Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Thiết kế thang chuẩn ADN

Mục tiêu của đề tài là thiết kế được thang chuẩn ADN 100 bp đảm bảo chất lượng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu sử dụng cũng như phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước.

MỞ ĐẦU Cơng nghệ sinh học được định nghĩa là “sự  sản xuất hàng hóa và dịch vụ  ở quy mơ cơng nghiệp nhờ  việc sử dụng sinh vật, các hệ  thống sinh học và các  q trình sinh học”. Hơn một thế kỷ qua, cơng nghệ sinh học được chú trọng phát  triển tại hầu hết các quốc gia trên thế  giới với nhiều thành tựu đáng kinh ngạc.  Để thúc đẩy sự phát triển cơng nghệ sinh học ở Việt Nam, các phòng thí nghiệm  sinh học ngày càng được trang bị  máy móc hiện đại, nguồn nhân lực trình độ  chun mơn tốt. Do đó, các chế phẩm sinh học phục vụ cho lĩnh vực nghiên cứu   này đòi hỏi phải đảm bảo chất lượng và độ  chính xác cao. Một chế  phẩm sinh   học thường dùng trong nghiên cứu sinh học là thang chuẩn ADN. Đây là cơng cụ  hữu ích được sử  dụng để  đánh giá kích thước và nồng độ  các đoạn ADN. Tuy  nhiên, thang chuẩn hiện nay đều phải nhập khẩu với giá thành cao, thiếu tính   chủ  động trong nguồn cung cấp. Nhược điểm này đã gây nhiều khó khăn trong   q trình triển khai nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm ở Việt Nam Một trong những mặt hàng thang chuẩn có nhu cầu sử dụng cao và thuận  tiện trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử  là thang chuẩn ADN 100 bp,   thường gồm dải băng có kích thước từ  100 bp đến 3000 bp. Mặc dù sản phẩm  này có nhu cầu sử  dụng lớn, nhưng lại phải nhập khẩu với giá thành cao, phụ  thuộc thời gian đặt hàng và vận chuyển đã phần nhiều  ảnh hưởng tới tính chủ  động trong các thí nghiệm. Để  khắc phục những khó khăn này chúng tơi thực  hiện đề  tài “Thiết Kế  Thang Chuẩn ADN”. Mục tiêu của đề  tài là: thiết kế  được thang chuẩn ADN 100 bp đảm bảo chất lượng tốt, giá cả hợp lí, đáp ứng nhu cầu  sử dụng cũng như phù hợp với điều kiện các phòng thí nghiệm trong nước. Đề tài  được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh Y ­ Khoa Sinh học, Phòng Genomic   thuộc Phòng thí  nghiệm trọng điểm Công nghệ  Enzyme ­ Protein, Trường Đại học  Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. THANG CHUẨN ADN 1.1.1. Thang chuẩn ADN  o Định nghĩa thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN được định nghĩa là một hỗn hợp các phân tử  ADN có  kích thước khác nhau, được sử  dụng trong điện di nhằm đánh giá kích thước và  nồng độ đoạn ADN chưa biết [26] o Phân loại thang chuẩn ADN Có nhiều cách gọi tên và phân chia các nhóm thang chuẩn ADN khác nhau như:  dựa trên bước nhảy của thang chuẩn (thang chuẩn ADN 5 bp, 10 bp, hay 50 bp,…); dựa   vào kỹ thuật sản xuất (thang chuẩn PCR, thang chuẩn tái tổ hợp,…) [1]. Tuy nhiên, phân   biệt giữa ADN ladder và ADN marker cho đến nay vẫn là cách phân chia thang chuẩn   thơng  dụng và thuận tiện nhất, dựa trên bản chất ngun liệu ADN được sử  dụng trong q trình sản xuất: ­  ADN   Ladder:   Để   tạo     ADN   ladder   người   ta   thường   sử   dụng   các  enzyme giới hạn có vị  trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử  ADN kích thước  lớn, khơng có nguồn gốc tự nhiên (ví dụ như các plasmid đã bị biến đổi bằng kỹ  thuật di truyền, đoạn ADN kích thước lớn). ADN ladder gồm các đoạn ADN có  kích thước đặc trưng, với bước nhảy mong muốn (Hình 1) [16] Hình 1. Ảnh ADN ladder 500 bp (Takara) [45]; ADN ladder 200 bp (Fermentas) [33] và  ADN ladder 10 bp (Invitrogen) [35] ­ ADN Marker: Cũng như ADN ladder, để sản xuất ADN marker người ta sử  dụng các enzyme cắt giới hạn có vị  trí nhận biết đặc hiệu trên một phân tử  ADN  kích thước lớn, nhưng phân tử  ADN này có sẵn trong tự  nhiên như: ADN genome   của thực khuẩn thể  lambda, plasmid pBR322, hay  ΦX174  (Hình 2) [16]. Thang  chuẩn loại này gồm các đoạn ADN có kích thước khác nhau với bước nhảy ngẫu  nhiên.            