Xây dựng quy trình định lượng các flavonoid và acid clorogenic trong nữ lang (Valeriana hardwickii) bằng UHPLC-MS

Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS. Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam.

Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC FLAVONOID VÀ ACID CLOROGENIC TRONG NỮ LANG (VALERIANA HARDWICKII) BẰNG UHPLC-MS Huỳnh Lời*, Nguyễn Thùy Vi*, Trần Hùng** TÓM TẮT Mở đầu: Nữ lang (Valeriana hardwickii Wall Caprifoliaceae) dùng từ lâu y học cổ truyền để điều trị ngủ, chống co giật, chống mệt mỏi rối loạn chu kỳ kinh nguyệt Ngoài ra, dược liệu còn dùng ngồi để điều trị trùng đốt bệnh ngồi da Cho tới nay, cơng trình nghiên cứu Nữ lang chủ yếu phân tích thành phần bay Ngoài ra, thành phần khác phân lập iridoid, flavonoid, triterpen Về định tính, định lượng, chưa có nhiều tài liệu cơng bố Mục tiêu: Nghiên cứu tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng flavonoid có Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin acid clorogenic phương pháp UHPLC-MS Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam Nguyên liệu phương pháp: Nguyên liệu Nữ lang (V hardwickii) thu hái mọc hoang Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt vào tháng 4/2015 Nguyên liệu định danh cách so sánh mô tả hình thái thực vật với thông tin tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành Mẫu Valeriana officinalis thu thập vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng năm 2015 Hệ dung môi điều kiện MS tối ưu hóa Phương pháp đánh giá với tính tương thích hệ thống, tuyến tính, độ xác, độ đúng, LOD LOQ theo hướng dẫn ICH Kết quả: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a formic 0,1% acetonitril (B), gradient từ 90% A đến 5% A, thời gian phân tích 14 phút, tốc độ dòng 0,7 ml/phút nhiệt độ cột 30oC thể tích tiêm mẫu ml Điều kiện phân tích khối phổ thiết lập với thông số capillary voltage 0,8 kV; cone voltage 15 eV, nhiệt độ mao quản trì 350 ºC Tốc độ khí khử dung mơi (desolvation gas) 300 L/h Phổ khối chất phân tích ghi nhận chế độ ion dương (positive) Sắc kí đồ chất phân tích theo dõi hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 1001000) SIR (single ion recording) Chế độ SIR acid clorogenic m/z 355,31; rhoifolin m/z 579,52; neobudofficid m/z 739,69; linarin m/z 593,54 Tính tương thích hệ thống đạt với thông số thời gian lưu diện tích đỉnh pic nhỏ 2% Tính tuyến tính với R2 ~ 0,999 khoảng tuyến tính hợp chất có nồng độ 0,7-120 mg/ml Kết cho thấy có lặp lại phương pháp phân tích UHPLC-MS với RSD% < 5% Tỷ lệ phục hồi 99-106% Giới hạn phát a clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin 0,029; 0,0010; 0,00020; 0,015 mg/ml Acid clorogenic có phận V hardwickii bao gồm 1,76%, thân 8,23% rễ 1,68%, hàm lượng flavonoid V hardwickii bao gồm rhoifolin 0,86%, neobudofficid 0,19% linarin 1,95% Acid clorogenic rễ V officinalis định lượng với hàm lượng 5,3% 1,45% Kết luận: Phương pháp UHPLC-MS xây dựng đánh giá theo hướng dẫn ICH Các điều kiện phân tích thiết lập bao gồm điều kiện phổ khối, tính tương thích hệ thống tính * Trung Tâm Khoa Học Cơng Nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN), Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS TS Trần Hùng ĐT: 02838295641 Email: tranhung@uphcm.edu.vn ** 12 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học tuyến tính, độ lặp lại độ Hàm