Estrogens là những chất gây phân bào trên loại tế bào ung thư vú có Estrogen receptor (ER)-positive. Phương pháp điều trị hiện thời đối với ung thư vú có ER-positive là trực tiếp ngăn cản hoạt động của estrogen. Chúng tôi báo cáo rằng: điều trị những loại tế bào ung thư vú có ER-positive với Kaempferol dẩn tới sự giảm số lượng tế bào tỉ lệ với nồng độ và thời gian. Nồng độ cần thiết để ức chế 50% tăng trưởng tế bào ở 48 giờ là khoảng 35 M và 70 M cho tế bào ung thư vú loại ER-positive và loại ER-negative. Đối với dòng tế bào MCF-7, mRNA của ER- giảm 50;12 và 10% so với nhóm đối chứng được ghi nhận ở 24 giờ sau khi điều trị tương ứng với với nồng độ 17,5; 35 và 70 M kaempferol.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2004 Nghiên cứu Y học 13 KAEMPFEROL ỨC CHẾ SỰ BIỂU HIỆN VÀ CHỨC NĂNG CỦA ESTROGEN RECEPTOR ALPHA Huỳnh Thanh Hòa*, Huỳnh Hùng* TÓM TẮT Estrogens chất gây phân bào loại tế bào ung thư vú có Estrogen receptor (ER)-positive Phương pháp điều trò thời ung thư vú có ER-positive trực tiếp ngăn cản hoạt động estrogen Chúng báo cáo rằng: điều trò loại tế bào ung thư vú có ER-positive với Kaempferol dẩn tới giảm số lượng tế bào tỉ lệ với nồng độ thời gian Nồng độ cần thiết để ức chế 50% tăng trưởng tế bào 48 khoảng 35 μM 70 μM cho tế bào ung thư vú loại ER-positive loại ER-negative Đối với dòng tế bào MCF7, mRNA ER-α giảm 50;12 10% so với nhóm đối chứng ghi nhận 24 sau điều trò tương ứng với với nồng độ 17,5; 35 70 μM kaempferol Đồng thời, điều trò dẩn tới 58; 80 85% mức độ giảm biểu protein ER-α Tác động ức chế Kaempferol ER-α thấy sớm, sau điều trò Điều trò Kaempferol dẩn tới giảm mức độ biểu progesterone receptor (PgR), Cyclin D1, isulin receptor subtrate (IRS-1) Nghiên cứu hóa miễn dòch tế bào cho thấy protein ER-α tế bào MCF-7 điều trò với kaempferol bò kết tụ lại nhân tế bào Kaempferol làm gia tăng thoái hóa ER-α chế khác, khác với chế mà chất kháng estrogen ICI 182,780 estrogen Sự tăng sinh dòng tế bào MCF-7 hoạt hóa estradiol bò ức chế điều trò với kaempferol Những khám phá gợi ý điều chỉnh mức độ biểu hoạt tính ER-α kaempferol góp phần giải thích cho khả ức chế tăng sinh tế bào quan sát vitro SUMMARY INHIBITION OF ESTROGEN RECEPTOR ALPHA EXPRESSION AND FUNCTION IN MCF-7 CELLS BY KAEMPFEROL Huynh Thanh Hoa, Huynh Hung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol * Supplement of No * 2004: 97 – 104 Estrogens are mitogenic for estrogen receptor (ER)-positive breast cancer cells Current treatment of ERpositive breast tumours is directed towards interruption of estrogen activity We report that treatment of ERpositive breast cancer cells with kaempferol resulted in a time- and dose-dependent decrease in cell number The concentration required to produce 50% growth inhibition at 48 h was approximately 35 and 70 μM for ERpositive and ER-negative breast cancer cell lines For MCF-7 cells, a reduction in the ER-alpha mRNA equivalent to 50%, 12%, 10% of controls was observed 24 h after treatment with 17.5, 35.0 and 70.0 μM of kaempferol, respectively Concomitantly, these treatments led to a 58%, 80% and 85% decrease in ER-alpha protein The inhibitory effect of kaempferol on ER-alpha levels was seen as early as h post-treatment Kaempferol treatment also led in a dose-dependent decrease in the expression of progesterone receptor (PgR), cyclin D1 and insulin receptor substrate (IRS-1) Immunocytochemical study revealed that ER-alpha protein in kaempferol-treated MCF-7 cells formed an aggregation in the nuclei Kaempferol also induced degradation of ER-alpha by a different pathway than that observed for the antiestrogen ICI 182,780 and estradiol * Laboratry of Molecular Endocrinology, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancerr Centre of Singapore, Singapore Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV Bình Dân 2004 97 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2004 Estradiol-induced MCF-7 cell proliferation was abolished in cells co-treated with kaempferol These findings suggest that modulation of ER-alpha expression and function by kaempferol may be, in part, responsible for its anti-proliferative effects seen in in vitro nhiều rau làm giảm tỉ lệ nhiều loại ung ĐẶT VẤN ĐỀ thư18,19 Flavonoid hợp chất đa phân tử có Estrogen receptor (ER)-α đóng vai trò thiết nhiều loại rau quả20-22 Các flavonoid thường yếu tiến triển ung thư vú hormone gặp rau quercetin, kaempferol, rutin liệu pháp Estrogen chứng minh chất gây robinin23; đó, quercetin nghiên cứu phân bào tế bào ung thư vú