Keo fibrin là một trong những loại keo sinh học, dùng để dán mô được ứng dụng khá phổ biến hiện nay trong y học. Mặc dù có nhiều thuận lợi như cầm máu nhanh trong phẫu thuật, tương hợp sinh học cao, dễ sử dụng nhưng keo fibrin có thể mang lại một số rủi ro và vấn đề an toàn, do các thrombin có nguồn gốc từ động vật có thể gây ra phản ứng dị ứng ở một số bệnh nhân hoặc có thể gây xuất huyết nghiêm trọng.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ KEO DÁN FIBRIN TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ PHẪU THUẬT MỘNG THỊT TRONG NHÃN KHOA Huỳnh Duy Thảo*, Diệp Hữu Thắng**, Lê Thanh Hùng***, Võ Quốc Vũ*, Thái Trúc Quỳnh*, Trần Cơng Toại* TĨM TẮT Đặt vấn đề: Keo fibrin loại keo sinh học, dùng để dán mô ứng dụng phổ biến y học Mặc dù có nhiều thuận lợi cầm máu nhanh phẫu thuật, tương hợp sinh học cao, dễ sử dụng … keo fibrin mang lại số rủi ro vấn đề an tồn, thrombin có nguồn gốc từ động vật gây phản ứng dị ứng số bệnh nhân gây xuất huyết nghiêm trọng Ngồi có nguy lây truyền tác nhân lây nhiễm từ động vật sang người Do đó, để khắc phục nhược điểm trên, chúng tơi nghiên cứu quy trình tạo keo fibrin có nguồn gốc tự thân bước đầu đánh giá hiệu keo fibrin phẫu thuật điều trị mộng thịt Mục tiêu nghiên cứu: Tạo keo fibrin tự thân bước đầu đánh giá hiệu keo phẫu thuật điều trị mộng thịt Phương pháp nghiên cứu: Keo fibrin tạo từ hai thành phần có máu fibrinogen thrombin Hai thành phần phân lập kết hợp với để tìm quy trình tạo keo hiệu Sản phẩm keo đánh giá số tiêu chí cấu trúc, độ vơ khuẩn khía cạnh an toàn sinh học cho người bệnh Kết quả: Thiết lập quy trình tạo keo fibrin dùng để dán mô bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu keo fibrin tự thân điều trị phẫu thuật mộng thịt Kết luận: Với kết nghiên cứu này, keo fibrin đóng góp thêm lựa chọn cho nhà phẫu thuật điều trị mộng thịt đáp ứng khía cạnh an tồn cho người bệnh Từ khố: Huyết tương người, keo fibrin, fibrinogen, thrombin ABSTRACT PRELIMINARY ASSESSMENT OF EFFECTIVENESS AUTOLOGOUS FIBRIN GLUE IN TREATMENT PTERYGIUM IN OPHTHALMOLOGY Huynh Duy Thao, Diep Huu Thang, Le Thanh Hung, Vo Quoc Vu, Thai Truc Quynh, Tran Cong Toai * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No - 2015: 94 - 99 Background: Fibrin glue is one of the biological glue, used to glue tissues, commonly used in medicine today Although there are many advantages such as rapid hemostasis in surgery, with high biocompatible, using fibrin glue convenient but it may have some risks and safety issues, because the thrombin is derived from animals that can cause allergic reactions in some patients or can cause serious bleeding Also, there is some risk of transmission of pathogens from animals to humans Therefore, to overcome these disadvantages, we study the process of creating autologous fibrin glue and initially evaluated the efficacy of fibrin glue in pterygium surgery * Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, Trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch ** Khoa Giác Mạc, Bệnh viện Mắt TP.HCM Tác giả liên lạc: ThS Lê Thanh Hùng 94 ***Khoa Răng - Hàm - Mặt, ĐH Y Dược TP.HCM ĐT: Email: ranghammat@gmail.com Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học Objectives: Autologous fibrin glue creation and initially evaluated the efficacy of fibrin