lượng hợp chất định lượng bao gồm acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin V hardwickii acid clorogenic V officinalis Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS ABSTRACT QUANTITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS AND CHLOROGENIC ACID IN VALERIANA HARDWICKII BY UHPLC-MS Huynh Loi, Nguyen Thuy Vi, Tran Hung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 12 – 23 Background and objectives: V hardwickii, “Nữ lang in Vietnamese”, are used in Vietnam as a traditional medicine with anti-convulsant, sedative, anti-fatigue, and anti-dysmenorrheal properties The topical uses of aerial parts are the treatment of insect bites and various skin diseases Volatile compounds were reported Flavonoids, iridoids, terpenoids are also isolated from Valeriana hardwickii The aim of this study was to develop the UHPLC-MS method for quantitative analysis of flavonoids including linarin, neobudofficide, rhoifolin and chlorogenic acid from Valeriana hardwickii Material and method: Nữ lang (Valeriana hardwickii) was collected in Cổng Trời (Bidoup - núi Bà), Đà Lạt in April 2015 V officinalis was colleced in Botanic Garden of Vetmeduni – Vienna in April 2015 The mobile phase and MS conditon were optimized The analytical method was validated for system suitability, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) according to International Council on Harmonization (ICH) Guidelines Results: The method was developed using mobile phase including formic acid 0.1% (A) – formic acid 0.1% in acetonitril (B), gradient from 90% A to 5% A, 14 run time, 0.7 ml/min flow rate, 30oC column temperature, ml injection volume MS condition were set as 0.8 kV capillary voltage; 15 eV cone voltage, 350 ºC capillary temperature, 300 L/h desolvation gas, ESI+-MS mode, full scan at m/z 100-1000, SIR (single ion recording) mode Chromatogram was recorded at m/z 355.31 for chlorogenic acid; at m/z 579.52 for rhoifolin; at m/z 739.69 for neobudofficid; and at 593.54 for linarin System is suitable for analysis with RSD of retension time and peak area below 2% The method was found to be linear within the ranges of 0.7-120 mg/ml and R2 ~ 0,999 The precision was determined with RSD < 5% The LOD was 0.029; 0.0010; 0.00020; and 0.015 mg/ml for chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin respectively The recovery ranged 99-106% The content of chlorogenic acid is 1.76%, 8.23% and 1.68% in leaves, stems and roots, respectively The content of flavonoids in leaves including rhoifolin, neobudofficid, and linarin is 0.86%, 0.19% and 1.95%, respectively Acid clorogenic from the roots and leaves of V officinalis was also determined with the content of 5.3% and 1.45%, respectively Conclusions: The UHPLC-MS method was successfully developed and validated The MS condition was optimized System suitability, linearity, range, precision, recovery was determined The content of chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin in Valeriana hardwickii was also determined Chlorogenic acid in V officinalis was successful quantitative Key words: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS xếp vào họ Caprifoliaceae (họ Cơm cháy)(21,22) ĐẶT VẤNĐỀ Ở châu Á, chi Valeriana có lồi V Chi Valeriana trước thuộc họ pseudofficinalis, V fauriei, V jatamansi, V Valerianaceae (họ Nữ lang) hardwickii, Nardostachys jatamansi(2,3,18,19) Ở Chuyên Đề Dược 13 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 nước ta có lồi: V hardwickii (Nữ lang) V jatamansi (Sì to)(22) Thành phần hóa học chi Valeriana yếu chứa tinh dầu, iridoid (valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid phenol, lignan, alkaloid Ngồi có amino acid (arginin, GABA, glutamin, tyrosin), acid béo, cholin chất vô khác(10) Trên giới V hardwickii mọc Ấn Độ, Trung Quốc, Mianma, Malaysia, Indonesia Ở nuớc ta, Nữ lang (V hardwickii) mọc Ơ Q Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn, Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh), Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt)(8) Cho đến nay, nghiên cứu hố học lồi V hardwickii khơng nhiều Năm 1989, Đỗ Ngọc Thanh cộng phân lập thành phần từ V hardwickii ký hiệu N1, N2 chưa xác định cấu trúc(9) Thành phần tinh dầu V hardwickii var arnottiana valeracetat hàm lượng tinh dầu 0,3%(20) Tinh dầu V hardwickii mọc Hymalaya thành phần methyl linoleate(16) Tinh dầu Valeriana hardwickii Việt nam có thành phần chủ yếu bornyl acetat(13) Về phân lập, có cơng trình nghiên cứu Epoxysesquithujen phân lập tinh dầu V hardwickii var hardwickii(6) Các chất sitosterol, daucosterol, syzalterin, 6-methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'dimethoxyflavon, genkwanin, acacetin, apigenin, quercetin, tricin, farrerol, sosakuranetin; 5,3',4'-trihydroxy-7methoxyflavanon, linarin, neobudofficid, neodiosmin, rhoifolin, valeclorin, isovaleroxy valtrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic, bornyl ferulat, bornyl caffeat phân lập từ V hardwickii(5,12) Cho đến nay, có cơng trình nghiên cứu tác dụng sinh học V hardwickii Cao chiết thân rễ V hardwickii gây ức chế phụ thuộc nồng độ co thắt tự phát hay co thắt gây kali ruột chay thỏ, thể tác dụng chống co thắt(1) Các cao chiết từ V hardwickii bao gồm cao 14 nước, cao ethanol 45% cao DCM có tác dụng an thần, giải lo âu (1) Thử nghiệm dòng tế bào NB18TG2, linarin isovaleroxy valtrat hydrin phân lập từ V hardwickii khơng có độc tính dòng tế bào (14) Theo y học cổ truyền, Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác động vào kinh: tâm, can Cây có tác dụng ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông kinh (8) Hoạt chất từ thân rễ dùng làm thuốc thần kinh tim, chống co thắt; dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dày, điều kinh, sốt trẻ em (23) Ở Ấn Độ, thân rễ V hardwickii dùng thân rễ V officinalis để chữa hysteria, động kinh, chứng múa giật, chứng loạn thần kinh, chấn thương thời chiến, chứng loạn thần kinh chức Thân rễ dùng để làm hương liệu Ở Trung Quốc, toàn thân rễ dùng trị thần kinh suy nhược ngủ; có nơi dùng trị kinh nguyệt khơng đều, đòn ngã tổn thương phong thấp đau xương(22) Ở Pakistan, Miến Điện Srilanka, V hardwickii sử dụng để làm gia vị làm thuốc Nữ lang dùng làm thuốc tốt mồ hơi, phòng bệnh phát lại có định kỳ, chất kích thích, thuốc bổ não, thuốc chống động kinh, thuốc tẩy giun, thuốc an thần, lợi tiểu, thuốc kích thích tình dục, thuốc điều kinh, chống co thắt, trị tiêu chảy(1) Nữ lang V hardwickii dùng với liều 10 g hãm với 100 ml nước sôi, để nguội uống ngày nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4 g/ ngày, thái nhỏ dược liệu, ngâm cồn 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha lỗng, ngồi dùng dạng