Hình 2. ADN marker thương mại được tạo ra từ ΦX174; pBR322 và pUC19 [33] 1.1.2. Vai trò của thang chuẩn ADN trong nghiên cứu sinh học phân tử Trong lĩnh vực nghiên cứu sinh học phân tử  việc tiến hành xác định nồng   độ và kích thước các đoạn ADN ln rất cần thiết trong các thí nghiệm như: sử  dụng kít tinh sạch, tách chiết ADN hay nhân dòng gen… Thơng thường để  xác   định chính xác kích thước và nồng độ ADN cần phải sử dụng đến phương pháp   giải trình tự  và xác định nồng độ  ADN bằng máy đo quang phổ. Cả hai phương   pháp này đều cần nhiều thời gian, thao tác thí nghiệm tương đối phức tạp, đặc   biệt giá thành để  giải trình tự  một mẫu ADN khá cao, lại khơng phải lúc nào   cũng cần thiết. Cách đơn giản, nhanh chóng để  xác định nồng độ  và kích thước  đoạn ADN nghiên cứu là so sánh với một đoạn ADN đã biết nồng độ  và kích  thước [24]. Để  thực hiện mục đích này kỹ  thuật điện di đã được sử  dụng một   cách thường xuyên Với   mục   đích   phân   tách     đoạn   ADN     gel   agarose   hoặc  polyacrylamide, thang chuẩn ADN đã trở thành một cơng cụ rất hữu ích để  đánh  giá chất lượng, kích thước và nồng độ của mẫu ADN. Thang chuẩn thường chạy   cùng một lúc trên gel với các mẫu ADN, sự so sánh giữa các băng ADN mẫu với   các băng ADN thang chuẩn cho phép  ước tính kích thước và nồng độ  các đoạn  ADN chưa biết [16]. Để thang chuẩn có thể  thực hiện vai trò quan trọng này thì  mỗi băng trong thang chuẩn ADN thương mại ln được mơ tả  chính xác kích  thước và nồng độ ADN tương ứng với lượng thể tích [40] 1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN 1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới Thị  trường thang chuẩn ADN trên thế giới hiện có sự  góp mặt của nhiều  hãng sản xuất và cung ứng danh tiếng như Fermentas ­ Đức [33]; Takara ­ Nhật Bản [46];  Invitrogen ­ Mỹ [35]… Kích thước những đoạn ADN trong các thí nghiệm là khác   nhau, chính vì thế  mà thang chuẩn ADN bán trên thị  trường cũng phân thành   nhiều loại, tùy thuộc số lượng băng, kích thước băng ở  từng hãng sản xuất [38,  47]. Những khác biệt đó đã góp phần tạo ra một thị trường thang chuẩn đa dạng   và phong phú (Hình 3). Các thang chuẩn hiện có mặt trên thị trường thường gồm  các băng trong khoảng từ 5 bp đến 50.000 bp [43, 44] Hình 3. Một số thang chuẩn ADN thương mại bán trên thị trường [33, 34] 1.1.3.2. Tiềm năng sản xuất thang chuẩn ADN tại Việt Nam Sự phát triển của các phòng thí nghiệm sinh học phân tử tại Việt Nam góp  phần làm tăng nhu cầu sử  dụng thang chuẩn ADN. Tuy nhiên, cho đến nay vẫn  chưa có một cơ sở trong nước nào đăng ký cung ứng sản phẩm này. Thang chuẩn  hiện vẫn phải nhập khẩu từ  các hãng sản xuất lớn trên thế  giới với giá thành  cao, phụ  thuộc thời gian đóng gói và vận chuyển đã  ảnh hưởng đến tính chủ  động trong các thí nghiệm và nguồn cung cấp Trong những năm gần đây, chúng tơi được biết Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ  Sinh học ­ Đại học Quốc gia Hà Nội đã thực hiện đề tài thiết kế thang chuẩn [2, 6].  