Bài viết mô tả chi tiết việc hình thành chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35. Protein được biểu hiện từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao. Tuy nhiên, việc đưa các đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật rất phức tạp, làm tăng chi phí biểu hiện và tính chế sau này. Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa trên khung virut tái tổ hợp đã được triển khai. Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với các công nghệ tổng hợp nucleotid và tối ưu hóa codon, chúng tôi đã tạo ra dòng TB bài tiết virut mã hóa IL-12 mRNA.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 THIẾT LẬP HỆ CHUYỂN GEN RETROVIRUT TÁI TỔ HỢP BIỂU HIỆN IL-12 Ở MỨC ĐỘ mARN Ngô Tất Trung*; Lê Hữu Song*; Phan Quốc Hoàn* Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Tồn** TĨM TẮT Protein biểu từ tế bào (TB) động vật có vú có hoạt tính cao Tuy nhiên, việc đưa đoạn gen mã hóa protein đích vào TB động vật phức tạp, làm tăng chi phí biểu tính chế sau Để khắc phục điều này, công nghệ chuyển gen dựa khung virut tái tổ hợp triển khai Bằng cách kết hợp chuyển gen retrovirut với công nghệ tổng hợp nucleotid tối ưu hóa codon, chúng tơi tạo dòng TB tiết virut mã hóa IL-12 mRNA * Từ khóa: IL-12; Retrovirut; Protein tái tổ hợp Construction of Recombinant Retrovirus Plasmid Engineering System for Expression of Interleukin-12 mRNA Level Summary Recombinant protein expressed from mammalian cell culture is a good activity However, the current procedure of delivery target open reading frame into mammalian host is cumbersome, which makes the chimeric protein expension To overcome the limits of available mammalian expression systems, many recombinant virus based gene deliver technologies have been implemented, in which the retrovirus backbone is one option of choice In this study, by combining recombinant retrovirus plasmid engineering with codon optimization, we have successfully created a cell line with significant secreted level of IL-12 mRNA * Key words: IL-12; Retrovirus; Recombinant protein ĐẶT VẤN ĐỀ Interleukin-12 ban đầu biết đến cytokine tiền viêm, thng c to bi tế bào Dendritic (DCs) thực bµo Cytokine có vai trò cảm ứng tiết interferon-γ (IFN-γ), nhờ kích thích q trình biệt hóa hình thành TB T helper (TH1), yếu tố kết nối phản ứng miễn dịch bẩm sinh với miễn dịch thích nghi Sau này, khoa học chứng minh IL-12 đóng vai trò tác nhân tăng trưởng cho TB giết tự nhiên (Natural killer cell growth factor) Cytokine hợp thành từ hai tiểu phần (subunit) mã hóa hai gen khác Khi tiểu phần dịch mã tạo thành IL-12 p35 IL12 p40 Hai tiền cytokine sau tiết tiếp tục sửa đổi sau dịch mã lai ghép với nhau, tạo thành phân tử cytokine heterodimer IL-12 p70 với đầy đủ chức sinh học cần thiết cho điều hòa miễn dịch * Bệnh viện TWQĐ 108 ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Lĩnh Toàn (toannl@vmmu.edu.vn) Ngày nhận bài: 23/05/2014; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/09/2014 Ngày báo đăng: 02/12/2014 70 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Tác dụng kinh điển mà người biết IL-12 điều trị ung thư là: i) kích thích q trình biệt hóa định hình tính đặc hiệu thụ thể (T cell receptor TCR) bề mặt TB lympho T trợ giúp (helper T cell) thơng qua kích thích q trình tăng sinh TB trình diện kháng nguyên