Xây dựng quy trình tổng hợp và khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất tổng hợp ở quy mô phòng thí nghiệm và phù hợp với điều kiện trong nước dẫn chất mono-6-amino-6-deoxybetacyclodextrin.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 TỔNG HỢP DẪN XUẤT MONO-6-AMINO-6-DEOXYBETACYCLODEXTRIN Nguyễn Thị Minh Phương*, Hồ Đan Thư*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓMTẮT Mở đầu: Beta-cyclodextrin ( -CD) dẫn chất chúng sử dụng phổ biến phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), điện di mao quản (CE), làm tác nhân đối quang phân tách dược chất đồng phân quang học Một số mono-6-amino-6-deoxybetacyclodextrin (M6A- β-CD), sử dụng rộng rãi để làm tác nhân đối quang phương pháp điện di mao quản, phân tách thành công đồng phân quang học nhiều dược chất, nhiều chất lưỡng tính amino acid acid glutamic, phenylalanin, threonin valin,… Tiếp nối cơng trình trước tổng hợp dẫn chất methyl, methoxycarbonyl, carboxymethyl dẫn chất ứng dụng làm tác nhân đối quang tách thành công số dược chất quang hoạt CE Với mong muốn tiếp tục phát triển góp phần làm đa dạng hóa tác nhân đối quang để phân tách đồng phân quang học CE, đề tài: “Tổng hợp dẫn xuất mono-6-amino-6-deoxy-betacyclodextrin” thực Mục tiêu: Xây dựng quy trình tổng hợp khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu suất tổng hợp quy mơ phòng thí nghiệm phù hợp với điều kiện nước dẫn chất mono-6-amino-6-deoxybetacyclodextrin Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: mono-6-amino-6-deoxy-βcyclodextrin.Phương pháp nghiên cứu: Thực phản ứng tổng hợp M6A- β-CD từ β-CD qua giai đoạn Phân lập tinh chế sản phẩm phương pháp thay đổi dung môi phương pháp kết tinh lại Dẫn chất tổng hợp xác định độ tinh khiết qua việc xác định điểm chảy góc quay cực riêng Cấu trúc xác định qua liệu thu từ phổ IR, NMR, MS Khảo sát ảnh hưởng đến hiệu suất số điều kiện phản ứng giai đoạn Kết quả: Đã tổng hợp mono-6-amino-6-deoxy-β-CD từ β-CD qua giai đoạn tổng hợp dẫn chất trung gian mono-6-O-tosyl-β-CD mono-6-azido-6-deoxy-β-CD Kết luận: Thành công đề tài tạo tiền đề cho hướng tiếp tục nghiên cứu ứng dụng sản phẩm làm tác nhân đối quang, phân tách đồng phân quang học nguyên liệu thành phẩm dược chất quang hoạt phương pháp điện di mao quản Từ khóa: mono-6-amino-6-deoxy-β-cyclodextrin, tổng hợp, dẫn chất β-cyclodextrin ABSTRACT SYNTHESIS OF MONO-6-AMINO-6-DEOXY-BETACYCLODEXTRIN Nguyen Thi Minh Phuong, Ho Dan Thu, Nguyen Duc Tuan * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol 23 - No 2- 2019: 462 – 467 Background: Beta-cyclodextrin (β-CD) and its derivatives are commonly used as the chiral selectors for analysis of enantiomer drugs by HPLC and capillary electrophoresis (CE) One of these derivatives is mono-6-amino-6-deoxy derivatives of -cyclodextrin, used for the enantioseparation of various anionic, * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liện lạc: ThS Nguyễn Thị Minh Phương ĐT: 0909810668 462 Email: minhphuongvn80@yahoo.com Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học amphoteric substance and amino acids by capillary electrophoresis (CE) such as glutamic acid, phenylalanine, threonine valine,… Some beta-cyclodextrin derivatives as methyl- -CD, methoxycarbonyl- -CD and carboxymethy-β-cyclodextrin were successfully synthesized by our group These derivatives were successfully applied for separation of some enantiomer drugs by CE, too With the desire to develop the selective chiral selectors, this study was carried out to synthesize mono-6-amino-6deoxy-β-cyclodextrin from β-cyclodextrin Objectives: The purpose of this process is to synthesize mono-6-amino derivative of -cyclodextrin and evaluate influences of reaction