Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá ảnh hưởng của cao khô đông trùng hạ thảo (ĐTHT) lên thay đổi một số chỉ số chống oxy hóa và sinh hóa chức năng gan trên chuột nhắt trắng gây tổn thương gan bằng paracetamol.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỐNG OXY HÓA VÀ SINH HÓA CHỨC NĂNG GAN TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM UỐNG CAO KHÔ ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris) Lê Minh Hoàng*; Nguyễn Hoàng Ngân**; Nguyễn Bá Quang*** Nghiêm Hữu Thành***; Nguyễn Duy Bắc** TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá ảnh hưởng cao khô đông trùng hạ thảo (ĐTHT) lên thay đổi số số chống oxy hóa sinh hóa chức gan chuột nhắt trắng gây tổn thương gan paracetamol Đối tượng phương pháp: chuột nhắt trắng điều trị trước ĐTHT ngày, sau gây độc gan paracetamol 400 mg uống ngày liên tiếp Xác định số chống oxy hóa sinh hóa chức gan Kết quả: ĐTHT liều 160 mg/kg/24 320 mg/kg/24 dùng đường uống chuột nhắt trắng gây độc paracetamol có tác dụng làm giảm hàm lượng MDA gan, tăng số GSH gan, SOD, TAS, GSH máu, làm giảm enzym AST, ALT máu tương đương với silymarin liều 67 mg/kg/24 giờ, hồi phục số giá trị tương đương với lơ chứng sinh lý Chỉ số protein tồn phần albumin máu biến đổi khơng có ý nghĩa thống kê Kết luận: ĐTHT có tác dụng chống oxy hóa tốt, bảo vệ gan mơ hình thực nghiệm * Từ khóa: Đơng trùng hạ thảo; Chống oxy hóa; Sinh hóa; Chức gan; Thực nghiệm Research on the Effect of Cordyceps Militaris Dried Extract on the Variation of Anti-oxidant Indices and Biochemical Markers of Liver Function in Experimental Mice Summary Objectives: To evaluate the effect of Cordyceps militaris dried extract on the variation of antioxidant indices and biochemical markers of liver function in paracetamol-induced liver damage mice Subjects and methods: After days of orally pre-treatment of Cordyceps militaris dried extract 160 and 320 mg/kg body weight/day, hepatotoxicity was induced in mice by oral administration of paracetamol 400 mg/kg on two consecutive days Anti-oxidant indices and biochemical markers of liver function wwere measured Results: Cordyceps militaris dried extract 160 and 320 mg/kg body weight/day orally administration in paracetamol-induced liver damage mice had the effects on reducing MDA in liver; increasing GSH in liver, SOD, TAS and GSH in serum; reducing AST, ALT in serum; restored these indeces to the value equivalent to physiological control group Change of total protein and albumin in serum was not statistically significant Conclusions: Cordyceps militaris dried extract have good antioxidant and hepatoprotective effects on the experimental model * Keywords: Cordyceps militaris; Anti-oxidant; Biochemical markers; Liver function; Experiment * Đại học Y Dược Cần Thơ ** Học viện Quân y *** Bệnh viện Châm cứu Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac_hvqy@yahoo.com) Ngày nhận bài: 30/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 05/09/2017 Ngày báo đăng: 09/09/2017 601 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 ĐẶT VẤN ĐỀ Trùng thảo (Cordyceps) chi