có ER-positive1-4 cách rộng rãi nhất24-26 Các flavonoid (quercetin, Ung thư vú nguyên phát nử phần lớn có ER- kaempferol) có họat tính qua chế tương tác đòi hỏi có estrogen cho họat động phân bào làm khối với ER27,28, type II estrogen binding site aryl u tăng trưởng Họat tính sinh học estrogen hydrocarbon receptor29,30 Kaempferol họat tương tác đặc hiệu lọai thụ thể chuyên động chất đồng vận estrogen biệt: ERs, ER-α ER- β cách gây phiên mã2,5,6 chất ức chế tăng trưởng tùy vào nồng độ sử Ngoài estrogen, yếu tố tăng trưởng dụng Với nồng độ thấp (1-10 μM), kaempferol đồng insulin-like growth factor I (IGF-1), epidermal growth vận với estrogen làm tăng tăng trưởng dòng tế factor (EGF), transforming growth factor α có bào ung thư vú MCF-7, tăng tổng hợp DNA kích thể hoạt hóa ER3,4,7,8 Estrogen hoạt hóa Akt qua hoạt estrogen-response gene Với nồng độ cao (20-90 trung gian chế ErbB3,4, điều hòa hoạt hóa μM), kaempferol ức chế tổng hợp DNA tăng gene liên quan tăng trưởng biệt hóa tế bào trưởng tế bào MCF-728 Kaempferol làm thoái 4,8-14 EGF, IGF-I receptor chúng hóa DNA, đồng thời gây lipid peroxidation31 In Hơn nửa, estrogen làm gia tăng mức độ tăng vivo, kaempferol có đặc tính estrogenic trưởng cách đưa tế bào vào chu trình tế bào, làm uterotrophic tử cung chuột 32 ngắn thời gian chu trình làm giảm độ dài Trong nghiên cứu này, báo cáo pha G115 điều trò lọai tế bào ung thư vú với nồng độ Liệu pháp hormone hành cho loại u vú có 17,5; 35 70 μM kaempferol cho hiệu ức ER-positive trực tiếp làm gián đọan estrogen chế tăng trưởng tỉ lệ thuận với nồng độ Kaempferol cách cắt buồng trứng sử dụng chất đối kháng ức chế biểu ER-α, làm thoái hóa ER-α gây kết estrogen2 Thuốc đối kháng estrogen tamoxifen làm tụ ER-α Đồng thời kaempferol làm họat làm kéo dài tiên lượng sống bệnh nhân ung thư tính estrogen dòng tế bào MCF-7 Biểu vú có khả phòng ngừa ung tư vú gene phụ thuộc estrogen IRS-1, điều trò u vú có ER-positive di căn2,6 Chất đối kháng cyclin D1 PgR bò ức chế kaempferol Vì estrogen ICI ức chế chức ER cách protein ER-α, IRS-1 cyclin D1 đóng vai trò làm thoái hóa protein ER- α16 Những chất đối kháng quan trọng hình thành tăng sinh tế bào estrogen chứng minh có khả ức chế ung thư vú, tính chất khám phá có tăng trưởng tế bào ung thư vú cách cạnh thể ghóp phần giải thích cho khả chống tăng tranh với estrogen receptor 2,6 Ung thư vú sinh tế bào kaempferol kháng tamoxifen đáp ứng tốt với ICI 182,78017 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN Nhiều chất đối kháng estrogen thử CỨU: nghiệm lâm sàng2 Nghiều nghiên cứu dòch tể học cho thấy mối liên hệ chế độ ăn uống và ung thư, đặc biệt ăn 98 Thymidine incorporation assays Những dòng tế bào ung thư vú người có ER- Chuyên đề Hội nghò Khoa học Kỹ thuật BV Bình Dân 2004 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập * Phụ Số * 2004 Nghiên cứu Y học positive (MCF-7, T47D ZR-75) ER-negative (MDA 231) nuôi đơn lớp 10% FBS αMEM với mật độ x 104 đóa 24 well Sau 48 loại đóa rửa hai lần với serumfree α-MEM ủ tiếp 24 với 2,5% charcoal dextrane treated FBS (assay medium) α-MEM sát Laser confocal microscope có bò kính epifluorescence Phát ER-α ubiquination vitro KẾT QUẢ Dòng tế bào MCF-7 trì 2,5% charcoal dextran-treated FBS medium 24 Tế bào điều trò với chất ức chế lysosyme (chloroquin 100 μM) chất ức chế proteasome (lactacystin 20 μM), sau tế bào tiếp tục điều trò với ICI 182,780; estradiol kaempferol Khảo sát Northern blot Tế bào ly giải dung dòch TRIzol tiến trình phân tách RNA tiến hành theo dẩn nhà sản xuất Mỗi mẫu có hàm lượng RNA phân tách gel 1% agarose sau blot lên màng nylon12 cDNA ER-α người đánh dấu với [α32P]dCTP Khảo sát Western blot Tế bào sau nuôi cấy điều trò ly giải với dung dòch ly giải Mỗi mẫu có hàm lượng protein thực phân tích western blot33 Sau màng ủ với kháng thể thích hợp nhiệt độ 4oC 12 Sau màng rửa tiếp tuc ủ với horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-mouse antirabbit secondary antibody Sau rửa, màng xử lý hóa quỳnh quang Đònh vò miễn dòch ER-α Tế bào sau nuôi cấy điều trò 8champer slide cố đònh với 4% formalin PBS Slide nhuộm với mouse antihuman-ER-α (pha loãng 1:100) nhiệt độ 4oC 14 Kế tiếp slide ủ với rabbit anti-mouse FITC conjugated secondary antibody nhiệt độ phòng Kết quan Phân tích thống kê Sự khác biệt số lượng tế bào mức độ protein phân tích hàm ANOVA Hình cho thấy số lượng tế bào mức độ tổng hợp DNA loại tế bào MCF-7, T47D, ZR-75 MDA 231 Tế bào sống nhuộm với trypane blue đếm hemocytometry thực 24 48 sau điều trò với kaempferol (P