Dendritic; ii) định hướng độc tính TB T gây độc (cytotoxic CD8 T lymphocyte) [1, 2], iii) ức chế trình tạo mạch máu: thay đổi TB ung thư so với TB thơng thường mơ, liên tục tham gia phân bào, nhu cầu dinh dưỡng cao mức bình thường Vì thế, chúng tiết hormon làm tăng trình phát triển mạch máu tới khối u (angiogensis) Cho đến nay, người ta biết IL-12 cytokine ức chế q trình đó, gián tiếp ức chế phát triển khối u [2] Gần đây, khám phá quan trọng liên quan đến tính chất sinh học IL-12 cytokine có khả ức chế q trình phát triển khối u mơ hình động vật thực nghiệm thiếu hụt miễn dịch (nude mice) [3] Trên sở nghiên cứu bản, triển khai thử nghiệm lâm sàng sử dụng protein tái tổ hợp IL-12 Tuy nhiên, độc tính IL-12 mạnh, chí gây chết người [4], điều làm chậm trình triển khai ứng dụng IL-12 điều trị ung thư Để khắc phục độc tính IL-12 gây nên, số thử nghiệm kết hợp IL-12 với cytokine khác IL-2, interferon alpha, B7.1, IL-7, IL-21, IL15 [5], đặc biệt IL-18 Bằng cách này, độc tính IL-12 giảm xuống mức gần khơng có [6], mang lại triển vọng cho ứng dụng interleukine có 71 tính ức chế ung thư mạnh IL-12 vào thử nghiệm lâm sàng Vì vậy, cơng nghệ sản xuất interleukine tái tổ hợp IL-12 khơng đem lại lợi ích cho việc phát triển liệu pháp điều trị ung thư liên quan đến IL-12, mà phối kết hợp sử dụng IL-12 với interleukine tiềm khác như: IL-7, IL-15, IL-18, IL-21… Do IL-12 hợp thành từ hai tiểu phần mã hóa hai gen khác nhau, việc tạo p70 với đầy đủ chức sinh lý phải tiến hành hệ retrovirut cho phép biểu đồng thời tiểu phần p40/p35 Các nghiên cứu thường tạo IL-12 tái tổ hợp từ ORF mã hóa tương ứng cho tiểu phần p40, p35 nối với linker peptide, tạo đơn vị mARN độc lập nằm xen kẽ internal ribosome entry site (IRES) Ở phạm vi nghiên cứu này, mô tả chi tiết việc hình thành chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/ IL-12-p35 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu Dòng TB đóng gói PT-76, human embryonic kiney - HEK 293T Nolan lab Standford University phát triển Clone Tech (USA) cung cấp; khung retrovirut plasmid pMXs-IP Trường Đại học Toshio Kitamura - Tokyo, phần mềm Vector NTI vật tư sinh học phân tử khác Phƣơng pháp nghiên cứu * Hệ retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35: TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QN SỰ SỐ 9-2014 Chiến lược thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12 sau: đoạn gen mã hóa cho cấu phần p35, p40 IL-12 clon xen kẽ với đoạn ADN mã hóa cho linker theo thiết kế Mulligan RC [7], bổ sung thêm đoạn ADN mã hóa leader peptide để đảm bảo protein tiết mơi trường, ngồi phần C terminal bổ sung đoạn mã hóa cho Tev - cleavage site 6His tag, nhờ protein làm tinh kỹ thuật chelating proteolytic cleavage sử dụng Tev-cleavage proteolytic enzyme Hình 1: Chiến lược thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12 * Tối ưu hóa trình tự codon IL-12: Dựa trình tự human IL-12 subunit beta (UniProtKB: accession P29460) human IL-12 subunit alpha (UniProtKB: accession P29459), kết hợp đoạn signal peptid đầu 5’ (MCHQQLVISWFSLVFLASPLVA) đoạn linker kết nối tiểu phần p40/35 (GGGGSGGGGSGGGGSRNLPV), đầu 3’ cấu hình IL-12-p40/ linker/IL-12-p35 tích hợp đoạn ADN mã hóa cho Tev-cleavage proteolytic site (NQNLYFQG) 6(His) tag (HHHHHH), từ hình thành nên chuỗi polypeptid p40-linker-p35-His: 72 Trình tự polypeptid mã