nấm mọc ấu trùng trùng Có > 350 loài Cordyceps, nhiên tên gọi ĐTHT thường dùng cho lồi chứng minh có hoạt chất tác dụng sinh học quý Cordyceps sinensis Cordyceps militaris ĐTHT có nhiều tác dụng sinh học quý, có tác dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan [1, 2, 3] Nhiều sở nước, có Học viện Qn y ni cấy thành cơng nấm ĐTHT Cordyceps militaris Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý ĐTHT ni cấy Việt Nam Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Đánh giá số số chức gan chống oxy hóa máu chuột thực nghiệm gây độc paracetamol uống cao khô ĐTHT Cordyceps militaris nuôi cấy Việt Nam ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± g, Ban Cung cấp Động vật Thí nghiệm, Học viện Qn y cung cấp Ni dưỡng chuột điều kiện phòng ni thức ăn chuẩn dành cho động vật nghiên cứu, chuột làm quen với điều kiện thí nghiệm tuần trước tiến hành thí nghiệm - Chế phẩm nghiên cứu: Bột cao khơ ĐTHT bào chế từ ĐTHT Cordyceps militaris nuôi cấy Việt Nam, đạt tiêu chuẩn sở 602 Phƣơng pháp nghiên cứu Tiến hành theo phương pháp Kuppan Nithianantham CS (2011) [1] Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng thành lô, lô 10 - Lô (chứng sinh lý): uống nước cất - Lô (chứng gây độc): uống nước cất + paracetamol - Lô (lô silymarin): uống silymarin liều 67 mg/kg/24 + paracetamol - Lô (ĐTHT liều 1): uống cao khô ĐTHT 160 mg/kg/24 + paracetamol - Lô (ĐTHT liều 2): uống cao khô ĐTHT 320 mg/kg/24 + paracetamol Cho chuột uống kim cong đầu tù, hàng ngày vào sáng, ngày liên tục Sau ngày điều trị trước ĐTHT, chuột gây độc (ngoại trừ lô 1) paracetamol uống 400 mg/kg ngày liên tục Sau gây độc ngày, giết chuột, đánh giá số: - Xét nghiệm MDA gan theo phương pháp I.U.A Vladymyrop CS (1972) Ủ dịch đồng thể 2% mẫu gan chuột dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) 37oC 45 phút Thêm dung dịch axít tricloacetic (TCA) 30% (1/5 thể tích dịch đồng thể), lắc kỹ cho phản ứng tạo tủa Lọc loại bỏ tủa Lấy ml dung dịch trong, thêm vào ml dung dịch axít thiobarbituric (TBA) 0,25% Đun cách thuỷ 100oC 15 phút Để nguội đến nhiệt độ phòng Đo quang max = 532 nm, từ tính hàm lượng MDA - Xét nghiệm GSH gan theo phương pháp G.A Hazenton C.A Lang (1980) Tạo dịch đồng thể 9% mẫu gan chuột dung dịch axít TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 metaphosphoric 5% Thêm dung dịch axít tricloacetic (TCA) 30%, lắc kỹ cho phản ứng tạo tủa Lọc loại bỏ tủa Lấy 0,5 ml dung dịch cho vào 4,5 ml dung dịch gồm: thuốc thử ellman 0,1 mM/ml hỗn hợp đệm Na3PO4 0,1 M EDTA 0,05 M Ủ nhiệt độ 25oC phút - Xét nghiệm AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), protein toàn phần albumin máu chuột máy xét nghiệm sinh hoá (Biochemical Systems International Srl, Italia, model 3000 Evolution), hóa chất (Hãng MEDIA, Italia) Đo quang bước sóng = 412 nm, từ tính hàm lượng GSH * Xử lý số liệu: Phân tích thống kê one-way ANOVA, Tukey test, sử dụng phần mềm SPSS 13.1 Khác biệt có ý nghĩa thống kê p < 0,05 - Xét nghiệm SOD, TAS GSH máu kít xét nghiệm (Hãng Sigma, Hoa Kỳ) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Một số số chống o paracetamol uống