviridae với

51 kiểu huyết thanh, được chia thành sỏu

nhúm (từ A - F) dựa trờn trỡnh tự tương

đồng và khả năng ngưng kết TB hồng cầu

người [2] Hệ gen của adenovirus là chuỗi

đụi cú kớch thước 36 Kb Ở hai đầu tận

cựng của hệ gen là hai trỡnh tự lặp tận

cựng đảo ngược (ITR - inverted terminal

repeat) với kớch thước từ 100 - 400 bp,

liờn kết với protein kết thỳc (TP - terminal

protein) bằng liờn kết húa trị Về hỡnh thỏi,

adenovirus cú vỏ và protein cấu trỳc bao

bọc hệ gen của virut với cấu trỳc hỡnh

khối 20 mặt Trờn cấu trỳc tiếp giỏp giữa

hai mặt của vỏ cú cấu trỳc penton base

giữ vai trũ neo giữ protein sợi (fibre

protein) và làm cho virut bỏm dớnh với bề

mặt của TB Mỗi mặt của vỏ virut bao

gồm 03 protein hexon và cỏc protein pIIIa,

pVI, pVIII và pIX (hỡnh 1) Protein VII, cú

trỡnh tự peptide nhỏ được gọi là mu [3],

liờn kết chặt chẽ với ADN virut, trong khi

protein V được đúng gúi với phức hợp

ADN-protein cung cấp liờn kết cấu trỳc

với vỏ qua protein VI [4] Cỏc thành viờn

của họ adenovirus cú khả năng lõy nhiễm

TB sau phõn bào, thậm chớ cả mụ biệt

húa cao như cơ võn, phổi, nóo và tim Với

khả năng vận chuyển hệ gen tới nhõn và

hiệu quả khuếch đại cao, adenovirus là

ứng viờn số một để biểu hiện và chuyờn chở cỏc gen trị liệu đến TB đớch với phạm

vi rộng

Hỡnh 1: Cấu trỳc của adenovirus: A) Cấu

trỳc mụ phỏng của adenovirus dựa trờn

sự hiểu biết về thành phần polypeptide và ADN B) Ảnh chụp kớnh hiển vi điện tử của adenovirus [3]

Chu kỳ nhân lên của adenovirus

1 Bỏm và xõm nhập vào bờn trong TB

Trong tất cả cỏc nhúm, loại trừ adenovirus nhúm B, hạt virut ban đầu bỏm vào bề mặt TB thụng qua liờn kết của sợi Knob với thụ thể bề mặt TB tương thớch cho coxsackie B virut [5] được gọi là thụ thể coxsackie/adenovirus receptor (CAR) Đõy

là một protein huyết tương màng cú trọng lượng phõn tử 46 kDa thuộc siờu họ immunoglobulin, cấu trỳc bao gồm cỏc domain bờn ngoài màng TB, xuyờn màng

và domain trong TB chất [6], với phần domain ngoại bào cần thiết để liờn kết giữa virut với TB CAR cú chức năng như phõn tử liờn kết TB với TB trờn bề mặt màng đỏy của TB biểu mụ [7] Phõn tử CD46, là protein điều hũa bổ trợ, được biết đến như một thụ thể TB cho adenovirus nhúm B [8] Sau khi bỏm dớnh với bề mặt

TB (hỡnh 2), bộc lộ mụ tớp RGD trờn penton

tương tỏc với họ protein αν integrin cho

3

phép virut vào bên trong TB theo cơ chế

phụ thuộc clathrin, thụ cảm thể qua trung

gian nhập bào [8] Integrins hình thành họ

lớn thụ cảm thể dimer dị hợp như integrin

ανβ3 và ανβ5, cả hai hỗ trợ cho adenovirus

xâm nhập vào bên trong TB, ανβ5 biểu

hiện ở TB biểu mô cuống phổi người, là vị

trí chính của quá trình lây nhiễm adenovirus

in vivo [9] Tương tác giữa virut với màng

TB cảm ứng một loạt đường truyền tín hiệu

như hoạt hóa con đường

phosphoinositide-3-OH kinase (PI-3k), kích hoạt họ protein

Rho của GTPases và polymer hóa, tái tổ

chức cấu trúc của actin thuận lợi cho quá

trình nhập bào [10]