cao mềm, ngày dùng 1-4 g(8) Cho đến nay, cơng trình nghiên cứu phân tích định lượng thành phần Valeriana hardwickii chưa đuợc công bố Cơng trình nghiên cứu lần cơng bố định lượng flavonoid, acid clorogenic V hardwickii UHPLC-MS Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học NGUYÊNLIỆU -PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU acetonitril tỷ lệ cho tách độ cân Nguyênliệu đối đỉnh đạt yêu cầu định lượng Nguyên liệu Nữ lang (V hardwickii) thu hái mọc hoang Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt Nguyên liệu định danh cách so sánh mơ tả hình thái thực vật với thông tin tài liệu tham khảo thực vật học chuyên ngành(8) Mẫu Nữ lang V hardwickii thu hái 4/2015 lưu Bộ môn Dược liệu, Khoa dược, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh số lưu mẫu 01-BMDL Mẫu Valeriana officinalis thu thập vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng năm 2015 Mẫu lưu Viện thực vật ứng dụng dược liệu (Applied Botany and Pharmacognosy) thuộc trường Vetmeduni với số lưu IAB2012-VAL01 Dung môi, hóa chất Các điều kiện sắc ký khảo sát hai kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) chương trình dung mơi (gradient) để chọn điều kiện sắc ký có phân tách pic Khảo sát điều kiện MS Điều kiện MS điều chỉnh thủ cơng cho ion hóa tốt Các thơng số thăm dò bao gồm điện cone (cone voltage), điện mao (capillary voltage), nhiệt độ mao quản, phương thức chọn ion (positive hay negative) Khảo sát tính tương thích hệ thống Tiến hành: tiêm lần liên tiếp mẫu đối chiếu có nồng độ, điều kiện Yêu cầu: RSD thời gian lưu; diện tích pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số bất đối (AF) từ 0,5-1,5 độ phân giải pic cần định lượng Rs ≥ 1,5(4,7) Acid formic, acetonitril cung cấp bời Merck (Đức) Acid clorogenic cung cấp Merck (Đức), rhoifolin, neobudofficid linarin hợp chất đối chiếu phân lập nghiên cứu trước đây(12), độ tinh khiết HPLC 97,2%, 99,2% 98,4% Tính đặc hiệu Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử mẫu thử thêm chất đối chiếu Trang thiết bị nghiên cứu sắc ký đồ mẫu đối chiếu Sắc ký đồ Hệ UHPLC Waters® model Acquity® Hclass với đầu dò MS QDa (REF186006511), cột Cortes® C18 (50 × 4,6 mm, 2,7 µm) Phần mềm Empower mẫu thử có pic có thời gian lưu tương Phương pháp nghiên cứu chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu Tính tuyến tính Sắc ký đồ mẫu trắng khơng có tín hiệu thời gian lưu pic cần định lượng ứng với sắc ký đồ mẫu đối chiếu Khi thêm lượng chất đối chiếu vào mẫu thử có tăng diện tích pic tỷ số diện tích pic Khảo sát dung môi MeOH Pha hợp chất cần định lượng với nồng độ khác nhau, điều kiện nhiệt độ, MeOH để có dung dịch với nồng độ tăng dần thời gian chiết số lần chiết cho điều Tiến hành sắc ký theo điều kiện chọn kiện chiết cho hiệu suất chiết cao Khảo sát pha động kỹ thuật rửa giải Khảo sát hai dung môi acid formic Kết đánh giá cách tính đường hồi qui dựa vào phương pháp bình phương tối thiểu, phương trình ŷ= ax 0,1% MeOH acid formic 0,1% Chuyên Đề Dược 15 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Yêu cầu: có tương quan tuyến tính diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn hóa) với nồng độ chất đối chiếu khoảng nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995 Độ lặp lại Thực định lượng dịch chiết mẫu thử khác Độ lặp lại đánh giá Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Hai