c o khô ĐTHT h chuột nhắt trắng gâ độc * Hàm lượng MDA GSH gan: Bảng 1: Hàm lượng MDA GSH gan chuột (mean ± SD, n = 10) Hàm lƣợng MDA gan Hàm lƣợng GSH gan (nmol/g tổ chức) (g/g tổ chức) Chứng sinh lý (1) 6,83 ± 1,16 0,77 ± 0,14 Chứng gây độc (2) 9,45 ± 0,95 0,51 ± 0,09 Silymarin (3) 7,00 ± 2,12 0,69 ± 0,08 ĐTHT liều (4) 7,76 ± 1,40 0,68 ± 0,12 ĐTHT liều (5) 7,43 ± 1,20 0,71 ± 0,13 Lô nghiên cứu p p1,3,4,5-2 < 0,01; p3,4,5-1 > 0,05; p4,5-3 > 0,05; p4-5 > 0,05 So với lô chứng sinh lý, lơ chứng gây độc có hàm lượng MDA gan tăng, hàm lượng GSH gan giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) Lơ ĐTHT có hàm lượng MDA gan thấp hơn, hàm lượng GSH gan cao so với lô chứng gây độc (p < 0,01), hồi phục tương đương so với lô chứng sinh lý (p > 0,05) So với lô tham chiếu dùng silymarin, hàm lượng MDA GSH gan chuột lơ ĐTHT tương đương nhau, khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 603 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Chỉ số GSH/máu, SOD/máu, TAS huyết tương: Bảng 2: Nồng độ GSH/máu, SOD/máu, TAS huyết tương lô chuột nghiên cứu (mean ± SD, n = 10) Lô nghiên cứu Nồng độ GSH máu (g /ml) Nồng độ SOD máu (ng/ml) TAS huyết tƣơng (UI/ml) Chứng sinh lý (1) 304,33 ± 23,48 93,27 ± 4,93 3,60 ± 0,25 Chứng gây độc (2) 254,50 ± 32,20 72,00 ± 2,53 2,97 ± 0,05 Silymarin (3) 299,65 ± 25,79 91,10 ± 7,49 3,54 ± 0,21 ĐTHT liều (4) 295,16 ± 22,63 89,64 ± 6,66 3,51 ± 0,29 ĐTHT liều (5) 315,12 ± 76,65 92,98 ± 13,36 3,56 ± 0,42 p p1,3,4,5-2 < 0,01; p3,4,5-1 > 0,05; p4,5-3 > 0,05; p4-5 > 0,05 So với lô chứng sinh lý, lơ chứng gây độc có nồng độ GSH máu, SOD máu TAS huyết tương giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) Các lô ĐTHT có nồng độ GSH máu, SOD máu TAS huyết tương cao so với lô chứng gây độc (p < 0,01), hồi phục tương đương so với lô chứng sinh lý (p > 0,05) So với lô silymarin, nồng độ GSH máu, SOD máu TAS huyết tương chuột lơ ĐTHT tương đương, khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Một số số h sinh chức g n chuột nhắt trắng gâ độc paracetamol uống c o khô ĐTHT Bảng 3: Chỉ số hóa sinh chức gan máu chuột nghiên cứu (mean ± SD, n = 10) Lô nghiên cứu Hoạt độ AST (U/l ) Hoạt độ ALT (U/l ) Protein toàn phần (g/l ) Albumin (g/l ) Chứng sinh lý (1) 188,90 ± 118,61 43,00 ± 22,77 50,80 ± 16,02 26,20 ± 7,96 Chứng gây độc (2) 586,20 ± 143,12 66,40 ± 10,32 48,60 ± 15,34 23,40 ± 6,40 Silymarin (3) 218,30 ± 79,00 43,80 ± 13,98 51,40 ± 7,46 26,90 ± 4,41 ĐTHT liều (4) 221,80 ± 108,44 47,30 ± 15,73 49,60 ± 15,94 24,60 ± 6,98 ĐTHT liều (5) 205,40 ± 89,10 44,30 ± 17,30 50,20 ± 14,00 25,20 ± 7,36 p p1,3,4,5-2 < 0,01; p3,4,5-1 > 0,05; p1-2,3,4,5 > 0,05; p2-3,4,5 > 0,05; p4,5-3 > 0,05; p4-5 > 0,05 p3-4,5 > 0,05; p4-5 > 0,05 Hoạt độ enzym AST ALT máu lơ chứng gây độc tăng, có ý nghĩa thống kê so với lô chứng sinh lý (p < 0,01) Các lô ĐTHT lô dùng silymarin có hoạt độ enzym AST ALT máu giảm so với lô chứng gây độc (p < 0,01), hồi phục tương đương so với lô chứng sinh lý (p > 0,05) Khơng có khác biệt lơ ĐTHT lô dùng silymarin (p > 0,05) Nồng độ protein tồn phần albumin máu lơ khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) 