Hình 2: Bám và xâm nhập TB của adenovirus:

A) Tương tác giữa virut và thụ thể TB liên

quan đến liên kết ái lực mạnh qua phần

nhô ra của sợi fibre Thụ thể bề mặt TB

để adenovirus serotype 5 nhận biết tương

tự như thụ thể nhận biết của coxsackie B

virut và được đặt tên là thụ thể Coxsackie/

Adenovirus receptor (CAR) Sau khi tiếp

xúc TB, B) Tương tác giữa penton base

và αν integrin trên bề mặt TB cho phép

virut xâm nhập vào TB qua quá trình nhập

bào [10]

Sau 20 phút xâm nhập, con đường

truyền tín hiệu Raf/mitogen hoạt hóa

protein kinase (MAPK) được kích hoạt và

sản xuất IL-8 [11] Đối với Ad2 và Ad5, do

pH axit của thể nội bào (endosome) cảm

ứng giải phóng hạt virut (virions) vào bên trong TB chất theo cơ chế chưa được biết

rõ Trong TB chất (hình 3), protein dynein

chuyên trở các hạt virions theo suốt vi ống TB (microtubeles) tới nhân, tại đây chúng tiếp xúc với phức hệ lỗ nhân (nuclear pore complex, NPC) Loại bỏ vỏ capsid tại NPC cho phép hệ gen virut xâm nhập và bắt đầu quá trình phiên mã

Hình 3: Mô phỏng vận chuyển vào trong

nhân TB của Ad2: Hạt virut Ad2 tập trung trên sợi TB chất của lỗ nhân bằng cách bám với phức hợp protein CAN/Nup214 Protein histone H1 giải phóng từ nhân và bám vào protein hexon trên bề mặt gần nhất của vỏ capsid Protein importin 

hình thành liên kết dimer với protein importin 7 liên kết protein H1, cảm ứng xâm nhập phức hệ H1-hexon và kích hoạt tháo bỏ vỏ capsid ADN virut được giải phóng gần vị trí mở của lỗ nhân để chuyển vào trong nhân TB [10]

2 Gen sớm và sao chép ADN

Chu kỳ lây nhiễm của adenovirus được chia thành 2 pha: Pha “sớm” và “muộn” tương ứng trước và sau quá trình sao

chép ADN virut (hình 4) Pha sớm bao

4

gồm quá trình xâm nhập của virut vào

bên trong TB và vận chuyển hệ gen của

virut vào trong nhân, tiếp đến là quá trình

phiên mã và dịch mã lựa chọn của những

gen “sớm” Quá trình này thúc đẩy các chức

năng của TB, tạo điều kiện sao chép ADN

virut, dẫn đến kết quả phiên mã và dịch

mã các gen “muộn” Điều này cũng dẫn

đến sự hình thành protein cấu trúc và

hình thành virut hoàn chỉnh Pha sớm kéo

dài từ 6 - 8 giờ, trong khi pha muộn

thường diễn ra nhanh, thời gian tạo virut

từ 4 - 6 giờ sau đó Vùng gen được phiên

mã đầu tiên là E1A để tạo ra rất nhiều

mARN và protein bởi quá trình xử lý

mARN khác nhau Hai vùng gen phiên mã

E1A được tạo ra suốt quá trình lây nhiễm

sớm là: 13S mARN mã hóa cho 289R (R là ký hiệu cho các amino axit) protein

của virut Ad5 và 12S mARN mã hóa cho

234R Những protein này tồn tại vĩnh viễn

trong TB nuôi cấy, khi chúng biểu hiện và

kết hợp với protein E1B, gây hình thành

khối u ở động vật gặm nhấm Trong suốt

quá trình xâm nhiễm, protein E1A có

chức năng tăng cường hoạt hóa mức độ

phiên mã của các vùng gen khác như:

