Bài viết này được nghiên cứu với mục tiêu nhằm hoàn thiện quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502 bằng phương pháp Nested-SSPPCR để dự phòng phản ứng thuốc carbamazepine thể nặng. Mời các bạn cùng tham khảo.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC ALEN HLA-B*1502 DỰ PHÕNG PHẢN ỨNG THUỐC CARBAMAZEPINE THỂ NẶNG BẰNG PHƢƠNG PHÁP NESTED-SSP-PCR Trần Văn Khoa*; Ngô Trường Giang* Đặng Thị Hồng*, Vũ Thị Lệ** TĨM TẮT Mục tiêu: hồn thiện quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502 phương pháp Nested-SSPPCR để dự phòng phản ứng thuốc carbamazepine thể nặng Đối tượng phương pháp: 45 mẫu máu tĩnh mạch chưa biết loại alen HLA-B tách ADN tổng số, tiến hành phản ứng nested-SSP-PCR, điện di sản phẩm gel agarose 2%, phân tích kết Kết quả: 45 mẫu ADN, sàng lọc mẫu dương tính với HLA-B*1502 Kết luận: hồn thiện quy trình sàng lọc gen HLA-B*1502 phương pháp nested-SSP-PCR * Từ khóa:HLA-B*1502; Phản ứng thuốc; Carbamazepine; Nested-SSP-PCR Study on Screening HLA-B*1502 Allele for Prevention of Carbamazepine-Induced Severe Drug Reactions using Nested-SSPPCR Technique Summary Objective: To complete a protocol for screening HLA-B*1502 gene to prevent carbamazepine-Induced severe drug reactions using nested-SSP-PCR technique Subjects and methods: 45 blind blood samples with unknown HLA-B allelic types, total DNA was extracted, amplifying HLA-B gene using nested-SSP-PCR technique, electrophoresis PCR products in 2% agarose gel and analysis Result: We were able to detect HLA-B*1502 in of 45 samples Conclusion: We have completed a protocol for screening HLA-B*1502 gene using nested-SSPPCR technique * Keywords: HLA-B*1502; Drug reactions; Carbamazepine; Nested-SSP-PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Trong thực hành lâm sàng, tỷ lệ phản ứng thuốc thể nặng ngày giảm xuống nhờ nguyên tắc dùng thuốc dần hoàn thiện theo hướng cá thể hoá Tuy nhiên, số lượng dược chất đưa vào điều trị lâm sàng ngày tăng Hơn nữa, phản ứng thuốc nặng xảy ra, tỷ lệ bệnh nhân (BN) tử vong cao, tới 30% Do đó, dự phòng phản ứng thuốc thể nặng vấn đề đáng quan tâm * Học viện Quân y ** Bệnh viện TWQĐ 108 Người phản hồi (Corresponding): Trần Văn Khoa (tvkhoabio@gmail.com) Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 30/08/2017 Ngày báo đăng: 06/09/2017 325 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Hiện nay, số kháng nguyên bạch cầu người (HLA) sử dụng marker để phát phản ứng thuốc nặng: hội chứng Stevens- Johnson (hay nhiễm độc hoại tử) Trong HLA này, HLA-B*1502 marker di truyền có liên quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể nặng dùng thuốc carbamazepine, đặc biệt cộng đồng người châu Á [1, Vấn đề Chung CS báo cáo lần vào năm 2004 Cùng với nghiên cứu nhiều tác giả khác, Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Mỹ khuyến cáo bác sỹ nên sàng lọc HLA-B*1502 BN châu Á trước sử dụng carbamazepine [5 Để thực việc này, cần có phương pháp hiệu quả, đơn giản, nhanh rẻ tiền SSPPCR kỹ thuật dùng hiệu để phát gen HLA-B*15 Tuy nhiên, kỹ thuật phải cần tới tổ hợp nhân gen đa mồi để sàng lọc [6 Một số kít thương mại nước lưu hành Việt Nam