glue in pterygium surgery Methods: Fibrin glue is made up of two main components with fibrinogen and thrombin in blood Two components will be isolated and combined together to figure out how to create effective glue Fibrin glue are evaluated by a number of criteria such as the structure of the glue, the sterility and biosafety aspects for patients Results: Establishing a process to create fibrin glue used as tissue adhesive and initially tested to assess the effectiveness of autologous fibrin glue in pterygium treatment Conclusion: With the results of this study, fibrin glue will contribute more choice for surgeons in the treatment of pterygium as well as response the safety aspects for the patient Key words: Human plasma, fibrin glue, fibrinogen, thrombin ĐẶT VẤN ĐỀ Đối tượng nghiên cứu Keo có nguồn gốc sinh học dùng để kết dính mô cầm máu phẫu thuật hướng nghiên cứu có tính ứng dụng cao nhiều lĩnh vực, đặc biệt để cầm máu phẫu thuật thần kinh Thu nhận thành phần keo từ máu người động vật mang lại nguy lây nhiễm virus nguy gây phản ứng miễn dịch từ protein dị loại Fibrin tự thân nghiên cứu phát triển để khắc phục nhược điểm cách tách chiết thành phần keo từ máu bệnh nhân Keo fibrin bao gồm hai thành phần fibrinogen thrombin, cho hai thành phần kết hợp với thrombin chuyển hóa fibrinogen thành fibrin(1,8,14) Các sợi hình thành nên mạng lưới không gian ba chiều để tạo thành khối kéo kết dính với Sự đời keo fibrin mang lại nhiều lựa chọn cho ngành ngoại khoa nói chung ngành nhãn khoa nói riêng Theo đó, keo fibrin thay vai trò khâu phẫu thuật mộng thịt giải pháp hợp lý, giúp rút ngắn thời gian phẫu thuật, cải thiện thoải mái sau mổ tránh vấn đề liên quan đến khâu Keo fibrin tự thân thu từ máu ngoại vi bệnh nhân mộng thịt Khoa Giác Mạc, Bệnh viện Mắt TP HCM ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu thực nghiệm mô tả Phương pháp nghiên cứu Phân lập fibrinogen thrombin Fibrinogen thu nhận từ máu ngoại vi (máu sử dụng sau làm xét nghiệm) Phần huyết tương thu sử dụng để tách chiết fibrinogen(2,9,11,13), chủ yếu theo quy trình tham khảo tác giả Glenn Isaacson(6) (đã có bước biến đổi cho phù hợp với điều kiện nghiên cứu) Theo đó, Máu thu nhận để yên 40C nhằm để phân tách thành phần máu Sau khoảng thời gian 3-4 đem quay ly tâm 3000vòng/phút 15 phút Thu nhận phần huyết tương Phần huyết tương thu được, đem đông lạnh -200C sau để qua đêm 40C Sau rã đơng 2-40C Ly tâm phần huyết tương rã đơng 3000 vòng/phút, 15 phút Loại bỏ dịch nổi, chừa lại 0.5 ml huyền phù cặn lắng với nước cất Phần dịch dịch fibrinogen bảo quản tube eppendorf (1 ml/1vial) điều kiện bảo quản -200C sử dụng vòng tháng Tồn q trình tiến hành điều kiện vô trùng Thrombin thu nhận theo phương pháp Saxena S(10) có bước điều chỉnh để phù hợp với điều kiện nghiên cứu Theo đó, máu thu nhận để yên 40C nhằm để phân tách 95 Nghiên cứu Y học thành phần máu Sau khoảng thời gian 34 đem quay ly tâm 3000vòng/phút 15 phút Thu nhận khoảng 1ml huyết tương cho vào type bảo quản qua đêm -200C Lấy ml huyết tương đông lạnh đem rã đơng 2-40C pha lỗng với nước cất tạo thành 10 ml dung dịch Thêm dung dịch acid acetic 1% (tạo pH 5.3) Lắc sau để n để tạo kết tủa vòng 30 phút Ly tâm 3000 vòng/phút phút Thu tủa lắng, thêm dung dịch DPBS vào điều chỉnh pH 7.0 (sử dụng dung dịch Na2CO3 0,01M) Đặt