E1B, E2, E3 và E4 và cảm ứng TB đi vào

pha S của chu kỳ TB, tạo môi trường tối

ưu cho quá trình sao chép của virut

Hình 4: Phiên mã hệ gen adenovirus

Protein E1A được biết đến qua cơ chế tham gia vào quá trình kiểm soát chu trình của TB, E1A bám trực tiếp và ức chế các thành phần tham gia kiểm soát chu kỳ của TB như cyclin-dependent kinase inhibitor p21 E1A còn tương tác với một số protein vật chủ liên quan đến sự hình thành cấu trúc chromatin như p400 và histone acetyltransferases (HATs) p300/CBP, pCAF

và TRRAP/GCN5 Giảm điều hòa chu kỳ

TB bởi E1A, kết quả làm tích lũy protein

ức chế u p53 và biểu hiện của E1A trong suốt quá trình lây nhiễm, thúc đẩy quá trình chết theo chương trình của TB làm cho TB nhạy cảm với yếu tố hoại tử u (TNF-α) và TRAIL (TNF - related apoptosis- inducing ligand) theo con đường truyền tín hiệu death receptor pathways Sản phẩm mã hóa bởi E1B-19K có khả năng ngăn tín hiệu xúc tác cho cả hai đường truyền tín hiệu kể trên, ngăn TB chết theo chương trình Trong trường hợp TNF-α xúc tác quá trình apoptosis, protein E1B-19K có thể bám trực tiếp với protein tiền apoptotic như Bak và Bax để ngăn chặn

ty thể xúc tác TB chết theo chương trình

Bên cạnh chức năng ức chế TB chết theo chương trình, protein E1B-55K còn có vai trò vận chuyển mARN của virut đến TB chất trong suốt pha muộn của quá trình lây nhiễm Vùng gen E2 mã hóa cho một

số protein cần thiết cho quá trình nhân lên của hệ gen virut như: ADN polymerase, protein tiền kết thúc và protein với kích thước 72 kDa bám chuỗi đơn ADN

Những protein này là bắt buộc cho cơ chế nhân lên của virut, tiếp theo là quá trình sao chép của gen muộn, toàn bộ quá trình được xúc tác qua tương tác với các yếu tố nội bào Sản phẩm vùng gen E3 của virut có thể loại bỏ cho mục đích

5

nhân lên của virut trong môi trường nuôi

cấy mô, với vai trò phá vỡ đáp ứng miễn

dịch của vật chủ Hệ thống miễn dịch phát

triển cơ chế tiêu diệt TB nhiễm virut, bao

gồm ly giải TB bởi TB lympho T gây độc

và hoạt hóa thụ thể xúc tác con đường

chết bào bởi chemokines Protein

E3-gp19k hoạt động theo 2 cách để ngăn

chặn trình diện của kháng nguyên virut

bởi phức hợp hòa hợp mô tổ chức lớp I

(MHC class I), sau đó là ly giải TB bởi TB

T gây độc (cytotoxic T cells) E3-gp19k

lần đầu được phát hiện do khả năng ngăn

chặn quá trình chuyển vị của phân tử

MHC lớp I tới bề mặt của TB bằng cách

cô lập chúng trong mạng lưới nội chất

Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy

E3-gp19k liên kết với TAP (transporter associated

with antigen processing), là protein chịu

trách nhiệm vận chuyển kháng nguyên

TB chất trong lòng ống, đây là protein ảnh

hưởng trực tiếp đến tải lượng của peptide

trên phức hệ hòa hợp mô tổ chức lớp I

(MHC class I molecules) Các protein

E3-10.4K, 14.5K và 14.7K có chức năng ức

chế cảm ứng chết bào bởi chemokines

TNF-α Fas ligand (FasL) và TRAIL

Vùng gen sao chép E4 mã hóa protein

(ký hiệu orfs 1-6/7), là các protein giữ vai

trò điều khiển chu trình TB và chuyển

dạng Protein E4orf1 của Ad9 được

chứng minh có khả năng cảm ứng hình

thành ung thư vú phụ thuộc estrogens trên

chuột Ở Ad2 và Ad5, E4orf3 và E4orf6

có hoạt tính rất đa dạng, cả hai protein

này đều làm tăng chức năng của gen E1

gây chuyển dạng TB động vật gặm nhấm,

làm tăng mức độ biểu hiện của gen muộn

virut và ức chế hệ gen hình thành

concatemerization bởi enzym đọc sửa

ADN nội bào Trong trường hợp protein

E4orf6, làm tăng chuyển dạng của TB do

protein này ngăn chặn protein p53 xúc tác trans-activation bằng cách ức chế liên kết các yếu tố phiên mã nội bào p53 Với nhiều chức năng sinh học đã được liệt kê, protein E4orf3 xúc tác cho hình thành cấu trúc nhân được gọi là PML oncogenic domains Mặc dù chức năng của những domain này chưa được biết rõ, nhưng các

số liệu nghiên cứu cho thấy vai trò quan trọng của chúng trong chuyển dạng TB, sao chép và chết theo chương trình ở TB lây nhiễm virut Phần lớn sản phẩm của vùng gen E4 đều có hoạt tính kháng apoptotic, riêng protein E4orf4 tương tác với phosphatase 2A thúc đẩy quá trình chết bào không phụ thuộc p53