conditions on the yield Subjects and Methods: The subjects of this study was mono-6-amino derivatives of -cyclodextrin, which was synthesized from β-CD Purity of the final synthesized product was checked by melting point and specific rotation measurements, and its structure was elucidated by IR, MS, and NMR spectra Influences of reaction temperature, reaction duration and reactant ratio on the yield were studied Results: Mono-6-amino-6-deoxy-β-CD was synthesized by a three-step reaction sequence beginning with β-CD Two intermediate products of this process were mono-6-O-tosyl-β-CD and mono-6-azido-6deoxy-β-CD Conclusion: The successful synthesis of mono-6-amino-6-deoxy-β-CD derivative provides a theoretical and experimental basis for further scale-up research In the future, we are going to develop the application of this selector for separation of enantiomer drugs by capillary electrophoresis Key words: mono-6-amino-6-deoxy-β-cyclodextrin, synthesis, β-cyclodextrin derivative ĐẶTVẤNĐỀ Beta-cyclodextrin (-CD) dẫn chất chúng sử dụng phổ biến phương pháp sắc ký khí (GC), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), điện di mao quản (CE), làm tác nhân đối quang tách đồng phân quang học(1-4,6,8,9), đặc biệt ứng dụng kiểm nghiệm thuốc chứa hoạt chất có tính quang hoạt Để phân tách dược chất quang hoạt cần tác nhân đối quang phù hợp với tính chất dược chất, đơi để phân tách dạng đồng phân chất cần phải phối hợp nhiều tác nhân quang hoạt với Một số tác nhân thường dùng mono-6-amino-6-deoxybetacyclodextrin (M6A-β-CD), sử dụng để làm tác nhân đối quang phân tách thành công đồng phân quang học nhiều dược chất, nhiều chất lưỡng tính amino acid acid glutamic, phenylalanin, threonin valin,…(9-11) So với số lượng lớn dược chất quang Chuyên Đề Dược hoạt đa dạng cấu trúc tính chất có mặt thị trường số lượng tác nhân quang hoạt thương mại hóa ít, giá thành cao Chính vậy, xu hướng nhà nghiên cứu nước tổng hợp nhiều tác nhân tách đồng phân chuyên biệt có tính chọn lọc cao có giá trị kinh tế(7-10) Tiếp nối cơng trình trước tổng hợp dẫn chất methyl, methoxycarbonyl carboxymethyl, dẫn chất ứng dụng làm tác nhân đối quang tách thành công số dược chất quang hoạt CE Với mong muốn tiếp tục phát triển góp phần làm đa dạng hóa tác nhân đối quang để phân tách đồng phân quang học CE, đề tài: “Tổng hợp dẫn xuất mono-6-amino-6-deoxy- betacyclodextrin” thực với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu suất tổng hợp quy mơ phòng thí nghiệm phù hợp với 463 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học điều kiện nước dẫn chất mono-6-amino-6deoxy-betacyclodextrin NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nguyên liệu Beta cyclodextrin toluenesulfonyl clorid (Himedia), p(Trung Quốc), sodium azid (Merck) triphenylphosphin (Merck) Trang thiết bị Máy đo phổ IR Bruker (Đức), máy đo phổ NMR Bruker 500 MHz Đức), máy LCMS Shimazhu (Nhật), máy đo góc quay cực HORIBA-SEO+PA 300 (Nhật) Phản ứng tổng hợp M6A- -CD(5,11) Sử dụng phương pháp thay đổi dung môi phương pháp kết tinh lại để phân lập tinh chế sản phẩm thu từ phản ứng Các dẫn chất tổng hợp xác định độ tinh khiết qua việc xác định điểm chảy, góc quay cực riêng sắc ký lớp mỏng (TLC) Cấu trúc xác định qua liệu thu từ phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) khối phổ (MS) Khảo sát ảnh hưởng yếu tố đến hiệu suất phản ứng như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, tỉ lệ mol chất tham gia phản ứng giai đoạn KẾTQUẢ Tổng hợp mono-6-O-tosyl- β-CD (M6t) từ β-CD Hòa tan 10 g β-CD (8,8 mmol) vào 50 ml pyridin Làm lạnh bình phản ứng đến oC Lắp sinh hàn lạnh Hòa tan g (10,5 mmol) p- 464 toluensulfonyl clorid vào 10 ml pyridin Nhỏ từ từ dung dịch p-toluensulfornyl