dung dịch mơi trường có nhiệt độ 370C 15 phút sau bổ sung CaCl2 0,1M Xuất khối đơng đục vòng 12 phút Để thu nhận dung dịch thrombin suốt, dùng đũa thủy tinh khuấy tròn để cuộn phần tủa đục vào đầu đũa, phần lại thrombin Cho vào tube eppendorf Dung dịch thrombin bảo quản -200C sử dụng vòng tháng Tồn q trình tiến hành điều kiện vô trùng Phương pháp tạo keo fibrin Keo fibrin tạo dựa kết hợp fibrinogen thrombin theo tỉ lệ thể tích phù hợp để tạo keo theo tiêu chí keo tạo thời gian nhanh nhất, khối keo đồng keo có độ bền cao Đánh giá cấu trúc keo fibrin Sau keo tạo đánh giá cấu trúc mô học (nhuộm H&E), đánh giá đặc điểm bề mặt keo (SEM) Ngồi ra, keo fibrin khảo sát thời gian đơng thời gian hủy keo để có khảo sát sơ thời gian để giúp nhà lâm sàng ứng dụng keo lâm sàng Đánh giá đặc điểm an toàn sinh học keo fibrin Keo thu nhận phân lập điều kiện vô trùng, đảm bảo tối đa tiêu chí vơ trùng cho sản phẩm Tiếp theo, keo đánh giá độ vô khuẩn theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV để kiểm tra sản phẩm keo phải đạt độ vô khuẩn 96 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Ngoài ra, keo đánh giá khả gây độc tế bào theo tiêu chuẩn ISO: 10993-5 điều kiện nghiên cứu in vitro Đây bước đánh giá khả gây độc có keo với tế bào Ngồi tiêu chí đánh giá trên, keo fibrin tạo hướng đến keo dán mơ tự thân, tạo từ máu người bệnh keo đáp ứng tiêu chí tương hợp sinh học an tồn cho người bệnh loại trừ yếu tố nguy lây nhiễm bệnh (các bệnh lây nhiễm từ virus HIV, Viêm gan B, C …) loại trừ nguy từ protein ngoại lại (như trường hợp keo sinh học sản xuất có nguồn gốc từ động vật – keo dị loại) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đánh giá giới hạn nhiễm khuẩn Keo fibrin tạo phải phải đảm bảo vô khuẩn theo tiêu chuẩn giới hạn nhiễm khuẩn, phụ lục 13.6, Dược điển Việt Nam IV (2009) Đây phương pháp nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn hiếu khí, nấm, mốc có khả sống lại phát vi khuẩn điểm y tế có sản phẩm Thử nghiệm thực Trung tâm kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Dược phẩm (thuộc Sở Y Tế TP.HCM) Kết đánh giá độ vô khuẩn cho thấy, khung fibrin khối đặc, trong, màu sắc vàng, đạt độ vo khuẩn theo tiêu chí Dược điển Việt Nam IV Đánh giá độc tính tế bào Đánh giá độc tính cấp tính vật liệu tế bào điều kiện in vitro theo tiêu chí ISO 10993-5:2009 (Tests for Cytotoxicity—In Vitro Methods) Tế bào nuôi keo fibrin đĩa giếng Được quan sát kính hiển vi đảo ngược để theo dõi đánh giá bám dính phát triển nguyên bào sợi khoảng thời gian 48 Sau khoảng thời gian theo dõi đánh giá cho thấy, keo fibrin không gây độc tế bào điều kiện nghiên cứu in vitro Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học A B C Hình Kết đánh giá khả gây độc in vitro keo fibrin nguyên bào sợi (A) Mẫu chứng, khơng có ni tế bào (B) Keo fibrin sử dụng để nuôi nguyên bào sợi khoảng 24 đầu, tế bào bắt đầu cố định bám dính, chưa có nhiều tế bào phát triển (chủ yếu tế bào tròn, bầu dục) (20X) (C) Sau khoảng thời gian 24-48 nuôi cấy, tế bào bắt đầu phân chia mạnh, có hình thái đặc trưng ngun bào sợi (20X) Đánh giá cấu trúc keo A B C Hình Kết đánh giá cấu trúc keo fibrin (A) Kết sau tạo keo fibrin quan sát kính hiển vi đảo ngược (10X) (B) Kết nhuộm H-SG cho keo fibrin chụp vật kính 10X (C) Kết khảo sát bề mặt khung kính hiển vi