3 Biểu hiện gen muộn và đóng gói virut

Promoter muộn chính (MLP, major late promoter) phiên mã cho gen muộn của adenovirus được biểu hiện từ 5 vùng gen (L1 - L5) Đơn vị sao chép muộn chính (MLTU - The major late transcription unit)

mã hóa cho khoảng 15 - 20 mARN khác nhau, đều có nguồn gốc từ một tiền mARN bởi quá trình cắt lối khác nhau và polyadenylation Những đơn vị phiên mã này ban đầu mã hóa cho protein cấu trúc của virut và protein khác tham gia vào quá trình đóng gói virut Sự điều khiển của gen muộn mã hóa cho cấu trúc của lớp vỏ capsid đã được nghiên cứu phát hiện như một chiến lược để thay đổi định hướng của vector liệu pháp gen Protein L1-52/55k là bắt buộc cho quá trình đóng gói của virut, trong khi protein L4-33K cũng tham gia vào quá trình lắp ráp virut, đột biến một phần hay đột biến mất đoạn gen này sẽ ảnh hưởng đến khả năng đóng gói của virut

6

Trình tự đóng gói của adenovirus là

chuỗi 7 trình tự lặp (A1 - A7) và ở vị trí

tận cùng trái của hệ gen Sau khi lắp ráp

và đóng gói ADN, adenovirus protease

cắt protein cấu trúc thành các protein

thành thục để sản xuất hạt virut hoàn

chỉnh TB ly giải và giải phóng hạt virut

hoàn chỉnh sau 30 giờ lây nhiễm với sự

tham gia của protein E3-11.6K, còn được

gọi là ADP (adenovirus death protein)

Không giống như protein mã hóa bởi

vùng gen E3, ADP chỉ được tạo thành

trong suốt pha muộn của quá trình lây

nhiễm và chúng được sao chép từ MLP

Vector adenovirus

Adenovirus có thể lây nhiễm nhiều loại

TB và mô cả ở TB phân chia và không phân chia, đặc tính này kết hợp với các phương pháp chuẩn bị và tinh chế đơn giản cho phép sử dụng vector này như vật liệu di truyền chuyên trở gen Các vector ở hình 5 có thể sử dụng cho: 1) Liệu pháp ung thư bằng cách vận chuyển gen có khả năng ức chế khối u; 2) Liệu pháp gen; 3) Liệu pháp bổ sung vận chuyển gen, biểu hiện gen chống bệnh tiến triển