Tại Phòng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,  Đại học Quốc gia Hà Nội cũng đã sản xuất thành cơng thang chuẩn ADN 4,6 kb với   bước nhảy 500 bp và hiện đang trong q trình dùng thử [1]. Tuy nhiên, các sản phẩm  thang chuẩn này vẫn chưa được thương mại hóa. Chính vì vậy, mặc dù cho đến nay   thang chuẩn ở Việt Nam có nhu cầu sử dụng rất lớn, nhưng vẫn chưa có sự góp mặt  của một nhà sản xuất trong nước 1.1.3.3. Phương pháp sản xuất thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN là một sản phẩm mang tính chất thương mại. Vì vậy,   mặc dù mặt hàng này được bán rất rộng rãi trên thị  trường nhưng các kỹ  thuật   liên quan đến thiết kế và sản xuất lại khơng được cơng bố. Do đó, rất khó để có  được một tài liệu tham khảo về quy trình sản xuất thang chuẩn ADN. Từ những   tài liệu hiếm hoi mà chúng tơi tổng hợp được cho thấy có bốn phương pháp chủ  yếu được áp dụng để  thiết kế  thang chuẩn ADN với những  ưu và nhược điểm   riêng [1, 2] o Phương pháp hóa tổng hợp  Oligonucleotide là một polymer ngắn của acid  nucleic, thơng thường dài  khoảng 50 base trở  xuống. Mặc dù các oligonucleotide có thể  được tạo ra bằng   cách cắt liên kết của các phân tử  dài, nhưng hiện nay chúng thường được tổng  hợp   với   trình   tự   đặc   hiệu   từ     nucleoside   phosphoramidite   [30]   Các  oligonucleotide được sử  dụng trong nhiều nghiên cứu khác nhau của di truyền   học phân tử, chẳng hạn như: sử  dụng làm mồi trong các phản  ứng PCR; dùng  làm mẫu dò trong các phương pháp lai phân tử; trong nghiên cứu tạo đột biến  điểm xác định vị  trí hay giải mã trình tự  ADN  [5]. Phản  ứng kéo dài chuỗi  oligonucleotide diễn ra bằng việc gắn thêm tiền chất nucleotide mới vào phía  đầu 5’, như vậy ngược chiều với phản ứng kéo dài chuỗi ADN sử dụng enzyme   ADN polymerase [4] Phương pháp tổng hợp hóa học sử  dụng các thiết bị  hiện đại, dễ  thực  hiện, nhanh chóng tổng hợp được bất cứ một trình tự ADN ngắn nào với độ tinh   sạch và chính xác cao (thơng thường đạt độ chính xác cao khi tiến hành tổng hợp  các phân tử ADN mạch đơn có độ dài tới 30 nucleotide [15]). Tuy nhiên, mặt hạn  chế  của phương pháp này là khó có thể  tổng hợp được trình tự  dài hơn 100   nucleotide mà đảm bảo được số lượng và chất lượng mong muốn. Máy móc và   các hóa chất tổng hợp có giá thành cao, thang chuẩn tạo ra phải qua bước tạo  cặp bổ  sung để  chuyển ADN sợi đơn thành dạng sợi kép. Do đó, phương pháp  này thường áp dụng để tạo thang chuẩn có kích thước nhỏ, như thang chuẩn 5 bp   hay 10 bp với nhu cầu sử dụng khơng cao (Hình 4) [1] Hình 4. Ảnh ADN ladder 5 bp (Fermentas) điện di trên agarose 5% và gel polyacrylamide 10% [33] o Phương pháp áp dụng kỹ thuật PCR  Một phương pháp nhân dòng gen in vitro đơn giản, hiệu quả, được sử dụng  phổ biến hiện nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm sinh học phân tử  là  phản ứng   chuỗi trùng hợp ­ PCR (polymerase chain reaction). Kỹ thuật này được Kary Mullis  tìm ra vào năm 1983, nhờ đó việc khuếch đại một đoạn ADN mong muốn đã trở nên   dễ dàng, nhanh chóng và chính xác hơn [8]. Kỹ thuật này còn được sử dụng để phát  hiện một trình tự nucleotide đặc hiệu trong một mẫu sinh học, thu nhận số lượng   lớn một đoạn ADN đích cho q trình nhân dòng, hoặc các phân đoạn kết thúc   dideoxynucleotide trong phương pháp giải trình tự, hay lắp ráp một gen tổng hợp   Một phản  ứng PCR đặc trưng bao gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm ba bước   [15]: ­ Bước biến tính: ADN khn dạng sợi đơi được biến tính bằng nhiệt độ  để tách thành hai sợi đơn [3] ­ Bước hồi tính: Nhiệt độ của hỗn hợp phản  ứng sẽ được làm nguội dần  xuống, cho phép các mồi liên kết bắt cặp bổ sung với hai sợi đơn ADN khn ­ Bước tổng hợp: Nhiệt độ hỗn hợp phản ứng sẽ được tăng lên đến nhiệt  độ  tối  ưu cho sự  hoạt động của enzyme ADN polymerase. Q trình tổng hợp   ADN sẽ được diễn ra theo chiều từ 3’ đến 5’ (Hình 5) [4, 8] Hình 5. Kéo dài mồi bởi Taq ADN polymerase. Mồi được gắn vào trình tự bổ sung trên   sợi   khn     Taq   ADN   polymerase   kéo   dài   mồi     cách   gắn     xác   các  deoxynucleotide (dNTP) theo ngun tắc bắt cặp bổ sung với sợi ADN