Đề tài nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu nêu lên một trong những khó khăn trong công tác kiểm nghiệm felodipin là vấn đề chất chuẩn tạp vì có giá rất cao và khó mua. Do vậy, mục tiêu của đề tài này là tổng hợp 3 chuẩn tạp A, B và C của felodipin nhằm cung cấp cho viện kiểm nghiệm thuốc và Hội Đồng Dược Điền Việt Nam.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học TỔNG HỢP CÁC CHẤT CHUẨN TẠP FELODIPIN Nghiêm Thoại Vân*, Trần Bội Châu**, Trần Thành Đạo*, Lê Minh Trí* TĨM TẮT Mục tiêu: Một khó khăn công tác kiểm nghiệm felodipin vấn đề chất chuẩn tạp có giá cao khó mua Do vậy, mục tiêu đề tài tổng hợp chuẩn tạp A, B C felodipin nhằm cung cấp cho viện kiểm nghiệm thuốc Hội Đồng Dược Điền Việt nam Phương pháp: tổng hợp tạp chất felodipin A, B C tinh chế phương pháp sắc ký cột kiểm tra độ tinh khiết phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tạp chất A tổng hợp từ felodipin cách oxy hóa acid nitric giá mang silicagel Tạp B C tổng hợp theo phản ứng Hantzsch qua giai đoạn: tạp chất B tổng hợp từ 2,3-diclorobenzaldehyd methyl acetoacetat methyl crotonat Tạp chất C tổng hợp từ 2,3- diclorobenzaldehyd, ethyl acetoacetat ethyl crotonat Kết quả: chất chuẩn tạp A, B C felodipin (Dược điển BP 2007) tổng hợp với hiệu suất độ tinh khiết cao Kết luận: Các qui trình tổng hợp đơn giản áp dụng tổng hợp tạp chất A, B C felodipin dùng làm chất chuẩn công tác kiểm nghiệm nguyên liệu felodipin Từ khóa: Phản ứng Hantzch, tạp felodipine ABSTRACT SYNTHESIS OF STANDARD IMPURITIES OF FELODIPINE Nghiem Thoai Van, Tran Boi Chau, Tran Thanh Dao, Le Minh Tri * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 443 - 449 Objectives: In the quality control of drug, one of the problems is the standard reference substrates because of their extremely high cost and unavailablity In this research, impurities of felodipine are synthesized in very simple conditions in order to provide to the institute of quality control Method: Three impurities A, B and C were synthetized and purified with flash column chromatography Impurity A was obtained from felodipine under oxidative process by acid nitric supported on silicagel The Hantzsch reaction via stepes in the presence of catalysis pyridine, piperidine and acetic acid was applied for generation of impurity B and impurity C, using 2,3-dichlorobenzaldehyde, methyl acetoacetate and methyl crotonate as starting materials The synthetic impurities were purified by recrystallization then followed by column chromatography process on silica gel Conclusion: Three imputities of felodipine A, B and C were synthetized with high yield and purity These substances could be applied for qualitative analysis of felodipine under BP 2007 specifications Key words: Hantzch reaction, felodipine impurities ĐẶT VẤN ĐỀ Theo Tổ chức Y Tế Thế Giới, nay, bệnh cao huyết áp 10 bệnh nguy hiểm ảnh hưởng lớn đến sức khỏe người nguyên nhân gây chết 7,5 triệu người năm Phương pháp điều trị hiệu dùng thuốc liên tục lâu dài Do đó, việc kiểm tra, đánh giá chất lượng thuốc cần quan tâm đặc biệt * Bộ mơn Hóa Dược, Khoa Dược, ĐHYD TP.HCM **Trường Đại học Tôn Đức Thắng Tác giả liên hệ: PGS TS Lê Minh Trí ĐT: 0903718190 