giới hạn tính tỷ lệ tín hiệu (S) với tín hiệu nhiễu đường (N) LOD LOQ tính tốn theo tỷ lệ S/N=3/1 10/1 theo thứ tự dựa theo kết thực nghiệm Áp dụng quy trình định lượng dựa vào RSD hàm lượng chất phân Sau xây dựng quy trình định lượng, tích có bột Nữ lang Mỗi mẫu định quy trình áp dụng để định lượng lượng lần, lấy kết trung bình thành phần có thân rễ Nữ lang Độ (V hardwickii) rễ V (7) Độ tỷ lệ phục hồi nồng độ officinalis chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối KẾT QUẢ chiếu thêm vào Thêm vào mẫu thử dược liệu lượng chất đối chiếu 10%, 20%, 30% so với hàm lượng chất phân tích có mẫu thử, tiến hành định lượng nồng độ, nồng độ Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu Khảo sát dung môi chiết Dung môi chiết đuợc khảo sát với phần trăm MeOH khác Kết cho thấy thực mẫu Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi khoảng 90 – MeOH 40% cho hiệu suất chiết cao nhất, dung môi MeOH 40% dùng để chiết 107%(11) thành phần định lượng từ Nữ lang Bảng 1: Diện tích đỉnh polyphenol dung môi chiết khảo sát quy trình định lượng Hợp chất Acid clorogenic Rhoifoolin Neobudofficid Linarin MeOH 10% 3061530 210245 16917 454553 MeOH 20% 2721360 194555 18646 341823 Khảo sát số lần chiết MeOH 40% 3401700 209199 18590 363642 MeOH 60% 3571785 173635 15244 338187 MeOH 80% 3061530 215475 16359 316369 MeOH 100% 3231615 171899 18962 356369 Khảo sát thời gian chiết Kết khảo sát số lần chiết cho thấy chiết Thời gian chiết 30 phút chọn để lần chọn để chiết hợp chất cần định chiết cho diện tích đỉnh cao so với lượng Nữ lang chiết 15 phút gần tương đương với Bảng 2: Diện tích đỉnh polyphenol số lần chiết khảo sát qui trình định lượng chiết 45 phút Hợp chất Lần Tỷ lệ % Tỷ lệ % Lần Lần chiết chiết lần lần Acid 3402031 187110 clorogenic Rhoifoolin 2092002 125520 Neobudofficid 18605 1302 Linarin 364110 14564 16 34020 5,16 0,94 29288 205 10923 5,59 6,48 3,74 1,30 1,02 2,80 Bảng 3: Diện tích đỉnh polyphenol thời gian chiết khảo sát quy trình định lượng Hợp chất Acid clorogenic Rhoifoolin Neobudofficid Linarin 15 phút 3401120 30 phút 3571176 45 phút 3407922 2092110 18701 365210 2133952 18906 373244 2194202 18988 376166 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Khảo sát nhiệt độ chiết Nhiệt độ chiết đuợc khảo sát 30oC, 40oC 50oC Kết cho thấy nhiệt độ 40oC cho hiệu chiết cao 30oC tương đương với 50oC Vậy, nhiệt độ 40oC thích hợp cho quy trình chiết Bảng 4: Diện tích đỉnh polyphenol nhiệt độ chiết khảo sát quy trình định lượng Hợp chất Acid clorogenic Rhoifoolin Neobudofficid Linarin 30oC 3401800 2092528 18705 365283 40oC 3571890 2094621 19078.84 381355.5 50oC 3575292 2098806 19452.93 383181.9 Sau khảo sát dung môi chiết, số lần chiết, thời gian chiết nhiệt độ chiết Quy trình chiết thiết lập sau: Cân xác khoảng 100 mg bột Nữ lang cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp, thêm 10 ml MeOH 40%, siêu âm (mức lượng 100%) nhiệt độ 40 oC vòng 30 phút, lọc, bã chiết lần với 10 ml MeOH 40%, gộp dịch lọc, cho dịch lọc thu vào bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi cho đủ thể tích, lọc qua màng lọc PTTE 0,22 µm trước phân tích UHPLC Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải Sau khảo sát điều kiện sắc ký, chương trình rửa giải xây dựng sau: Nghiên cứu Y học Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a formic 0,1% acetonitril (B) Chương trình rửa giải gradient thể Bảng Tốc độ dòng 0,7 ml/phút nhiệt độ cột 30oC thể tích tiêm mẫu ml Bảng 5: Chương trình rửa giải quy trình định lượng Pha động 90% A 90% 78% A 78%  75% A 75% A 75%  5% A 5% A Thời gian 0-2 phút 2-3 phút 3-5 phút 5-7 phút 7-9 phút 9-14phút Khảo sát điều kiện MS Điều kiện phân tích khối phổ thiết lập với thông số capillary voltage 0,8 kV; cone voltage 15 eV, nhiệt độ mao quản trì 350oC Tốc độ khí khử dung mơi (desolvation gas) 300 L/h Phổ khối chất phân tích ghi nhận chế độ ion dương (positive) Sắc kí đồ chất phân tích theo dõi hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100-1000) SIR (single ion recording) Chế độ SIR acid clorogenic m/z 355,31; rhoifolin m/z 579,52; neobudofficid m/z 739,69; linarin m/z 593,54 Khảo sát tính tương thích hệ thống Bảng 6: Kết khảo sát tính tương thích hệ thống quy trình định lượng Thành phần Acid clorogenic (30 mg/ml) Rhoifolin (18,75 mg/ml) Neobudofficid 3,75 mg/ml) Linarin 30 mg/ml) Chuyên Đề Dược tR (phút) TB RSD% TB RSD% TB RSD% TB RSD% 1,989 0,04 5,829 0,02 7,11 0,07 7,846 0,05 STB (àV ì s) 3787040 0,73 3182400 0,73 728291 0,89 7998000 1,57 N (biểu kiến) 7817 106680 160595 84759 k’ α Rs 3,3 11,7 1,13 1,04 2,86 14,5 16,1 As 1,12 1,10 1,04 2,63 1,13 17 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Hình 1: Sắc ký đồ chế độ SIR phổ khối hợp chất tương ứng 18 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học Tính đặc hiệu Hình 2: Sắc ký đồ (SIR) khảo sát tính đặc hiệu quy trình định lượng Chuyên Đề Dược 19 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Tính tuyến tính Bảng 7: Mối tương quan nồng độ diện tích đỉnh chất i chiu Acid clorogenic STB C (àg/ml) (àVìs) 120 14978010 60 7544520 30 3787048 15 1893524 7,5 1074029 Rhoifolin C (µg/ml) 75 37,5 18.75 9,38 4,69 Neobudofficid STB C (µg/ml) (àVìs) 15 2780080 7,5 1425682 3,75 728291 1,88 367899 0,938 182169 STB (àVìs) 11991988 6295994 3182499 1610227 829839 Kt qu cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ diện tích đỉnh với R2~0,999 khoảng tuyến tính chất phân tích thể Bảng Linarin C (àg/ml) 120 60 30 15 7,5 STB (àVìs) 31876180 15998040 7999020 4031245 1908647 Sau xét hệ số hồi quy, phương trình tuyến tính thể Bảng Bảng 8: Phương trình tuyến tính Hợp chất Acid clorogenic Rhoifolin Neobudofficid Linarin Phương trình tuyến tính ŷ = 124100x ŷ = 158817x ŷ = 184350x ŷ = 265886x Khoảng tuyến tính (mg/ml) 7,5 - 120 4,69 – 75 0,938 – 15 7,5 - 120 R2 0,9999 0,9994 0,9998 0,9995 Độ lặp lại Bảng 9: Kết khảo sát độ lặp lại quy trình định luợng (n=6) Hợp chất A clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin Hàm lượng (%) (khối lượng/khối lượng) 1,76±0,03 (RSD = 1,61) 0,86±0,02 (RSD = 2,07) 0,19±0,005 (RSD = 2,42) 1,95±0,096 (RSD = 4,95) Kết cho thấy có lặp lại phương pháp phân tích UHPLC-MS với RSD% < 5% Như vậy, phương pháp đạt độ lặp lại Khảo sát độ Tất đỉnh cần định lượng có tỷ lệ phục hồi giới hạn từ 97 – 105% Bảng 10: Kết khảo sát tỷ lệ phục hồi quy trình định lượng (n=9) Tên hợp chất Acid clorogenic Rhoifolin Neobudofficid Linarin 10% 101,1 101,5 101,3 103,4 Tỷ lệ phục hồi 20% 30% 99,9 104,5 99,3 103,2 102,5 98,2 102,6 97,5 RSD 2,3 1,9 2,0 3,2 Khảo sát giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) Hình 3: Sắc ký đồ (SIR) khảo sát LOD quy trình định lượng 20 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Kết