khn, q trình  tổng hợp diễn ra theo chiều 3’ ­ 5’ Các ADN polymerase bền nhiệt sử  dụng trong phản  ứng PCR được tách   chiết từ  một số  loại vi khuẩn chịu nhiệt như  Sulfolobus solfataricus,  Bacillus   steriotherphilus, Pyrococus fumaricus. Tuy nhiên loại enzyme sử  dụng phổ  biến  nhất hiện nay là Taq ADN polymerase được tách chiết từ một loại vi khuẩn suối   nước nóng Thermus aquaticus [8, 23] Các mồi được thiết kế phải tn thủ  một số ngun tắc sau: (1) Có tỷ  lệ  GC chiếm từ 40 ­ 75%, khoảng cách giữa hai mồi thường khơng dài q 3 kb, các   mồi khơng được tạo cấu trúc bậc hai do liên kết giữa các nucleotide ngay trong một   mồi [3]. Nhiệt độ gắn mồi (Tm) cũng đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR Dựa trên trình tự  đã biết của một phân tử  ADN kích thước lớn, các cặp  mồi khác nhau đã được thiết kế  tùy thuộc kích thước băng, số  lượng băng và   bước nhảy giữa các băng ADN trong thang chuẩn sản xuất. Thơng qua phản ứng   PCR hay Multiplex PCR sử dụng các cặp mồi này sẽ khuếch đại các đoạn ADN  kích thước mong muốn. Các đoạn ADN sẽ được tinh sạch và phối trộn theo tỷ lệ  nồng độ  nhất định tạo thang chuẩn ADN. Loại thang chuẩn này có kích thước  băng và bước nhảy mong muốn, phương pháp thực hiện đơn giản, dễ ứng dụng    điều   kiện     nhiều   phòng   thí   nghiệm   Tuy   nhiên,   mặt   hạn   chế   của  phương pháp này là các hóa chất đi kèm có giá thành cao, các băng thang chuẩn  thường khơng rõ nét [1, 7].  o Phương pháp sử dụng các enzyme cắt giới hạn  Các   endonuclease   hay    enzyme   cắt   giới   hạn    những  phần    hệ  thống   cải   biến   giới   hạn  (restriction   modification   ­  RM  được   sử   dụng     vi  khuẩn và có thể    một số  sinh vật nhân sơ  khác để  bảo vệ  chúng khỏi ADN   ngoại lai) [27]. Các enzyme này nhận biết những trình tự đặc hiệu trong phân tử  ADN và cắt đối xứng liên kết phosphodieste của mỗi sợi tại các vị trí nhận biết   Đồng thời đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các tế  bào vi khuẩn chống  lại sự xâm nhiễm của virus (bacteriophage) [13, 15]. Dựa vào cấu tạo và nhu cầu  cofactor mà các enzyme cắt giới hạn có thể  được phân chia thành ba loại khác  nhau là type I, II và III [32, 39]. Trong đó, những enzyme có vị trí cắt tại trình tự  nhận biết đặc hiệu gọi là enzyme cắt giới hạn type II. Đây là nhóm enzyme cắt   giới hạn được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu về sinh học phân tử  [18] Các enzyme cắt giới hạn type II đóng vai trò quan trọng trong quy trình   nhân dòng gen. Khi một mẫu ADN được xử lý với một trong những enzyme này   ở một điều kiện, thành phần phản ứng khơng đổi sẽ ln tạo ra cùng một tổ hợp   các đoạn ADN trong những lần cắt khác nhau. Do đó, enzyme cắt giới hạn type II   trở  thành một cơng cụ  hữu hiệu trong sản xuất thang chuẩn ADN [15]. Thang   chuẩn loại này chủ yếu sử dụng các phân tử ADN kích thước lớn có sẵn trong tự  nhiên, thao tác đơn giản dễ thực hiện, giá thành rẻ. Tuy nhiên chính việc sử dụng  các phân tử  ADN có sẵn trong tự  nhiên lại trở  thành một nhược điểm lớn của   phương pháp này, vì vị  trí nhận biết của enzyme cắt giới hạn là ngẫu nhiên, nên  các băng của thang chuẩn loại này có bước nhảy khơng xác định [16].  10 Hình 18. Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp ở bốn độ pha lỗng khn ADN  trên agarose 1%. L: ADN ladder 500 bp; 1: Khn pha lỗng 10­4; 2: Khn pha lỗng 10­3;  3: Khn pha lỗng 10­2; 4: Khn pha lỗng 10­1; 5: Đối chứng âm Ảnh điện di trên Hình 18 cho thấy sản phẩm khuếch đại đoạn 1000 bp có   nhiều băng phụ. Phản  ứng PCR được tăng nhiệt độ  gắn mồi lên 66 0C với 6 độ  pha lỗng khn ADN: 10­1; 10­2; 10­3; 10­4; 10­5; 10­6 lần. Thành phần và điều kiện  phản ứng được chúng tơi thiết lập như sau: Thành phần phản ứng H2O Đệm Taq ADN polymerase 10X MgCl2 (25 mM) dNTP  mix (2 mM mỗi loại) Taq ADN polymerase (1 u/µl ) Mồi pJET1.2­800­F (10 µM) Mồi pJET1.2­800­R (10 µM) ADN   Tổng thể tích Thể tích  (µl) 10,6 1,5 0,3 0,5 0,5 0,3 0,3 1,0 15,0 Điều kiện ­ Biến tính 940C trong 5 phút ở giai  đoạn đầu ­ Chu trình lặp lại 40 lần: o Biến tính 940C trong 30 giây o Gắn mồi 660C trong 30 giây   o Tổng hợp 720C trong 60 giây ­ Tổng hợp 720C 5 phút ở giai đoạn  sau cùng Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên agarose 1% (Hình 19) 41 Hình 19. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp ở nhiệt độ gắn mồi 660C  sử dụng 6 độ pha lỗng khn ADN. L: ADN ladder 500 bp; 1: Khn pha lỗng 10 ­1; 2: Khn  pha lỗng 10­2; 3: Khn pha lỗng 10­3; 4: Khn pha lỗng  10­4; 5: Khn pha lỗng 10­5; 6:  Khn pha lỗng 10­6; 7: Đối chứng âm Từ ảnh điện di nhận thấy độ pha lỗng 10­6 tương ứng với nồng độ ADN  khoảng 1 pg/µl (6), nhiệt độ  gắn mồi 660C là hồn tồn tối  ưu. Sản phẩm PCR  mang tính đặc hiệu cao, mất hồn tồn băng phụ, băng 1000 bp sáng rõ Như  vậy, chúng tơi đã chuẩn hóa được điều kiện PCR tối  ưu, với thành   phần phản ứng  được trình bày cụ thể như sau: Thành phần phản ứng H2O Đệm Taq ADN polymerase 10X MgCl2 (25 mM) dNTP  mix (2 mM mỗi loại) Taq ADN polymerase (1 u/µl ) Mồi pJET­800­F (10 µM) Mồi pJET­800­R (10 µM) ADN  Tổng thể tích Thể  tích  (µl) 10,6 1,5 0,3 0,5 0,5 0,3 0,3 1,0 15,0 42 Điều kiện ­ Biến tính 940C trong 5 phút ở giai  đoạn đầu ­ Chu trình lặp lại 40 lần: o Biến tính 940C trong 30 giây o Gắn mồi  660C trong 30 giây o Tổng hợp 720C trong 60 giây ­ Tổng hợp 720C trong 5 phút ở giai  đoạn sau Sản phẩm PCR được điện di trên agarose 1% (Hình 20) Hình 20. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 1000 bp sử dụng cặp mồi pJET­800­ F/R với khn plasmid pJET1.2­8×100­2 trên agarose 1%. L: ADN ladder 500 bp; 1: Sản phẩm   PCR; 2: Đối chứng âm Như  vậy chúng tơi đã khuếch đại thành cơng lượng lớn đoạn ADN kích  thước 1000 bp. Sản phẩm PCR được tinh sạch theo kít của QIAGEN [20] loại bỏ  dimer và các thành phần khác, sau đó được cắt khơng hồn tồn tạo thang chuẩn 100  bp 3.4.2. Phản ứng cắt khơng hồn tồn đoạn 1000 bp Đoạn ADN kích thước 1000 bp sau khi tinh sạch qua cột sẽ được xác định  nồng độ thích hợp cho phản ứng cắt khơng hồn tồn bằng enzyme HpaII. Phản ứng  được thực hiện ở các nồng độ ADN và thời gian ủ khác nhau, để tìm thành phần và  điều kiện tối  ưu cho phản  ứng cắt khơng hồn tồn các đoạn 1000 bp tạo thang  chuẩn 100 bp o Chuẩn thời gian cắt Trước tiên chúng tơi tiến hành tìm thời gian thực hiện phản  ứng cắt khơng  hồn tồn đoạn 1000 bp sao cho sản phẩm có đủ 10 băng ADN kích thước từ 100   bp đến 1000 bp. Dựa vào nồng độ  các đoạn ADN trong ADN ladder 100 bp của  43 Takara và New England Biolab,  ước tính mỗi băng ADN trong thang chuẩn sản   xuất sẽ có nồng độ 15 ng, do đó nồng độ ADN được chọn ban đầu là 150 ng. Hỗn  hợp phản ứng được thiết lập với thành phần gồm: Đệm 10X  ADN kích thước 1000 bp HpaII 10 u/µl  Thêm   nước   để   có   tổng   thể  1,5 µl  3,0 µl (150 ng) 0,05 µl  15,0 µl  tích Phản  ứng được diễn ra   370C tại ba thời gian: 1 phút, 3 phút và 5 phút,  enzyme sau đó bị  bất hoạt tại 700C, 10 phút. Sản phẩm được điện di trên gel  polyacrylamide 6% (Hình 21) Hình 21.  