tiện giá thành cao Trước thực tiễn đó, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Chuẩn hóa quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502 kỹ thuật nested-SSP-PCR để dự phòng phản ứng thuốc thể n ng BN sử dụng carbamazepine ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 45 mẫu máu chưa biết loại alen HLA-B chống đông EDTA thu thập Học viện Quân y 326 Phƣơng pháp nghiên cứu * Tách chiết ADN tổng số từ 45 mẫu máu thu thập được: kít tách chiết ADN từ máu toàn phần Qiagen * Tiến hành phản ứng nested-SSPPCR nhân gen HLA-B*1502: - Vòng 1: để kiểm sốt q trình nhân gen khuếch đại gen HLA-B, sử dụng cặp mồi F1, R1 nhân gen IFN-γ làm nội chứng + Cặp mồi F1, R1 nhân gen HLA-B vòng 1: cặp mồi IF, IR nhân gen IFN-γ vòng Trình tự cặp mồi tham khảo sở liệu IMGT/HLA 3.6 tháng 10 - 2011 [7] + Thành phần phản ứng PCR nhân gen vòng 1: Master mix: 12,5 μl; primers (10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: μl; mẫu: μl, tổng thể tích 25 μl + Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng 1: 950C phút; chu trình touchdown theo bước, ba bước đầu gồm chu kỳ: 950C 30 giây, gắn mồi 30 giây, nối dài 720C 30 giây Nhiệt độ gắn mồi giảm dần từ 720C, 680C, 67,10C; hai bước gồm 10 chu kỳ 20 chu kỳ, nhiệt độ gắn mồi giảm 650C 550C Cuối 720C phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%, phân tích kết - Vòng 2: mẫu có kết nhân gen vòng dương tính với cặp mồi HLA-B IFN-γ, sản phẩm dùng làm khn nhân gen vòng Để kiểm sốt nhân gen vòng 2, chúng tơi sử dụng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 thêm cặp mồi kiểm sốt phản ứng nested-PCR nhân gen HLA-B*1502: (10 pmol/μl): 0,25 μl; nước deion: μl; mẫu: μl, tổng thể tích 25 μl + Cặp mồi F2, R2 nhân gen HLAB*1502 vòng 2; cặp mồi F3, R1 kiểm soát phản ứng nested-PCR Trình tự cặp mồi tham khảo sở liệu IMGT/HLA 3.6, tháng 10-2011 [7] + Chu trình nhiệt phản ứng PCR vòng 2: 950C phút; 30 chu kỳ 950C 30 giây, 700C 30 giây 720C 30 giây; ổn định chuỗi cuối 720C phút + Thành phần phản ứng PCR nhân gen vòng 1: Master mix: 12,5 μl; primers + Sản phẩm PCR điện di gel agarose 2%, phân tích kết KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết nh n gen HLA-B vòng Sản phẩm PCR vòng điện di gel agarose 2% 30 phút: Hình 1: Kết điện di sản phẩm nhân gen vòng ((-): chứng âm; M: marker 100 bp; dải lại: băng gen HLA-B vòng có kích thước 430 bp băng gen IFN-γ có kích thước 150 bp) Tất dải xuất băng gen IFN-γ có kích thước 150 bp, chứng tỏ phản ứng PCR diễn bình thường tất mẫu rõ ràng, kích thước thiết kế khơng xuất băng phụ Như vậy, điều kiện cho phản ứng nested-SSP-PCR vòng tối ưu Trong 11 mẫu điện di hình, mẫu 39, 40, 41, 45, 48, 50 xuất băng 430 bp, mẫu có alen HLA-B thuộc loại hay gặp cộng đồng người châu Á Sau nhân gen vòng cho 45 mẫu nghiên cứu, sàng lọc 17 mẫu đạt yêu cầu cho nhân gen vòng 2, là: 39, 40, 41, 46, 48, 50, 54, 55, 57, 65, 66, 71, 72, 73, 78, 79, 83 Kết cho thấy băng xuất điện di sản phẩm nhân gen vòng Sản phẩm nhân gen vòng sử dụng cho nhân gen vòng 327 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017 Kết nh n gen HLA-B vòng để phát HLA-B*1502 Cặp mồi R2, F2 thiết kế đặc trưng