Hình 5: Sơ đồ cấu trúc hệ gen của adenovirus serotype 5 và các thế hệ adenovirus

vector Vùng gen phiên mã sớm và muộn được đánh dấu tương ứng với vùng E1 - E4

và L1 - L5 MLP: promoter muộn chính; : tín hiệu đóng gói

1 Vector adenovirus thế hệ thứ nhất

Trong hệ vector thứ nhất, vùng gen E1

cần thiết để hoạt hóa promoter của virut

và biểu hiện cả gen sớm và muộn được

loại bỏ, do vậy virut này không còn khả

năng sao chép Việc thay thế vùng gen

E1 bằng gen trị liệu ban đầu được sử

dụng trong chiến lược thiết kế vector adenovirus thế hệ 1 Vùng gen E1 bị loại

bỏ của adenovirus thế hệ 1 có thể được

bổ trợ bằng dòng TB mang vùng gen E1

để cung cấp chức năng in trans Về công

nghệ, dòng TB 293 đã được nghiên cứu phát triển ứng dụng cho mục đích trên,

7

293 là dòng TB thận phôi thai người được

chuyển và biểu hiện vùng gen E1 của

adenovirus Việc sản xuất vector xóa

vùng gen E1 của adenovirus ban đầu

được thực hiện do cơ chế tái tổ hợp

tương đồng bên trong TB động vật có vú

giữa thiết kế mang trình tự tận cùng đầu

bên trái và phải của hệ gen Việc loại bỏ

vùng gen E1 cho phép chèn đoạn gen trị

liệu có kích thước lên đến 5,1 Kb vào

vùng gen này, trong khi không ảnh hưởng

đến hiệu giá của virut và tốc độ tăng

trưởng vì adenovirus có thể đóng gói kích

thước đoạn gen đến 38 Kb Nhiều thế hệ

vector thứ nhất cũng bao gồm thiết kế

xóa vùng gen E3, để tối ưu hiệu quả tạo

vector virut trong thí nghiệm sử dụng cơ

chế tái tổ hợp chồng lấp, các nhà khoa

học đã sử dụng virut đột biến dl309 của

Ad týp 5 hoặc biến thể của chúng, là các

virut mà trong vùng gen E1 có chứa hai vị

trí enzym cắt giới hạn duy nhất do xóa

một phần của vùng gen E3 Như vậy, khả

năng tái tạo của virut kiểu dại ban đầu

trong quá trình tạo virut tái tổ hợp có thể

xảy ra do cắt enzym hạn chế không hoàn

toàn hoặc do tái gắn nối ADN của virut

bên trong TB được giảm thiểu Hơn thế,

gen E3 cần thiết cho quá trình nhân lên

của virut in vitro, việc loại bỏ chúng cùng

với việc xóa gen E1 cho phép tách dòng

kích thước biểu hiện gen trị liệu lên đến

8,2 Kb Mặc dù thế hệ vector adenovirus

thứ nhất được chứng minh đầy triển vọng

cho mục đích gen trị liệu, nhưng vẫn còn

nhiều vấn đề tồn tại Hạn chế đầu tiên

bộc lộ trong quá trình sản xuất hệ vector

này, tái tổ hợp giữa trình tự vùng gen E1

trong các dòng TB mang vùng gen này và

virut tái tổ hợp có thể làm tăng số lượng

virut với vùng gen chức năng E1 không bị

loại bỏ, nhưng vẫn nhân lên trong quá trình sản xuất virut Do vậy, virut tái tổ hợp sau khi tạo thành công cần phải kiểm tra có hay không có sao chép của virut xóa bỏ vùng gen E1 (replication - competent viruses) Các dòng TB trợ giúp như PERC6 và 911, trong đó, sự chồng lấp giữa trình tự gen E1 trong TB và trình

tự gen này có mặt trên nhiễm sắc thể virut tái tổ hợp thiết kế giảm thiểu sao cho

sự trùng lặp về trình tự E1 là thấp nhất Hạn chế thứ hai liên quan đến việc sử dụng hệ vector Ad thế hệ 1 chính là khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch của

TB dẫn đến TB được chuyển gen trị liệu

sẽ bị tiêu diệt do chính cơ chế miễn dịch của TB chuyển gen Thực tế, trong một

số nghiên cứu sớm đã chứng minh khi tiêm vector đã loại bỏ vùng gen E1 vào động vật, biểu hiện của gen trị liệu sau khi được chuyển vào TB chỉ mang tính chất tạm thời Có giả thiết cho rằng đáp ứng miễn dịch được kích hoạt bởi số bản sao chép của virut ở mức độ thấp, thậm chí ngay cả trường hợp không có gen E1 Giả thiết này được củng cố bởi các thí nghiệm chứng minh sao chép hệ gen và biểu hiện gen muộn của Ad thế hệ 1 có thể xảy ra từ vector được loại bỏ vùng

gen E1 trong nghiên cứu in vivo Mặc dù

hệ vector Ad thứ nhất gây đáp ứng miễn dịch mạnh, làm cản trở việc sử dụng hệ vector này, nhưng đây cũng là hệ vector đầy hứa hẹn cho nghiên cứu ứng dụng, đòi hỏi dẫn chuyển biểu hiện gen trị liệu trong thời gian ngắn, như nghiên cứu liên quan đến liệu pháp ung thư và vắc xin