khảo sát LOD LOQ trình bày Bảng 11 Trong polyphenol định lượng, neobudofficid có LOD thấp với nồng độ 0,0002 mg/ml Bảng 11: Kết khảo sát LOD LOQ quy trình định lượng A Rhoifolin Neobudofficid Linarin clorogenic (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) LOD 0,029 0,0010 0,00020 0,015 LOQ 0,097 0,0033 0,00067 0,050 Hàm lượng hợp chất phân tích Nghiên cứu Y học Bảng 12: Hàm lượng (%) hợp chất V hardwickii A clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin 1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096 Ghi chú: Hàm lượng tính bằng% (khối lượng/khối lượng), n=6 Bảng 13: Hàm lượng (%) acid clorogenic V hardwickii V officinalis Lá Thân Rễ Lá Rễ V V V V V hardwickii hardwickii hardwickii officinalis officinalis 1,76±0,03 8,23±0,13 1,68±0,03 5,30±0,09 1,45±0,02 Ghi chú: Hàm lượng tính % (khối lượng/khối lượng), n=6 Hình 4: Sắc ký đồ (SIR) acid clorogenic V hardwickii V officinalis Chuyên Đề Dược 21 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 BÀNLUẬN Phương pháp UHPLC với đầu dò MS single quadrupole ACQUITY® QDa chưa áp dụng phổ biến Một vài cơng trình cơng bố với đầu dò bao gồm phân tích acid amin (phenylalanin, tyrosin, tryptophan, kynurenin) chuột , phân tích (15) peptid (bleomycin sulfat, tyrothricin, vancomycin HCl, bacitracin)(17) Đầu dò dùng để theo dõi phản ứng, xác định tạp thuốc, xác định thuốc trừ sâu, flavonoid nuớc ép trái cây, cao chiết thấm qua da(24) Lần đầu tiên, phương pháp áp dụng định lượng thành phần Valeriana hardwickii định lượng acid clorogenic V officinalis 10 Phương pháp xây dựng với thời gian phân tích ngằn (dưới 10 phút) Trong nghiên cứu 11 này, hệ dung môi thăm dò cho tách acid clorogenic khỏi đồng phân nó, 12 điều thể pic đồng phân sắc ký đố (Hình 4), việc thăm dò tốn nhiều thời 13 gian thừ với nhiều hệ dung môi KẾT LUẬN Phương pháp UHPLC-MS xây dựng đánh giá theo hướng dẫn ICH Hàm lượng hợp chất V hardwickii định lượng với acid clorogenic có 1,76%, thân 8,23% rễ 1,68%, hàm lượng flavonoid bao gồm rhoifolin 0,86%, neobudofficid 0,19% linarin 1,95% Acid clorogenic rễ V officinalis đuợc định lượng với hàm lượng 5,30% 1,45% 14 15 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 Bashir S, et al (2011), "Antispasmodic and Antidiarrheal Activities of Valeriana hardwickii Wall Rhizome Are Putatively Mediated through Calcium Channel Blockade" Evid Based Complement Alternat Med 2011: pp 304960 17 Bell CD (2007), "Phylogenetic placement and biogeography of the North American species of Valerianella (Valerianaceae: Dipsacales) based on chloroplast and nuclear DNA" Molecular Phylogenetics and Evolution 44(3): pp 929-941 Bell CD, et al (2005), "Phylogeny and biogeography of Valerianaceae (Dipsacales) with special reference to the South American Valerians" Organisms Diversity & Evolution 5(2): pp 147-159 Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV NXB Y Học Chai SW, et al (2015), "Chemical constituents from whole plants of Valeriana hardwickii" Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 40(20): pp 4007-11 Chandra SM, et al (2007), "Epoxysesquithujene, a novel sesquiterpenoid from Valeriana hardwickii var hardwickii" Fitoterapia 78(4): pp 279-282 Đặng Văn Hòa, et al (2011), Kiểm nghiệm thuốc Hà Nội: NXB Giáo dục Việt Nam Đỗ Huy Bích, et al (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Hà