để nhân gen HLA-B*1502 Để kiểm sốt tình trạng thất bại nhân gen vòng dẫn đến âm tính giả phản ứng nested-PCR, dùng thêm cặp mồi F3, R1 hỗn hợp nhân gen vòng Sản phẩm nhân gen vòng điện di gel agarose 2%: Hình 2: Kết nhân gen vòng mẫu dương tính vòng (M: marker 100 bp; dải lại: sản phẩm nhân gen vòng mẫu dương tính vòng 1) Mặc dù, hỗn hợp phản ứng nhân gen vòng có cặp mồi, gặp băng điện di sản phẩm tạo ra: băng F3, R1 có kích thước 298 bp; băng F2, R2 có kích thước 87 bp băng F2, R1 có kích thước 397 bp Băng F3, R1 (298 bp) gặp tất mẫu nhân gen vòng 2, băng kiểm sốt q trình nested-PCR Mẫu không xuất băng cần thực lại phản ứng nhân gen Băng F2, R1 (397bp) gặp mẫu có kiểu alen HLA-B*1502, HLAB*1521, HLA-B*1525 Băng F2, R2 (87 bp) xuất mẫu có kiểu alen HLA-B*1502 Như vậy, sản phẩm vòng xuất băng có kích thước 87 bp, 298 bp, 397 bp, xác định BN mang alen HLA-B*1502 328 Bằng kỹ thuật này, bước đầu xác định 7/45 mẫu nghiên cứu (15,5%) có kiểu alen HLA-B*1502, tương đương số công bố châu Á [3, , cao người châu Âu da trắng [5] KẾT LUẬN Đã chuẩn hóa thành cơng quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502 kỹ thuật nested-SSP-PCR phát 7/45 mẫunghiên cứu mang kiểu alen HLAB*1502 TÀI LIỆU THAM KHẢO Chung WH, Hung SI, Chen YT Human leukocyte antigens and drug hypersensitivity Curr Opin Allergy Clin Immunol 2007, 7, pp.317-323 Man CB, Kwan P, Baum L et al Association between HLA-B*1502 allele and antiepileptic drug-induced cutaneous TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 reactions in Han Chinese Epilepsia 2007, 48, pp.1015-1018 Locharernkul C, Loplumlert J, Limotai C et al Carbamazepine and phenytoin induced Stevens-Johnson syndrome is associated with HLA-B*1502 allele in Thai population Epilepsia 2008, 49, pp.2087-2091 Alfirevic A, Jorgensen AL, Williamson PR, Chadwick DW, Park BK, Pirmohamed M HLA-B locus in Caucasian patients with carbamazepine hypersensitivity Pharmacogenomics 2006, 7, pp.813-818 Ferrell PB Jr, McLeod HL Carbamazepine HLA-B*1502 and risk of Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: US FDA recommendations Pharmacogenomics 2008, 9, pp.1543-1546 Bunce M, O’Neill CM, Barnardo MC et al Phototyping: comprehensive DNA typing for HLA-A, B, C, DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 & DQB1 by PCR with 144 primer mixes utilizing sequence-specific primers (PCRSSP) Tissue Antigens 1995, 46, pp.355-367 Robinson J, Mistry K, McWilliam H, Lopez R, Parham P, Marsh SG The IMGT/HLA database Nucleic Acids Res 2011, 39, pp.1171-1176 329 ... HLA-B*1502 kỹ thuật nested-SSP-PCR để dự phòng phản ứng thuốc thể n ng BN sử dụng carbamazepine ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 45 mẫu máu chưa biết loại alen HLA-B chống... để phát phản ứng thuốc nặng: hội chứng Stevens- Johnson (hay nhiễm độc hoại tử) Trong HLA này, HLA-B*1502 marker di truyền có liên quan chặt chẽ tới phản ứng thuốc thể nặng dùng thuốc carbamazepine, ... mồi để sàng lọc [6 Một số kít thương mại nước ngồi lưu hành Việt Nam tiện giá thành cao Trước thực tiễn đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Chuẩn hóa quy trình sàng lọc alen HLA-B*1502