clorid vào bình phản ứng khoảng Tiếp tục thực phản ứng nhiệt độ phòng Theo dõi phản ứng TLC Thêm vào hỗn hợp sau phản ứng 300 ml aceton kết tinh hoàn toàn sản phẩm Lọc, rửa phần tủa aceton lần, lần với ml Hòa tan kết tủa thu vào 100 ml nước nóng 60 oC, lọc bỏ tủa Để nguội dịch lọc nhiệt độ phòng để kết tinh lại sản phẩm, lọc thu kết tủa Kết tinh lại nước nóng lần thu kết tủa trắng khơng mùi pyridin Sấy khô sản phẩm thu nhiệt độ 60 oC Sản phẩm M6t Chất rắn màu trắng, tan nước, không tan aceton Hiệu suất sau tinh chế khoảng 32,4 % Rf = 0,74 (IPA – EtOAc – Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 Nghiên cứu Y học H2O, 6:1:3) FTIR, (cm-1): 3296 (OH acol), 2928 (CH alkan), 1022 (C-O-C ether), 1598 (C=C aromatic), 1359 (S=O sulfon), 835 (S-O-Ar) Tổng hợp (M6az) từ M6t mono-6-azido-6-deoxy-β-CD Hòa tan g M6t (1,6 mmol) 1,56 g NaN3 (24 mmol) khoảng 20 ml nước cất Đun hỗn hợp phản ứng đến nhiệt độ 80 oC trì nhiệt độ vòng 24 Theo dõi phản ứng TLC, vết sản phẩm bắt đầu xuất sau phản ứng, tới khoảng 19 khơng vết ngun liệu Hình 2: Đường biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Cô dung dịch thu sau phản ứng Cho 40 ml aceton vào để sản phẩm kết tủa hoàn toàn, lọc lấy kết tủa Hòa tan phần kết tủa thu ml nước cất, kết tinh lại 20 ml aceton lần Sấy khô sản phẩm 60 oC Sản phẩm M6az: Chất rắn màu trắng, tan nước, không tan aceton Hiệu suất sau tinh chế khoảng 70,35 % Rf = 0,50 (IPA – H2O – EtOAc – NH3, 5:3:1:0,5) FTIR, (cm-1): 2106 (N=N=N azid), 2041 (N=N=N azid) Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện lên hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Thực khảo sát hiệu suất phản ứng với thời gian phản ứng từ 19-24 giờ, nhiệt độ phản ứng từ 60-100 oC tỷ lệ mol sodium azid M6t từ 5:1-25:1, thu kết sau Hình 3: Đường biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ mol sodium azid M6t đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Dựa vào kết phân tích thể trên, tìm điều kiện để tổng hợp mono-6-azido6-deoxy-betacyclodextrin từ nguyên liệu NaN3 M6t thực phản ứng vòng 21 giờ, nhiệt độ 80 oC tỷ lệ mol sodium azid M6t 20 : 1, đạt hiệu suất 76,85 % Tổng hợp mono-6-amino-6-deoxy-β-CD (M6A) từ M6az Hòa tan g M6Az (0,86 mmol) 0,3 g triphenylphosphin (1,15 mmol) vào khoảng 10 ml dimethylformamid, khuấy nhiệt độ phòng Thêm vào bình phản ứng khoảng ml nước khử khoáng, Đun hỗn hợp phản ứng đến nhiệt độ 60 oC trì nhiệt độ vòng Theo dõi phản ứng TLC Thêm vào hỗn hợp sau phản ứng 20 ml aceton để kết tinh sản phẩm, lọc thu kết tủa Hình 1: Đường biểu diễn ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Chuyên Đề Dược Hòa tan phần kết tủa vào 10 ml nước khử khoáng lọc để loại bỏ phần không tan, thêm 465 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 vào dịch lọc 30 ml aceton để kết tinh lại sản phẩm, lọc thu lấy tủa Rửa tủa aceton lần, lần với ml Sấy khô sản phẩm 60 oC Sản phẩm M6A: chất rắn màu trắng ngà, tan nước, không tan aceton Hiệu suất sau tinh chế khoảng 70,25 % tnc = 260 – 20 265 oC D (1%, H2O) = 125 Rf = 0,11 (IPA – H2O – EtOAc – NH3, 5:3:1:0,5) FTIR, (cm-1): 1658 (N-H amin), 1597 (N-H amin) MS (m/z): [M-H]+ = 1134,38; [M-H]- = 1133,35 1H-NMR (D2O, 500 MHz): 5,13 (7H, s, H1); 3,91-4,04 (28H, m, H3, H5, H6); 3,62-3,72 (14H, m, H2, H4); 3,11 (1H, br, s, NH2); 2,96 (1H, br, s, NH2) Khảo sát ảnh hưởng số điều kiện lên hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A Thực khảo sát hiệu suất phản ứng với thời gian phản ứng từ 2-6 giờ, nhiệt độ phản ứng từ 20-60 oC tỷ lệ mol triphenylphosphin M6az từ 1:1-5:1, thu kết sau Hình 6: Đường biểu diễn ảnh hưởng tỷ lệ mol triphenylphosphin M6az đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A Dựa vào kết phân tích thể trên, nhận thấy điều