2 Vector thế hệ thứ hai

Để hạn chế đáp ứng miễn dịch gây ra

do mức độ sao chép thấp của virut đã xóa

8

bỏ vùng gen E1, các vector được thiết kế

xóa bỏ nhiều gen để ức chế hiệu quả hơn

mức độ biểu hiện gen của virut Thế hệ

vector thứ hai ban đầu được thiết kế với

việc loại bỏ trình tự mã hóa E2 và E4, do

đó cung cấp lợi ích cho tách dòng gen trị

liệu với kích thước lớn Hạn chế lớn nhất

gặp phải trong quá trình thiết kế virut xóa

bỏ nhiều vùng gen là cần tạo được các

dòng TB mang trình tự gen chức năng in

trans đã bị xóa của adenovirus Mặc dù

hạn chế này có thể khắc phục, nhưng tốn

nhiều thời gian và công sức, các vector

được đóng gói trong dòng TB này ít có

khả năng tiếp tục tái tổ hợp để tạo nên

virut có khả năng sao chép Ví dụ, trường

hợp của gen E2, dòng TB phải được tạo

để biểu hiện ổn định protein cần thiết cho

việc đóng gói của Ad như: single stranded

ADN-binding protein, preterminal protein

và ADN polymerase Các vector virut xóa

bỏ gen này không có khả năng sao chép

hệ gen, trong trường hợp vector thiếu

polymerase, không xảy ra quá trình sao

chép, thậm chí có biểu hiện mức độ mạnh

của gen E1A

3 Vector thế hệ thứ ba

(Helper-dependent adenovirus)

Hệ vector Helper-dependent adenoviral

(HdAd) ưu việt hơn tất cả các hệ vector

chuyển gen khác trong thí nghiệm về liệu

pháp gen, do khả năng kéo dài thời gian

biểu hiện quan sát ở chuột và khỉ, độc

tính của virut giảm đáng kể, thậm chí

không còn gây độc HdAd được thiết kế

bằng cách loại bỏ tất cả gen gây độc của

virut, chỉ giữ lại duy nhất trình tự lặp đảo

ngược (ITRs) ở hai đầu tận cùng cần thiết

cho vector virut nhân lên và trình tự Ψ cần thiết để đóng gói thành virut tái tổ hợp hoàn chỉnh Toàn bộ trình tự gen bị xóa bỏ của virut sẽ được thay thế bằng thiết kế mang gen trị liệu hoặc trình tự ADN không mang mã được gọi là “stuffer”,

để giữ cho vector có kích thước tương thích cho việc đóng gói Quy trình sản xuất và tinh chế HdAd tái tổ hợp bắt buộc cần hai yếu tố: (1) Helper virut (ΔE1/ΔE3)

là virut đã xóa bỏ vùng gen E1 và E3 với trình tự Ψ được xen giữa hai vị trí trình

tự nhận biết loxP; (2) Dòng TB 293Cre4,

là dòng TB được thiết kế để biểu hiện protein tái tổ hợp Cre recombinase, là protein xúc tác cho quá trình tái tổ hợp giữa trình tự loxP cắt vị trí đóng gói của virut helper Như vậy, việc cắt bỏ trình tự

Ψ khiến virut helper không thể đóng gói, nhưng tất cả gen chức năng khác của virut được giữ nguyên, giúp duy trì khả năng sao chép và cung cấp chức năng trợ giúp cho vector HdAd có thể sao chép

và đóng gói thành virut tái tổ hợp hoàn chỉnh

Vì HDAds bị xóa tất cả bộ mã di truyền của virut, do đó cần phải có một virut trợ giúp cho chúng nhân lên Phương pháp hiệu quả đầu tiên để phát triển HDAds là

hệ thống Cre-loxP được Graham và CS

phát triển năm 1996 (hình 6) Để việc

đóng gói của HDAds đạt hiệu quả, kích thước của bộ gen phải được thiết kế sao cho chúng nằm trong phạm vi có kích thước từ 27,7 - 38 Kb Do vậy, ADN "chèn" thường có trong hệ vector HDAds Kích thước của ADN chèn có thể ảnh hưởng đến hiệu suất đóng gói của vector Để giải