Email: leminhtri1099@gmail.com Chuyên Đề Dược Khoa 443 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Felodipin thuốc hạ huyết áp thuộc nhóm chẹn kênh calci, thuốc ưu tiên lựa chọn ưu điểm riêng như: thời gian bán thải dài, liều dùng thấp, sử dụng liều ngày (dễ tuân trị, tránh tượng quên thuốc người cao tuổi)… Tuy nhiên, Việt Nam, chất chuẩn khơng sẵn có, phải nhập từ nước ngồi với giá đắt, việc kiểm tra nguyên liệu đầu vào trước đưa vào sản suất kiểm nghiệm thành phẩm gặp nhiều khó khăn Từng bước đảm bảo nguồn nguyên liệu hóa dược cần tiến hành song song với điều chế chất chuẩn tạp chất chuẩn để phục vụ công tác kiểm nghiệm Bước đầu nhà sản xuất hóa dược nước tiến hành số nghiên cứu sản xuất thuốc đặc trị thuốc tim mạch nifedipin, felodipin amlodipin Hiện nhu cầu tạp chất chuẩn felodipin (xem Hình 1) Viện kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cấp thiết, nghiên cứu nhằm mục tiêu thiết lập phản ứng điều chế, tinh chế thích hợp để sản xuất nước thay cho nhập ngoại đắt nhiều thời gian chờ nhập Báo cáo trình bày phản ứng hóa học ứng dụng điều chế tồn qui trình tổng hợp tinh chế kiểm nghiệm độ tinh khiết Tuy vậy, kết bước thăm dò qui mơ phòng thí nghiệm Tạp A: ethyl methyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethylpyridin-3,5-dicarboxylat Tạp B: dimethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat Tạp C: diethyl 4-(2,3-diclorophenyl)-2,6-dimethyl-1,4-dihydropyridin-3,5-dicarboxylat Hình Các chất chuẩn tạp A, B C dùng kiểm nghiệm felodipin lỏng hiệu cao (HPLC) hệ thống sắc ký ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Water, phổ 1H-NMR đo máy Bruker Các hoá chất dùng tổng hợp: 2,3Ultrashield 500 (500 MHz) diclorobenzaldehyd, methyl acetoacetat, ethyl-3Phương pháp tổng hợp aminocrotonat, ethyl acetoacetat, methyl-3Tổng hợp chất chuẩn tạp A aminocrotonat, acid nitric, silicagel, N-bromosuccinimid, piperidin, piridin, acetonitril, nKhảo sát khả oxi hố vòng 1,4hexan, methanol, ethanol, isopropyl alcol, dihydropyridin thành pyridin với tác nhân diisopropyl ether mua từ Merck dùng tổng Oxone, hợp không qua tinh chế Iod, N-bromosuccinamid, HNO3-SiO2(4,3,Error! Nhiệt độ nóng chảy đo máy Gallenkamp với nhiệt kế không hiệu chỉnh; đo phổ tử ngoại (UV) máy U-2010 spectrophometer (Hitachi), ghi phổ hồng ngoại (IR) máy FTIR-8201 PC (Shimadzu), định lượng sản phẩm tổng hợp hệ thống sắc ký 444 Reference source not found.,5) để chọn xúc tác phù hợp Tổng chất chuẩn tạp B C Dựa vào phản ứng Hantzsch gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Tổng hợp dẫn chất trung gian benzyliden Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Giai đoạn 2: Phản ứng đóng vòng Hantzsch chất trung gian benzyliden aminocrotonat Các chất chuẩn tạp A, B C tinh khiết kết tinh dung mơi methanol sau triển khai sắc ký cột nhanh với hệ dung mơi thích hợp: tạp A, B C tiến hành chạy Nghiên cứu Y học sắc kí cột với silica gel 0,2-0,5 μm, pha động gồm n-hexan:ethylacetat (9:2) Các tạp chất chuẩn tổng hợp định tính (phương pháp UV-Vis, IR) xác định cấu trúc (MS, NMR) xác định hàm lượng nước phương pháp chuẩn độ Karl-Fisher, Định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC)(2) Sơ đồ Phản ứng oxi hóa felodipin