Ảnh đi ệ n di s ản phẩm cắt khơng hồn tồn đoạ n 1000 bp b ằng enzyme   HpaII trên gel polyacrylamide 6% t ại các th ời gian phản  ứng khác nhau. 1: Phản   ứng   c ắt 1 phút; 2: Ph ản  ứng c ắt 3 phút; 3: Phả n  ứng c ắt 5 phút; L: ADN ladder   100 bp Hình 21 cho thấy tại thời điểm 1 phút (1), các đoạn ADN kích thước lớn   chưa được cắt còn nhiều, do đó các đoạn ADN kích thước nhỏ  rất mờ. Tại thời  điểm 5 phút (3), các đoạn ADN lớn đã tham gia hồn tồn vào phản ứng cắt, do đó   44 các băng ADN kích thước nhỏ rõ nét, nhưng băng ADN kích thước lớn hơn 600 bp   hầu như khơng thể quan sát. Thời gian diễn ra phản ứng cắt trong 3 phút (2) là điều   kiện thích hợp để có thể  quan sát được các băng ADN kích thước từ   100 bp đến  1000 bp 45 o Chuẩn nồng độ ADN Nồng độ  ADN 150 ng được sử  dụng trong phản  ứng cắt cho các băng  sáng,  do  đó  quyết  định lặp  lại phản  ứng s  dụng  b ốn n ồng  độ  ADN  khác  nhau: 50 ng (1,0 µl); 100  ng (2,0 µl); 150 ng (3,0 µl); 250 ng (5,0 µl) với mong   muốn chọn được nồng độ  ADN ít nhất, nhưng sản phẩm cắt lại cho băng sáng   và rõ nét nhất. Phản  ứng diễn ra  ở 370C, 3 phút và bất  hoạt enzyme  ở 700C, 10  phút. Thành phần phản ứng trình bày trong Bảng 7 Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt khơng hồn tồn đoạn 1000 bp bằng HpaII ở 4 nồng độ  ADN Đệm 10X 1,5 µl  1,0 µl (50 ng) 2,0 µl (100 ng) ADN kích thước 1000 bp 3,0 µl (150 ng) 5,0 µl (250 ng)  HpaII 10 u/µl  0,05 µl  Thêm  nước để có tổng thể  15,0 µl tích Sản phẩm cắt được điện di trên gel polyacrylamide 6% (Hình 22) 46 Hình 22. Điện di sản phẩm cắt khơng hồn tồn đoạn 1000 bp bằng  HpaII tại 4 nồng độ  ADN khác nhau trên gel polyacrylamide 6%. L: ADN ladder 100 bp; 1: Nồng độ ADN 250  ng; 2: Nồng độ ADN 150 ng; 3: Nồng độ ADN 100 ng; 4: Nồng độ ADN 50 ng Từ  nồng độ  150 ng (2) trở  lên đã có thể  quan sát rõ các băng ADN trong   hỗn hợp sản phẩm cắt. Để đảm bảo độ nét các băng ADN trong thang chuẩn sản  xuất, chúng tơi quyết định chọn nồng độ ADN 200 ng cho phản ứng cắt o Điều kiện cắt tối ưu  Chúng tơi đã thiết lập được thành phần và điều kiện phản ứng cắt tối ưu   đoạn ADN 1000 bp bằng enzyme HpaII như sau: Đệm 10X ADN kích thước 1000 bp HpaII 10 u/µl  Thêm   nước   để   có   tổng   thể  1,5 µl  4,0 µl (200 ng)  0,05 µl  15,0 µl  tích Phản ứng diễn ra ở 370C, 3 phút và sau đó được bất hoạt ngay ở 700C, 10 phút.  Kết quả được điện di kiểm tra trên gel polyacrylamide 6% (Hình 23) 47 Hình 23. Ảnh điện di sản phẩm phản ứng cắt khơng hồn tồn đoạn 1000 bp bằng  HpaII  trên gel polyacrylamide 6%. 1: Sản phẩm phản  ứng cắt khơng hồn tồn đoạn 1000 bp   bằng HpaII; L: ADN ladder 100 bp Từ   ảnh điện di cho thấy các băng ADN trong sản phẩm cắt khơng rõ nét  và có sự  chênh lệch đáng kể  kích thước băng so với thang chuẩn thương mại   Hiện tượng này là do sản phẩm phản  ứng cắt được điện di mà chưa tinh sạch   loại muối và các thành phần khác. Để  thu được thang chuẩn 100 bp hoàn chỉnh,   sản phẩm cắt phải được qua bước tinh sạch loại hoàn toàn các thành phần trong   phản ứng 3.4.3. Tinh sạch sản phẩm cắt tạo thang chuẩn ADN SY ­ 100 Sản phẩm cắt khơng hồn tồn đoạn 1000 bp bằng HpaII sau khi tinh sạch  (kít Qiagen [20]) sẽ tạo thang chuẩn ADN kí hiệu là SY ­ 100. Sản phẩm thang   chuẩn ADN SY ­ 100 được điện di trên gel polyacrylamide 6%. Kết quả thể hiện   trên Hình 24 48 Hình 24. Ảnh điện di thang chuẩn ADN SY ­ 100 sau tinh sạch trên gel polyacrylamide 6%   1: Thang chuẩn ADN SY ­ 100 tinh sạch; L: ADN ladder 100 bp.  Kết quả  điện di chứng minh rằng cần loại bỏ  các thành phần có trong   phản ứng cắt để các băng ADN điện di đúng với kích thước của chúng Chúng tơi đã thiết kế thành cơng thang chuẩn ADN SY ­ 100 gồm tổ hợp   18 băng ADN được trình bày trong Bảng 8 Bảng 8. Tổ hợp băng trong thang chuẩn ADN SY ­ 100 Enzyme HpaII Trình tự cắt CˇCGG Các băng trong  thang chuẩn (bp) 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 49 Tổ hợp băng (bp) 106    107 203    211 305    315 395 499 596    604 698    700     708 802    805 907    909 1009 Sự   chênh   lệch   lớn         băng         kích   thước     10   nucleotide, sự chênh lệch này khơng thể quan sát được khi điện di trên nồng độ gel  thích hợp cho thang chuẩn 100 bp: gel agarose 1,7% đến 2,5%; gel polyacrylamide  4% đến 8% [33, 45] (Hình 25) Hình 25. Ảnh điện di 200 ng thang chuẩn ADN SY ­ 100 (1) và 125 ng ADN ladder 100 bp ­  Takara (L) trên b ố n n ng đ ộ  gel khác nhau. A: Agarose 1,7%; B: Agarose 2,5%;   C: Polyacrylamide 4%; D: Polyacrylamide 8%.   