9

phóng vector HDAd (chuyển đổi bộ gen

HDAd từ “dạng plasmid" sang "dạng virut"),

các plasmid đầu tiên được cắt với enzym

giới hạn thích hợp để giải phóng bộ gen

HDAd từ trình tự dạng plasmid và chuyển

vào dòng TB 293Cre4 Dòng TB 293Cre4

là dòng TB mang thiết kế biểu hiện enzym

recombinase nhận biết vị trí đặc hiệu loxP

trên trình tự của vector HDAd, đồng thời

chuyển bộ gen HDAd vào dòng TB 293Cre4,

virut trợ giúp H14 cũng được gây đồng

nhiễm vào dòng TB này Các virut trợ

giúp là một FGAd (bị xóa gen E1), mang

trình tự tín hiệu đóng gói hai đầu tận cùng

được thiết kế hai trình tự nhận biết loxP,

là vị trí nhận biết cho enzym cắt recombinase

Khi TB 293Cre4 gây nhiễm bằng H14, tín

hiệu đóng gói được cắt ra từ bộ gen của virut trợ giúp này Kết quả, bộ gen của virut trợ giúp không thể đóng gói, nhưng vẫn có thể trải qua sao chép ADN, do đó

bổ sung trực tiếp cho sao chép và đóng gói bộ gen của vector HDAd Tuy nhiên, việc sản xuất hiệu quả số lượng lớn các vector chất lượng cao còn gặp nhiều khó khăn, chưa đáp ứng được nghiên cứu tiền lâm sàng (trên mô hình động vật lớn)

và trên lâm sàng Để giải quyết vấn đề này, người ta đã phát triển một hệ thống cải biến gồm dòng TB sản xuất thích ứng dưới dạng hỗn dịch có biểu hiện Cre ở mức độ cao và một loại virut trợ giúp kháng đột biến, kèm theo là phương pháp tinh chế hiện đại (hình 7)

Hình 6: Sơ đồ thiết kế tạo gutless adenovirus hay helper-dependent adenovirus sử

dụng hệ thống Cre/loxP Hệ gen của gutless và helper cùng được chuyển gen vào dòng TB 293 biểu hiện protein Cre, cả hai hệ gen cùng được khuếch đại và protein

10

virut được tạo thành Sau khi đồng chuyển gen, tín hiệu đóng gói của helper genome

được cắt bằng enzym Cre recombinase Kết quả, virut helper không thể đóng gói trong

khi gutless genome vẫn được đóng gói thành virut hoàn chỉnh

Hình 7: Quy trình sản xuất HDAds quy mô lớn HV, helper virut;

pHDAd, HDAd plasmid

Với những cải tiến này, có thể dễ dàng sản xuất được > 1 x 1013 hạt virut (VP) từ 3

lít TB trong vòng 2 tuần Tiến bộ này đã cải thiện đáng kể khả năng ứng dụng công

nghệ sản xuất virut tái tổ hợp này trong nghiên cứu về gen trị liệu, đặc biệt trong mô

hình thử nghiệm trên động vật lớn và trên lâm sàng

KẾT LUẬN

Tại thời điểm hiện tại, có 3 hệ thống

adenovirus được sử dụng cho nghiên cứu

về gen trị liệu, thế hệ vector thứ nhất, thứ

hai và thứ ba (helper-dependent adenovirus)

Thế hệ vector thứ nhất và thứ hai không

thể duy trì thời gian biểu hiện lâu dài của

gen chuyển trong TB chủ, nhưng có lợi

thế là có hiệu quả lây nhiễm cao vào

nhiều kiểu TB khác nhau, cũng như dễ

dàng thiết kế và sản xuất Do vậy, hai hệ

thống vector này được sử dụng rộng rãi

trong thí nghiệm về gen trị liệu, như liệu

pháp gen ức chế ung thư, chủng ngừa, là

nghiên cứu không yêu cầu biểu hiện lâu dài của gen chuyển Hệ thống vector thế

hệ thứ ba ưu việt hơn các hệ vector adenovirus do chúng có khả năng đạt hiệu quả biểu hiện cao và duy trì mức độ biểu hiện lâu dài của gen chuyển in vivo

Điểm yếu chính của hệ thống này trong quy trình sản xuất bắt buộc cần 3 thành phần: dòng TB chuyên biệt, virut helper

và vector thu gọn adenovirus Việc sản xuất virut tái tổ hợp helper-dependent adenovirus mang và dẫn chuyển gen trị liệu có thể lây nhiễm TB đích với hiệu quả cao, chất lượng tốt, loại bỏ được tạp nhiễm của virut helper, đang tiếp tục cần