604 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BÀN LUẬN Mơ hình thực nghiệm gây tổn thương gan paracetamol nhiều tác giả sử dụng [1, 3, 5] Chỉ số đánh giá gồm hàm lượng MDA gan (đánh giá tác dụng ức chế q trình peroxy hóa lipid màng tế bào chế phẩm), hàm lượng GSH gan, GSH, SOD TAS máu (đánh giá ảnh hưởng chế phẩm lên tình trạng chống oxy hóa thể) Nghiên cứu cho thấy ĐTHT có tác dụng hồi phục tốt số chuột gây độc paracetamol, chứng tỏ tác dụng chống oxy hóa chế phẩm Kết phù hợp với số nghiên cứu cơng bố tác dụng chống oxy hóa ĐTHT [1, 2, 3] Chỉ số hoạt độ enzym AST ALT dùng để đánh giá có tổn thương tế bào gan Cao khô ĐTHT làm giảm hoạt độ enzym máu Với kết tác dụng làm giảm MDA gan tăng GSH gan thấy: chế phẩm có tác dụng bảo vệ, làm giảm tổn thương tế bào gan, giải thích phần chế tác dụng chống oxy hóa, làm giảm q trình peroxy hóa lipid màng tế bào gan Kết nghiên cứu nồng độ protein toàn phần albumin huyết tương lô chuột không biến đổi đáng kể (p > 0,05), lý giải khả bù trừ gan lớn KẾT LUẬN Kết nghiên cứu cho thấy cao khô ĐTHT Việt Nam với liều 160 mg/kg/24 liều 320 mg/kg/24 có tác dụng chống oxy hóa (làm giảm hàm lượng MDA gan, phục hồi GSH gan, SOD, TAS, GSH máu) tác dụng bảo vệ gan (làm giảm enzym AST, ALT huyết tương), tương đương với silymarin liều 67 mg/kg/24 đánh giá chuột nhắt trắng gây độc paracetamol TÀI LIỆU THAM KHẢO Kuppan Nithianantham, Murugesan Shyamala, Yeng Chen, Lachimanan Yoga Latha, Subramanion L Jothy and Sreenivasan Sasidharan Hepatoprotective potential of clitoriaternatea leaf extract against paracetamol induced damage in mice Molecules 2011, 16, pp.10134-10145; doi:10.3390/molecules161210134 Reis F.S, Barros L, Calhelha R.C, Cirić A, van Griensven L.J, Soković M, Ferreira I.C The methanolic extract of Cordyceps militaris (L.) Link fruiting body shows antioxidant, antibacterial, antifungal and antihuman tumor cell lines properties Food Chem Toxicol 2013, 62, pp.91-8 doi: 10.1016/j.fct.2013.08.033 Epub 2013 Aug 27 Yu Zhan, Cai-Hong Dong, Yi-Jian Yao Anti-oxidant activities of aqueous extract from cultivated fruit-bodies of Cordyceps militaris (L.) Link in vitro Journal of Integrative Plant Biology 2006, 48 (11), pp.1365-1370 Wang L, Xu N, Zhang J, Zhao H, Lin L, Jia S, Jia L Antihyperlipidemic and hepatoprotective activities of residue polysaccharide from Cordyceps militaris SU-12 Carbohydr Polym 2015, 131, pp.355-62 doi: 10.1016/j.carbpol 2015.06.016 Epub 2015, Jun 17 605 ... nhiều nghiên cứu tác dụng dược lý ĐTHT ni cấy Việt Nam Vì vậy, nghiên cứu tiến hành với mục tiêu: Đánh giá số số chức gan chống oxy hóa máu chuột thực nghiệm gây độc paracetamol uống cao khô ĐTHT... KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Một số số chống o paracetamol uống c o khô ĐTHT h chuột nhắt trắng gâ độc * Hàm lượng MDA GSH gan: Bảng 1: Hàm lượng MDA GSH gan chuột (mean ± SD, n = 10) Hàm lƣợng MDA gan Hàm... uống c o khơ ĐTHT Bảng 3: Chỉ số hóa sinh chức gan máu chuột nghiên cứu (mean ± SD, n = 10) Lô nghiên cứu Hoạt độ AST (U/l ) Hoạt độ ALT (U/l ) Protein toàn phần (g/l ) Albumin (g/l ) Chứng sinh