Thang chuẩn 100 bp mà chúng tơi thiết kế là sự kết hợp giữa phương pháp  ADN tái tổ  hợp và phương pháp PCR. Áp dụng phản  ứng PCR, Multiplex PCR   trong sản xuất thang chuẩn 100 bp, thường phải sử  dụng tới 10 cặp mồi khác   nhau để khuếch đại 10 đoạn ADN với kích thước từ 100 bp đến 1000 bp, sau đó   tinh sạch, xác định tỷ  lệ  nồng độ  để  phối trộn tạo thang chuẩn hồn chỉnh [7,  24]. Trong nghiên cứu này, đoạn 1000 bp được khuếch đại bởi một cặp mồi duy   nhất sử dụng khn ADN là vector tái tổ  hợp, sau khi tinh sạch được cắt khơng   hồn tồn bằng enzyme cắt giới hạn tạo thang chuẩn ADN 100 bp. Do đó chúng   tơi đã rút gọn được thao tác thí nghiệm, hóa chất tiêu hao, chủ động được ngun   liệu đóng vai trò quan trọng trong việc hạ giá thành sản phẩm 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ những nghiên cứu trên, chúng tơi đưa ra một số kết luận như sau: Tạo vector tái tổ hợp pJET1.2­8×100 mang đoạn ADN 827 bp Thiết kế thành cơng cặp mồi pJET­800­F/R khuếch đại đoạn 1009 bp Chuẩn hóa thành cơng thành phần, điều kiện phản ứng khuếch đại và cắt   khơng hồn tồn đoạn 1009 bp bằng enzyme HpaII Thiết kế thành cơng thang chuẩn ADN SY ­ 100 gồm tổ hợp băng: 106 bp/107  bp; 203 bp/211 bp; 305 bp/315 bp; 395 bp; 499 bp; 596 bp/604 bp; 698 bp/700 bp/708  bp; 802 bp/805 bp; 907 bp/909 bp; 1009 bp KIẾN NGHỊ Gửi thang chuẩn sản xuất tới một số phòng thí nghiệm sinh học phân tử  trong nước để kiểm định chất lượng Chuẩn hóa quy trình sản xuất thang chuẩn 100 bp trên quy mơ pilot 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tiếng Việt 1. Phạm Anh Thùy Dương (2008), Nghiên cứu thiết kế thang chuẩn ADN chất   lượng cao, Luận văn thạc sĩ khoa học, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường  đại học Khoa học Tự nhiên, Hà Nội 2. Dương Văn Hợp (2005), Nghiên cứu  ứng dụng quy trình sản xuất một số   chế phẩm chuyên dụng chất lượng cao dùng cho nghiên cứu sinh học phân   tử, Báo cáo tổng kết Khoa học và Kỹ  thuật, Trung tâm Cơng nghệ  Sinh  học, Đại học Quốc gia Hà Nội 3. Võ Thị  Thương Lan (2007), Một số vấn đề  cơ  bản của sinh học phân tử,  NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội 4. Đinh Đồn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ  sở  di truyền học phân tử và tế   bào, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội 5. Phạm Hùng Vân (2008), PCR và real­time PCR các vấn đề  cơ  bản và các   áp dụng thường gặp, NXB Y Học, Thành phố Hồ Chí Minh   Hoàng   Văn   Vinh   (2007),  Nghiên   cứu   thiết   kế   thang   chuẩn   ADN     phương pháp tái tổ hợp, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Viện Sinh thái và Tài  nguyên sinh vật, Hà Nội II. Tiếng Anh Abdel­fattah Y.R, Gaballa A.A, Berekkaa M.M. (2007), “Methods for Preparation of  DNA Ladder using PCR and Its Optimization by Numerical Modeling Thereof”,  World Intellectual Property Organization, WO/2007/016929 52 Bartlett J. M. S., Stirling D. (2003), Methods in Molecular Biology, Vol. 226:  PCR Protocols, Second Edition, Humana Press.   