kiện để tổng hợp dẫn xuất M6A từ nguyên liệu triphenylphosphine M6az thực phản ứng vòng giờ, nhiệt độ 40 oC tỷ lệ mol triphenylphosphin M6az : Hiệu suất 83,6 % BÀNLUẬN Hình 4: Đường biểu diễn ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A β-CD dạng polymer có nhiều trung tâm bất đối phân tử nên khó khống chế điều kiện phản ứng để tạo thành sản phẩm sau phản ứng Giai đoạn tổng hợp M6t từ β-CD bị ảnh hưởng lượng nước lẫn pyridin độ ẩm β-CD làm cho thời gian phản ứng kéo dài, hiệu suất thấp tạo sản phẩm phụ, cần làm khan pyridin CaH2 sấy khô β-CD trước thực phản ứng để thu sản phẩm mono Giai đoạn tổng hợp M6az M6A sản phẩm khó tinh chế dùng dư nhiều tác nhân tham gia phản ứng bị hấp phụ vào vòng βCD, tinh chế kết tinh lại dung môi nhiều lần dùng sắc ký cột KẾTLUẬN Hình 5: Đường biểu diễn ảnh hưởng nhiệt độ đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A 466 Đề tài xây dựng quy trình tổng hợp mono-6-amino-6-deoxy-β-CD từ βCD qua giai đoạn tổng hợp dẫn chất trung gian mono-6-O-tosyl-β-CD mono-6azido-6-deoxy-β-CD Chuyên Đề Dược Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số * 2019 TÀILIỆUTHAMKHẢO Gyula O, Tibor C, Mária S (2014) Cyclodetrins in chromatography Eur Chem Bull., (1): pp.2-12 József S (2004) Past, present, and future of cyclodextrin research Pure and Applied Chemistry, 76: pp.1829-1830 Julianna S, Katalin G (1994) Use of cyclodextrins and cyclodextrin derivatives in high- performance liquid chromatography and capillary electrophoresis Journal of Chromatography A, 668: pp.509-517 Manoj MN, Dinesh MS, Parag VJ (2012) The Cyclodextrins: A Review Journal of Current Pharmaceutical Research: pp.1-6 Moutard S, Perly B, Gode P, Demailly G, Djedaini-Pilard F (2002) Novel glycolipids based on cyclodextrins J Incl Phenom Macro, 44: pp.317-322 Salvatore F (1996) Identification of chiral drug isomers by capillary Electrophoresis Journal of chromatography A, 735: pp.77-121 Takeo K et al (1976) Synthesis of Heptakis (2-O-methyl-βcyclodextrin Die Starke, 28 (7): pp.226-227 Verleysen K, Sabah S, Scriba G, Sandra P (1999) Enantioseparation of Aspartyl Dipeptides by CE: Comparison between 18-Crown-6-Tetracarboxylic Acid Chuyên Đề Dược Nghiên cứu Y học and Carboxymethyl-13-Cyclodextrin as Chiral Selector Chromatographia, 49: pp.215-218 Weihua T, Wayan I M, Siu C Ng, (2005) Synthesis and application of mono-6-ammonium-6-deoxy-β-cyclodextrin chloride as chiral selector for capillary electrophoresis Journal of Chromatography A, 1094 (1-2): pp.187 – 191 10 Youchang X, Hui M L, Tai SC, Raj R (2007) Acetylation of β-Cyclodextrin Surface-Functionalized Cellulose Dialysis Membranes with Enhanced Chiral Separation Langmuir, 23 (26): pp.12990 11 Zhang ZB, Zhang WG, Luo WJ, Fan J (2008) Preparation and enantioseparation characteristics of a novel chiral stationary phase based on mono (6(A)-azido-6(A)-deoxy)per(p-chlorophenylcarbamoylated) beta-cyclodextrin Journal of Chromatography A, 1213: pp.162-168 Ngày nhận báo: 18/10/2018 Ngày phản biện nhận xét báo: 01/11/2018 Ngày báo đăng: 15/03/2019 467 ... tài: Tổng hợp dẫn xuất mono-6- amino-6- deoxy- betacyclodextrin” thực với mục tiêu xây dựng quy trình tổng hợp khảo sát ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu suất tổng hợp quy mơ phòng thí nghiệm phù hợp. .. đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6A 466 Đề tài xây dựng quy trình tổng hợp mono-6- amino-6- deoxy-β-CD từ βCD qua giai đoạn tổng hợp dẫn chất trung gian mono-6- O-tosyl-β-CD mono-6azido-6-deoxy-β-CD... hưởng tỷ lệ mol sodium azid M6t đến hiệu suất phản ứng tổng hợp M6az Dựa vào kết phân tích thể trên, tìm điều kiện để tổng hợp mono-6- azido6 -deoxy-betacyclodextrin từ nguyên liệu NaN3 M6t thực phản