thành chất chuẩn tạp A Sơ đồ Phản ứng Hantzsch dùng điều chế chất chuẩn tạp B C KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tổng hợp chất chuẩn tạp A Trong bốn tác nhân oxi hoá khảo sát, HNO3SiO2 cho phản ứng nhanh chóng (6 phút), nhẹ nhàng, sản phẩm phụ tinh khiết dễ dàng sắc ký cột nhanh(Error! Reference source not found.,6) Phổ khối: MA = 382,0 (lý thuyết: công thức phân tử C19H19Cl2NO4, phân tử lượng 382,24) Phổ NMR-H1 (500 MHz, CDCl3, δ ppm): xem Bảng Bảng Phân tích phổ NMR-H1 chuẩn tạp A δ (ppm) Dạng đỉnh s t s q dd t dd Số Hằng số Vị trí H H ghép (J, Hz) 6H x pyr-CH3 3H COOCH2-CH3 3H COOCH3 2H COOCH2CH3 1H 7,5 Aryl-H (C6’) 1H 8,0 Aryl-H (C5’) 1H 8,0 Aryl-H (C4’) Cho vào bình cầu 4,5 g dung dịch acid nitric 65% khuấy với g silicagel 10 phút, chất rắn màu trắng tạo Hòa tan (0,384 g, mmol) felodipin ml dicloromethan, thêm 0,15 g SiO2-HNO3 Hỗn hợp phản ứng khuấy nhiệt độ phòng khoảng phút, theo dõi phản ứng sắc ký lớp mỏng (SKLM) Hiệu suất: 60% Tổng hợp chất chuẩn tạp B Tạp A chất dầu màu vàng nhạt, tan aceton, cloroform, diclorometan, ethanol, methanol, tan nước, ete, n-hexan Phổ UV: đỉnh bước sóng 273,5 nm 234 nm Phổ IR (υ, cm-1, KBr): 1752 (δN-H); 1705,0 et 1380,9 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1652 (υC=C), 850,5 (nhân thơm 1,2,3); 1139,9 (Cl-Ar) Cho vào bình cầu dung tích 25 ml hỗn hợp gồm: 2,3-diclorobenzaldehyd (2,3-DCB, 0,525g, mmol) hoà tan ml isopropanol, methyl acetoacetat (0,39 g, 4,2 mmol), xúc tác piperidin acid acetic với tỉ lệ mol so với 2,3-DCB 1:5 (tỉ lệ mol piperidin acid acetic 1:5) Hỗn hợp đun hồi lưu khoảng 50-60 oC vòng Chuyên Đề Dược Khoa 0,943-0,971 2,635-2,649 3,544 4,000-4,043 7,063-7,078 7,179-7,211 7,457-7,473 445 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học 4h Kiểm soát phản ứng phương pháp sắc ký lớp mỏng Khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp sau phản ứng gồm nguyên liệu đầu 2,3-DCB, hai đồng phân E & Z sản phẩm MBI (methyl benzyliden intermediate) Vì khác tính chất vật lý hai đồng phân: đồng phân E tinh thể dạng rắn, Z dạng lỏng, thế, hỗn hợp sau phản ứng để kết tinh 0-5 oC vòng 10-12h Lọc áp suất giảm, rửa với ml isopropanol lạnh, sấy khô để thu đồng phân E Dịch lọc tiếp tục đun nóng 60 oC vòng để có chuyển từ đồng phân Z sang đồng phân E, để kết tinh tiếp tục 0-5 oC, 10-12 giờ, lọc gộp phần sản phẩm MBI chung với Cho vào bình cầu dung tích 10 ml 0,273 g (1 mmol) MBI phản ứng với 1,2 mmol 3-methyl aminocrotonat, xúc tác pyridin, hỗn hợp đun hồi lưu ml ethanol 80 oC vòng Tỉ lệ pyridin so với MBI 1:10 Theo dõi phản ứng SKLM Sau phản ứng, ethanol cất bay áp suất giảm, sau thêm ml CHCl3 Dịch cloroform xử lý với dịch acid (6,3 g dd HClđđ 24 ml H2O) Làm khan dịch cloroform g natri sulfat khan Bay dung môi thêm ml diisopropyl ether Kết tinh sản phẩm oC vòng 10 giờ, lọc rửa với diisopropyl ether Nhiệt độ nóng chảy: 158-160 oC Hấp thu vùng tử ngoại (2 đỉnh hấp thu bước sóng 361,5 nm 241,5 nm với tỷ lệ hấp thu 0,55) Trên mỏng silicagel F254, phát quang đèn 254 365 nm Phổ hồng ngoại IR (υ, cm , KBr): 1752 (δN-H); 1705,0 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1652 (υC=C), 850,5 (nhân thơm vị trí 1, 2, 3), 1139,9 (aryl clorid) -1 