Nội: NXB Khoa Học Kỹ Thuật Đỗ Ngọc Thanh, et al (1989), "Sơ nghiên cứu trình tách, chiết valepotriat từ rễ Nữ lang" Tạp chí Dược học 2: pp 19-20,26 Houghton PJ (1997), Valerian: The Genus Valeriana Medicinal and Aromatic Plants - Industrial Profiles, ed Roland Hardman Vol Amsterdam - The Netherlands: Harwood Academic, pp.142 Huber L, (2007) Regulations, Standards and Guidelines, in Validation and Qualification in Analytical Laboratories, Second Edition., CRC Press p 9-24 Huynh L, et al (2016), "Iridoids and flavonoids from Valeriana hardwickii Wall" Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 5(3): pp 245 Huynh L, et al (2013), "Comparative analysis of the essential oils of Valeriana hardwickii Wall from Vietnam and Valeriana officinalis L from Austria" Journal of Essential Oil Research 25(5): pp 409-414 Huỳnh Lời, et al (2015), "Nghiên cứu Nữ lang Hardwicke III – Độc tính dòng tế bào thần kinh isovaleroxyvaltrat hydrin linarin phân lập từ Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall Valerianaceae) tác dụng chống oxy hoá Valeriana hardwickii Valeriana officinalis" Chuyên đề Dược, Y Học TP Hồ Chí Minh Phụ 19(3): tr 574-580 Jaroslav G, et al (2016), "Quantitative analysis of phenylalanine, tyrosine, tryptophan and kynurenine in rat model for tauopathies by ultra-high performance liquid chromatography with fluorescence and mass spectrometry detection" Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 117: pp 85-90 Jayashankar D, et al (2011), "Volatile Constituents of Valeriana hardwickii Wall Root Oil from Arunachal Pradesh, Eastern Himalaya" Records of Natural Products 5(1): pp 70-73 Matthias DH, et al (2016), "Implementation of a single quad MS detector in routine QC analysis of peptide drugs" Journal of Pharmaceutical Analysis 6(1): pp 24-31 Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 18 Meyer FG (1965), "New species of Valeriana from Colombia, Ecuador, and Peru" Brittonia 17: pp 112120 19 Meyer FG (1979), "A new species of Valeriana (Valerianaceae) from Venezuela" Brittonia 31(1): pp 101-103 20 Sati S, et al (2005), "Essential oil composition of Valeriana hardwickii var arnottiana from the Himalayas" Flavour and fragrance journal 20: pp 299-301 21 Takhtajan A (2009), Flowering plants Springer Science & Business Media 22 Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng Hà Nội: NXB Khoa Học - Kỹ Thuật Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học 23 Võ Văn Chi (2010), Tự điển thuốc Việt Nam Hà Nội: NXB Y Học 24 Xiaodong B, et al (2016), "The emergence of low-cost compact mass spectrometry detectors for chromatographic analysis" TrAC Trends in Analytical Chemistry 82: pp 22-34 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 23 ... thực nghiệm Áp dụng quy trình định lượng dựa vào RSD hàm lượng chất phân Sau xây dựng quy trình định lượng, tích có bột Nữ lang Mỗi mẫu định quy trình áp dụng để định lượng lượng lần, lấy kết... lại độ Hàm lượng hợp chất định lượng bao gồm acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin V hardwickii acid clorogenic V officinalis Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS ABSTRACT... KẾT LUẬN Phương pháp UHPLC-MS xây dựng đánh giá theo hướng dẫn ICH Hàm lượng hợp chất V hardwickii định lượng với acid clorogenic có 1,76%, thân 8,23% rễ 1,68%, hàm lượng flavonoid bao gồm rhoifolin