hóa ORF có kích thước 1.680 bp, có vị trí cắt enzyme EcoRI đầu 5’, đầu 3’ cassette bị cắt XhoI * Quy trình tạo chủng retrovirut mã hóa IL-12 cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35: Retrovirut plasmid mang cu hỡnh IL-12p40/linker/IL-12-p35 đ-ợc tăng sinh b»ng vi khuÈn E coli - DH5 alpha, thu ho¹ch th«ng qua quy trình maxi-prep để có lơ plasmid với nồng độ ≥ 200 ng/ul, OD nằm khoảng 1,7 - 2,0 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Chuyển retro-plasmid mang cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35 vào TB human embryonic kidney - HEK 293T quy trình kết tủa canxi sử dụng phương pháp cationic - liposome mediated gen transfer Hình 1: Kiểm chứng thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12 cắt enzyme giới hạn Đoạn insert cắt enzyme XhoI/EcoRI cho kích thước điện di phù hợp với mong đợi 1.680 bp 500 ml dịch từ TB 108Retro@ linkerIL-12 TB đối chứng H293T thu nhận riêng rẽ cho mục đích tách ARN tổng số Lượng ARN sau dùng làm khn cho phản ứng tổng hợp cADN Kiểm chứng có mặt virut mã hóa IL-12 dịch TB đóng gói KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Kiểm chứng thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12 Thiết kế retrovirut plasmid mang gen ghép IL-12 có đặc điểm phần 5’ expression cassette có vị trí cắt enzyme E coRI, đầu 3’ cassette bị cắt XhoI kết hợp cắt enzyme XhoI/EcoRI ta insert 1.680 bp Điều kiểm chứng phản ứng cắt enzyme cho kết hình Hình 2: Kết PCR điện di kiểm chứng có mặt ORF mã hóa IL-12-p40/linker/ IL-12-p35 từ dịch TB.108Retro @linkerIL-12 Để chắn hơn, tiến hành thu nhận dịch TB 108Retro@linkerIL-12, thực phản ứng phiên mã ngược khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho IL-12 Giải trình tự đoạn 320 bp nhân lên từ cADN dịch TB 108Retro@linkerIL-12 thu đoạn đọc 189bp có phổ sắc ký hình Sử dụng trình tự để blast (blast nucleotide against polypeptide Translated BLAST), thu kết độ tương đồng 100% 73 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Hình 3: Kết translated BLAST với inquiry trình tự băng PCR điện di từ c AND dịch TB 108Retro@linkerIL-12 Dòng TB 108Retro@linkerIL-12 tạo thực tiết retrovirut particle mang cấu hình IL-12-p40/linker/IL-12-p35 BÀN LUẬN đổi đoạn gen lỗi Một yếu điểm khác Cho đến nay, nhiều hệ biểu gen adenovirut vector thường triển khai để tạo protein IL-12 tái tổ gây phản ứng miễn dịch mạnh, hợp, sử dụng nhiều dễ bị thải loại hệ miễn dịch vật chủ Việc hệ chuyển gen có nguồn gốc virut bao khó tích hợp ngẫu nhiên phân tử gồm adenovirut retrovirut Thông adenovirut vào hệ gen vật chủ, thường, gốc đồng nghĩa với việc làm giảm nguy adenovirut khơng có khả tích hợp vào gây chuyển đoạn nhiễm sắc thể hay hệ gen TB vật chủ Nó tồn tự biến đổi di truyền học TB chủ, TB nhân nồng độ giảm dần sau bị chuyển dạng sang thể TB ác tính chu kỳ phân bào Hơn nữa, kích thước dung nạp virut Về lý thuyết, adenovirut vector thường lớn, khó lý adenovirut coi phương tiện tích hợp ngẫu nhiên vào nhiễm sắc thể chuyển gen gây ung thư so với TB chủ Vì vậy, khó tạo dòng retrovirut sử dụng cho liệu pháp gen plasmid có nguồn TB ổn định cho biểu protein đích thơng qua So với adenovirut, khả tích hợp hệ chuyển gen retrovirut vào hệ gen vật chủ tốt adenovirut khó sử dụng liệu pháp nhiều, làm cho trình biểu protein gen dựa hệ adenovirut cho sửa đích trở nên dễ dàng, mặt