Phổ IR (υ, cm-1, KBr): 1616 (δN-H), 1367 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1616 (υC=C), 866,5 (nhân thơm 1,2,3), 1137,9 (Cl-Ar) Phổ khối : MB = 370,0 (lý thuyết: CTPT: C17H17Cl2NO4, MB = 370,227) 446 Bảng Phân tích phổ NMR-H1 chuẩn tạp B δ (ppm) 2,312 3,605 5,470 5,686 7,0467,078 7,2317,249 7,2797,297 Dạng đỉnh s s s s t Số H 6H 6H 1H 1H 1H Hằng số ghép (J, Hz) Vị trí H 2x (pyr-CH3) 2x COOCH3 Pyr-H (C4) Pyr-H (N1) Aryl-H (C5’) dd 1H 7,5 Aryl-H (C6’) dd 1H 7,5 Aryl-H (C4’) Tổng hợp chất chuẩn tạp C Do chất trung gian ethyl benziliden khơng kết tinh theo qui trình nên phải dùng natri bisulfit để loại nguyên liệu 2,3-DCB dư Sau phản ứng giai đoạn 1, cô quay loại isopropanol áp suất giảm hoà tan phần cắn dạng dầu màu cam ethyl acetat trung hoà dung dịch NaHCO3 10% Để loại vết nguyên liệu đầu 2,3-DCB, dung dịch NaHSO3 với lượng mol gấp 7,5 lần 2,3-DCB (0,104 g 10 ml nước) thêm vào dd ethyl acetat khuấy vòng giờ, sau đó, chiết bỏ lớp nước rửa nhiều lần với nước đến khơng 2,3-DCB Loại bỏ dung mơi áp suất giảm Thêm tiếp vào bình cầu 0,75 mmol 3-methyl aminocrotonat xúc tác, dung môi giai đoạn tổng hợp tạp B Chất rắn màu cam, tan aceton, cloroform, diclorometan, ethanol, methanol, thực tế không tan nước, ete, n-hexan Nhiệt độ nóng chảy: 104-106 oC Hấp thu vùng tử ngoại có đỉnh hấp thu bước sóng 360 nm 239 nm với tỷ lệ hấp thu 0,41 Trên mỏng silicagel F254, phát quang đèn 254 365 nm Độ ẩm : 3,7% (xác định cân đo ẩm độ) Phổ hồng ngoại IR (υ, cm-1, KBr): 1616 (δNH), 1701,1 (υC=O), 1020,3 (υ C-O), 1616 (υC=C), 866,5 (nhân thơm vị trí 1, 2, 3), 1137,9 (aryl clorid) Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Phổ khối: MC = 398,0 (lý thuyết: CTPT: C19H19Cl2NO4 M = 398,28) Bảng Phân tích phổ NMR-H1 chuẩn tạp C δ (ppm) Dạng Số H Hằng số Vị trí H đỉnh ghép (J, Hz) 1,095 t 6H 7,5 x pyr-CH3 1,124 2,223 s 6H xCOOCH2CH3 3,982 q 4H xCOOCH2CH3 4,024 5,391 s 1H Pyr-H (N1) 5,682 s 1H Aryl-H (C4) 6,971t 1H Aryl-H (C5’) 7,002 7,160 dd 1H Aryl-H (C6’) 7,179 7,223 dd 1H Aryl-H (C4’) 7,242 20 30 40 50 60 Nghiên cứu Y học 90 85 80 75 70 10 15 20 25 30 Trên sắc ký đồ chiều, ta thấy mẩu thử tinh khiết quan sát bước sóng thấp 210 nm phát đỉnh nhỏ chiếm tỉ lệ không đáng kể Chuẩn tạp A không phát đỉnh phụ sơ kết luận độ tinh khiết chất chuẩn tạp A mặt sắc ký đạt 100% Xác định mức độ tinh khiết chất Các chất kiểm tra độ tinh khiết SKLM với hệ dung môi khác tất cho vết sản phẩm Phương pháp HPLC với cột pha đảo Phenominex C18, detector PDA, bước sóng phát từ 210 nm đến 400 nm(2) Chuẩn bị mẫu thử: Cân xác khoảng 10 mg tạp A sau tinh chế SKC hòa tan vào 25 ml acetonitril Tạp B, C (cân xác khoảng mg hoà tan 10 ml acetonitril) Điều kiện tiến hành: Cột pha đảo: Phenomenex Luna C18 4,6 x 250 mm; Kích thước hạt pha tĩnh: 5μm; Thể tích bơm mẫu: 10 μl; Tốc độ dòng: ml/1 phút Chế độ chạy gradient 60 phút với hệ pha động thay đổi sau: Bảng Hệ pha động sử dụng để xác định độ tinh khiết chất chuẩn tạp A, B, C Thời gian (min.) 10 Acetonitril (%) 100 95 Chuyên Đề Dược Khoa Nước (%) Hình Sắc ký đồ HPLC chuẩn tạp A Chuẩn tạp B có tỷ lệ nhỏ tạp chất (1,86%) => Độ tinh khiết mặt sắc ký đạt 98,14% 447 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Hình