điện tử truyền suốt (SEM, x400) khung fibrin thể để ngăn trình chảy Khung fibrin sau tạo tiến hành máu cách tạo cục máu đơng, có chất nhuộm H-SG SEM Dựa vào kết thu khung fibrin từ nhuộm H-SG SEM khung fibrin, đưa nhận định chung, khung fibrin có cấu trúc xốp, cấu tạo từ sợi protein đan chéo vào Sợi protein có đường kính trung bình khoảng 0,5 µm, kích thước lỗ khơng đồng tồn khung, kích thước dao động nằm khoảng từ 30-60 µm Kết phù hợp với trình tạo Đánh giá khả tạo keo Chúng thay đổi tỉ lệ thể tích kết hợp fibrinogen thrombin theo nhiều cách kết hợp khác dựa số nghiên cứu tác giả giới tỉ lệ kết hợp hai thành phần này(3,5) Từ có bảng số liệu: Bảng 1: Tóm tắt kết tạo keo fibrin theo tỉ lệ thể tích khác fibrinogen thrombin Tỉ lệ thể tích kết hợp fibrinogen Tỉ lệ (v/v; ml/ml) Fibrinogen (ml) Thrombin (ml) Kết tạo khối keo Thời gian đông Không tạo keo Không tạo keo 97 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học thrombin (ml) 1 Không tạo keo Không tạo keo Tạo keo Keo đáp ứng khía cạnh an tồn cho người bệnh (trong trường hợp thử nghiệm khơng có trường hợp bị dị ứng thu nhận từ huyết tự thân), khơng có trường hợp bị nhiễm trùng(12) Đánh giá hiệu bước đầu bệnh nhân điều trị phẫu thuật mộng thịt Chúng tiến hành sử dụng quy trình thiết lập để thử nghiệm keo fibrin trường hợp điều trị phẫu thuật mộng thịt ghép mô Nghiên cứu triển khai thử nghiệm Khoa Giác Mạc, Bệnh viện Mắt TP HCM Thử nghiệm keo fibrin tự thân thông qua Hội đồng Y đức Bệnh viện Ngoài ra, bệnh nhân tự nguyện tham gia nghiên cứu với phiếu cam kết đồng ý tham gia chương trình nghiên cứu Các phương pháp nghiên cứu tiến hành phẫu thuật tiến hành điều kiện vô trùng nghiêm ngặt Phòng thí nghiệm theo quy trình phẫu thuật cho phép bệnh viện Đặc biệt hài lòng người bệnh sử dụng keo fibrin làm chất kết dính mảnh ghép so với dùng khâu Vicryl Khi sử dụng khâu, người bệnh có cảm giác khó chịu, khơng thoải mái thời gian khâu tiêu biến lâu so với sử dụng keo fibrin tự thân Bên cạnh đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đối chứng với keo fibrin thương mại Khi so sánh keo fibrin tự thân với keo thương mại kết cho thấy Keo thương mại có sử dụng huyết bò nên số trường hợp có gây dị ứng, thời gian keo thương mại tác dụng nhanh (khoảng 30 giây) nên đòi hỏi phẫu thuật phải thực nhanh chóng Trong đó, keo fibrin tạo hồn tồn từ máu người bệnh (keo fibrin tự thân) Kết cho thấy thời gian để keo dính khoảng phút (khi so sánh điều kiện in vitro khoảng 30 giây – phút), thời gian đủ để nhà phẫu thuật hồn tất quy trình phẫu thuật Trong tất trường hợp sử dụng trường hợp bị bong mảnh ghép, keo dính tốt đáp ứng tiêu chí loại keo dán mơ(4,7) A 30s – 1phút Ngồi ra, keo fibrin thương mại có giá thành cao (ví dụ, TISSEEL Lyo (2ml), Baxter, £80.34; Evicel Fibrin Sealant, LTD 3905, Omrix Biopharmaceuticals, $79.99) Trong đó, keo fibrin tự thân sản xuất với chi phí ước lượng khoảng $20) B C D Hình Kết ghép tế bào gốc rìa giác mạc collagen sử dụng keo fibrin tự thân để giữ ghép ghép cho thấy an toàn, hiệu Keo giữ mảnh Bệnh nhân phẫu thuật loại bỏ mộng ghép tốt, không gây viêm, không gây dị ứng, thịt sử dụng tế bào gốc rìa giác mạc để tái tạo giúp nâng cao hiệu điều trị bệnh lại vùng mô, tế bào nuôi cấy nhân bị mông thịt mắt collagen cố định keo fibrin tự thân từ máu ngoại vi người