Bioneer Corporation (2007), AccuPrep® Gel Purification Kit 10  Bioneer Corporation (2007), AccuPrep® PCR Purification Kit 11   Cranenburgh   R   M   (2004),   “An   equation   for   calculating   the   volumetric  ratios   required   in   a   ligation   reaction”,  Applied   Genetics   and   Molecular   Biotechnology, 65(10), pp. 200­202 12  Fermentas (2006), Clone JETTM PCR Cloning Kit 13  Fermentas (2010­2011), FastDigest® & Conventional Restriction Enzymes 14  Fermentas (2006), Gene JETTM PCR Cloning Kit procedure 15  Glick B. R., Pasternak J. J. (2003), Molecular Biotechnology, Third Edition,  American Society for Microbiology, Washington, DC 20036­2904 16   Hu A. W., Hartley J. L., Jordan H. J.,  Acid nucleic ladders, Patent No.  6924098B2, US Patent Issued on January 25, 2007 17   Hyman E. D.,  Method of making DNA ladders, Patent No. 5939293, US  Patent Issued on August 17, 1999 18  Pingoud A., Jeltsch A. (1997), “Recognition ang cleavage of DNA by typ­II  restriction endonucleases”, Eur. J. Biochem, 246, pp.1­22 19  QIAGEN (2006), QIAprep® Miniprep Hand book 20  QIAGEN (2008), QIAquick®  PCR Purification Kit (50) 21  Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 1  Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 22  Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 2  Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 23  Sambrook J., Russell D. W. (2001), Molecular Cloning, Third Edition, Volume 3,  Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 53 24   Wang T., Guo L., Zhang J. (2010), “Preparation of DNA Ladder Based on  Multiplex PCR Technique”, Journal of Nucleic Acids, vol. 2010, pp. 1­3 III. Trang Web 25  http://ecoliwiki.net/colipedia/index.php/DH5_alpha  26  http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_ladder 27  http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme 28  http://en.wikipedia.org/wiki/Agarose_gel_electrophoresis 29  http://en.wikipedia.org/wiki/Gel_electrophoresis 30  http://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide 31  http://openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#BL21 32   http://www.ebi.ac.uk/interpro/IPR0069355restriction   endonuclease,   type   I,  R subunit/Type III, Res subunit 33  http://www.fermentas.com 34  http://www.fermentas.com/en/products/all/dna­electrophoresis 35  http://www.invitrogen.com 36   http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products­and­ Services/Applications/Nucleic­Acid­Purification­and­Analysis/Nucleic­Acid­Gel­ Electrophoresis/Agarose­Gel­Electrophoresis/Nuclei Acid Ladder­E­Gel®  Systems  & Pre­Cast Gels/DNA ladders 37  http://www.lablife.org 38  http://www.molecularstation.com/agarose­gel­electrophoresis 39   http://www.molecular­plant­biotechnology.info/recombinant­DNA­ technology/types­of­restriction­endonucleases 40  http://www.neb.com 54 41   http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/markers_ladders/  DNA_markers.asp 42   http://www.neb.com/nebecomm/tech_reference/markers_ladders/  ladder_marker_selection_chart.asp 43  http://www.promega.com/catalog/catalogproducts.asp 44  http://www.roche­appied­science.com/productcatalog 45  http://www.takara.com 46  http://www.takara.com.cn/markers/DNA maker 47  http://www.uoftmedstore.com 55 ...CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. THANG CHUẨN ADN 1.1.1. Thang chuẩn ADN o Định nghĩa thang chuẩn ADN Thang chuẩn ADN được định nghĩa là một hỗn hợp các phân tử ADN có  kích thước khác nhau, được sử... nồng độ đoạn ADN chưa biết [26] o Phân loại thang chuẩn ADN Có nhiều cách gọi tên và phân chia các nhóm thang chuẩn ADN khác nhau như:  dựa trên bước nhảy của thang chuẩn (thang chuẩn ADN 5 bp, 10 bp, hay 50 bp,…); dựa... mỗi băng trong thang chuẩn ADN thương mại ln được mơ tả  chính xác kích  thước và nồng độ ADN tương ứng với lượng thể tích [40] 1.1.3. Sản xuất thang chuẩn ADN 1.1.3.1. Cung ứng và sản xuất thang chuẩn ADN trên thế giới