Sắc ký đồ HPLC chuẩn tạp B Chuẩn tạp C có tỷ lệ nhỏ tạp chất (0,95%) => độ tinh khiết mặt sắc ký đạt 99,05% Hình Sắc ký đồ HPLC chuẩn tạp C Hantzsch qua giai đoạn, giai đoạn tạo chất Khi quan sát bước sóng 254 nm, bước trung gian diclorobenzyliden từ 2,3sóng định tính, định lượng felodipin theo diclorobenzaldehyd alkyl acetoacetat (tạp B: quy định Dược Điển Anh BP 2007 khơng methyl, tạp C: ethyl), sau cho chất trung gian phát đỉnh phụ khác Do đó, phản ứng với alkyl crotonat (tạp B: methyl, chất hồn tồn sử dụng làm chất đối tạp C: ethyl) Các chất sau tổng hợp tinh chiếu kiểm nghiệm felodipin chế sắc ký cột để đạt độ tinh khiết mức KẾT LUẬN cao kiểm tra độ tinh khiết HPLC, đầu Từ nguyên liệu đầu felodipin, qua khảo dò PDA với pha động có mức độ phân cực thay sát phản ứng oxi hoá tác nhân Oxone, đổi từ phân cực đến phân cực bước iod, HNO3-SiO2, N-bromosuccinimid đưa sóng phát từ 210-400 nm Với kết luận tác nhân acid nitric giá mang nghiên cứu bước đầu cho kết khả quan, có silicagel ứng dụng để tổng hợp tạp A với thể tiếp tục khảo sát điều kiện phản ứng điều kiện phản ứng nhẹ nhàng, thời gian ngắn, đưa vào sản xuất thử chất chuẩn đưa sản phẩm phụ, hiệu suất cao Tạp B C thị trường felodipin tổng hợp theo phản ứng 448 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arash GC, Mohsen N, Hamid G, Lofti S, Zahra C, (2009) “Oxidation of Hantzsch 1,4-Dihydropyridins using Supported Nitric Acid on Silica gel and Poly Vinyl Pyrrolidone (PVP) under mild and heterogeneous conditions”, Bull Korean Chem Soc., Vol 30 (No 4), pp 972974 Dược Điển Anh 2007, CD ROM Fillipan-Litvié M, Cepanec I, Vinkovié V, “Hantzsch Synthesis of 2,6-Dimethyl-3,5-dimethoxycarbonyl-4-(omethoxyphenyl)-1,4-dihydropyridin; a Novel Cyclisation Leading to an Unusual Formation of 1-Amino-2methoxycarbonyl-3,5-bis(o-methoxyphenyl)-4-oxacyclohexan-1-ene”, Molecules (2007), pp 2546-2558 Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Gustavsson, Anders; Kallstrom, Ang Ke, Palmer, Sven “Manufacturing process for Felodipin”, USA Patent, 5,942,624 (24/8/1999) Nagarajan R., Anthonyraj JCA, Muralidharan D., Saikumar C., “A convenient method for the oxidation of Hantzch 1,4dihydropyridin with N-bromosuccinimi”, Indian Journal of Chemistry, (2006), Vol 45B., pp 826-828 Zolfigol M.A., Bagherzah M., Niknam K., Shirini F., Mohammadpoor-Baltork I., Ghorbani Choghamarani A Baghbanzah M., “Oxidation of 1,4-dihydropyridins under mild and heterogeneous conditions using Solid Acids”, Journal of the Iranian Chemistry Society, (2006), Vol 3, No.1., pp 73-82 449 ... (HPLC)(2) Sơ đồ Phản ứng oxi hóa felodipin thành chất chuẩn tạp A Sơ đồ Phản ứng Hantzsch dùng điều chế chất chuẩn tạp B C KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tổng hợp chất chuẩn tạp A Trong bốn tác nhân oxi hoá... Bruker Các hoá chất dùng tổng hợp: 2,3Ultrashield 500 (500 MHz) diclorobenzaldehyd, methyl acetoacetat, ethyl-3Phương pháp tổng hợp aminocrotonat, ethyl acetoacetat, methyl- 3Tổng hợp chất chuẩn tạp. .. sản phẩm tổng hợp hệ thống sắc ký 444 Reference source not found.,5) để chọn xúc tác phù hợp Tổng chất chuẩn tạp B C Dựa vào phản ứng Hantzsch gồm giai đoạn: Giai đoạn 1: Tổng hợp dẫn chất trung