khác lại 74 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 làm rối loạn khu vực nhiễm sắc thể tích nhiên đối tượng này, khơi mào cho khu vực nối tiếp khu vực sợi chromatin dị hợp ngẫu nhiên (facultative heterochromatin) Vì vậy, gen bị bất hoạt biểu Chính tính ưu việt đó, chúng tơi tiến hành thiết lập hệ retrovirut biểu IL-12 tái tổ hợp Việt Nam chuyển dạng ác tính TB vật chủ KẾT LUẬN thế, lý thuyết, gây lo ngại hình Kết nghiên cứu thiết lập thành công hệ retrovirut biểu IL-12 mức độ mARN hợp Trong trường hợp retrovirut tích hợp vào khu vực mã hóa cho gen chÑn ung thhoặc gen ung thư, làm thay đổi tính chất tự thành thể bệnh ung thư sử dụng retrovirut cho ứng dụng liệu pháp gen Tuy nhiên, quan sát thử nghiệm lâm sàng TÀI LIỆU THAM KHẢO vừa công bố tạp chí Trinchieri G Interleukin-12 and the regulation of innate resistance and adaptive immunity Nat Rev Immunol 2003, (2), pp.133146 Science cho thấy khơng có trường hợp ghi nhận mắc bệnh sau sử dụng liệu pháp gen có nguồn retrovirut [8] Đây báo cáo thống kê ghi nhận tính an tồn retrovirut cho mục đích chuyển gen Trong đó, ứng dụng khác tạo protein tái tổ hợp TB ni cấy, retrovirut có ưu tất hệ biểu gen chuyển gen mà người ta biết trước với lý sau: Thơng thường, đoạn gen đích (ví dụ IL-12 ORF) cài vào 5’ long terminal repeat (LTR) 3’ long terminal repeat (LTR) retrovirut plasmid, LTR vừa đóng vai trò promoter điều hòa biểu gen đích vừa insulator bảo vệ gen đích khơng bị ảnh hưởng máy phiên mã gen kề bên Ngoài ra, q trình tích hợp retrovirut plasmid vào hệ gen TB chủ khơng ngẫu nhiên, diễn theo kiểu tái tổ hợp đồng dạng với đích đến đảo retrotransposon nhiễm sắc thể Bằng cách loại bỏ nguy đoạn gen đích di chuyển đến 75 Del Vecchio M et al Interleukin-12: biological properties and clinical application Clin Cancer Res 2007, 13 (16), pp.4677-4685 Eisenring M et al IL-12 initiates tumor rejection via lymphoid tissue-inducer cells bearing the natural cytotoxicity receptor NKp46 Nat Immunol 2010, 11 (11), pp.1030-1038 Cohen J IL-12 deaths: explanation and a puzzle Science 1995, 270 (5238), p.908 Weiss JM et al Immunotherapy of cancer by IL-12-based cytokine combinations Expert Opin Biol Ther 2007, (11), pp.1705-1721 Rodriguez-Galan MC et al Coexpression of IL-18 strongly attenuates IL-12-induced systemic toxicity through a rapid induction of IL-10 without affecting its antitumor capacity J Immunol 2009, 183 (1), pp.740-748 Lieschke GJ et al Bioactive murine and human interleukin-12 fusion proteins which retain antitumor activity in vivo Nat Biotechnol 1997, 15 (1), pp.35-40 Scholler J et al Decade-long safety and function of retroviral-modified chimeric antigen receptor T cells Sci Transl Med 2012, (132), pp.132-153 ... ngại hình Kết nghiên cứu thiết lập thành công hệ retrovirut biểu IL-12 mức độ mARN hợp Trong trường hợp retrovirut tích hợp vào khu vực mã hóa cho gen chĐn ung thhoặc gen ung thư, làm thay đổi... chromatin dị hợp ngẫu nhiên (facultative heterochromatin) Vì vậy, gen bị bất hoạt biểu Chính tính ưu việt đó, chúng tơi tiến hành thiết lập hệ retrovirut biểu IL-12 tái tổ hợp Việt Nam chuyển dạng... protein IL-12 tái tổ gây phản ứng miễn dịch mạnh, hợp, sử dụng nhiều dễ bị thải loại hệ miễn dịch vật chủ Việc hệ chuyển gen có nguồn gốc virut bao khó tích hợp ngẫu nhiên phân tử gồm adenovirut retrovirut