bệnh (A) Bệnh nhân bị mộng thịt (B) Một ngày sau ghép (C) Một tuần sau ghép (D) Tám tuần sau ghép Kết sử dụng keo fibrin tự thân để cố định mảnh 98 KẾT LUẬN Keo fibrin nghiên cứu ứng dụng từ sớm nhiên nước ta chưa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 quan tâm nghiên cứu cách tồn diện để đưa sản phẩm keo fibrin triển khai ứng dụng lâm sàng rộng phát triển thành sản phẩm thương mại Nhóm nghiên cứu cố gắng tìm phương pháp đơn giản để tạo keo dán nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị người bệnh, cụ thể trường hợp điều trị phẫu thuật mộng thịt Keo fibrin cho thấy hiệu quả, an toàn giảm bớt gánh nặng chi phí điều trị cho người bệnh sử dụng loại keo thương mại Ngoài ra, sử dụng keo fibrin người bệnh hài lòng với cảm giác dễ chịu phải sử dụng khâu Nhóm nghiên cứu tiếp tục cơng việc để cải thiện quy trình nghiên cứu nhằm tạo quy trình chuẩn hóa để tạo loại keo fibrin tự thân an tồn, hiệu làm keo dán mơ đánh giá nhiều bệnh nhân mộng thịt để đánh giá cách tồn diện hiệu keo fibrin tự thân so với keo thương mại so với khâu để phát triển quy trình điều trị thường quy bệnh viện để nâng cao hiệu điều trị chăm lo sức khỏe người bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO Albala DM (2003), Fibrin sealants in clinical practice Cardiovasc Surg, 11, 5-11 Alston SM; Solen KA, Broderick AH, et al (2007) New method to prepare autologous fibrin glue on demand Translational Research, 149:187-195 Nghiên cứu Y học 10 11 12 13 14 Barker TH, Fuller GM, Klinger MM, et al (2001) Modification of fibrinogen with poly(ethylene glycol) and its effects on fibrin clot characteristics J Biomed Mater Res, 56:529-535 Currie LJ, Sharpe JR, Martin R (2001), The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review, Plast Reconstr Surg, 108, 1713-26 Doolittle RF, Spraggon G, and Everse SJ (1997) Evolution of vertebrate fibrin formation and the process of its dissolution Ciba Foundation Symposium, 212: 4–17 Isaacson G, and Herman JH, (1996), Autologous Plasma Fibrin Glue: Rapid Preparation, American Journal of Otolaryngology, 17(2):92-94 Ochsner MG (1998), Fibrin solutions to control hemorrhage in the trauma patient J Long Term Eff Med Implants, 8, 161-73 Quinn JV, Ed (2005), Tissue Adhesives in Clinical Medicine, BC Decker Inc, Hamilton, p.1 Radosevich M, Goubran HI, Burnouf T (1997), Fibrin sealant: scientific rationale, production methods, properties, and current clinical use Vox Sang, 72, 133-143 Saxena S, Jain P, Shukla J (2003), Preparation of two component Fibrin Glue and its clinical evaluation in skin grafts and flaps, Indian Journal Plastic Surgery, 36(1):14-17 Silver FH, Wang MC, Pins GD (1995) Preparation and use of fibrin glue in surgery Biomaterials, 16:891-903 Staindl O (1979), Tissue adhesion with highly concentrated human fibrinogen in otolaryngology, Ann Otol Rhinol Laryngol, 88, 413-18 Suh M, Cha CI (1993) Biochemical aspects of autologous fibrin glue derived from ammonium sulfate precipitation Laryngoscope, 103:193-196 Wheat JC, Wolf JS, Jr (2009), Advances in bioadhesives, tissue sealants, and hemostatic agents, Urol Clin North Am, 36, 26575.2 Ngày nhận báo: 12/10/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 19/10/2015 Ngày báo đăng: 05/11/2015 99 ... keo fibrin tự thân an tồn, hiệu làm keo dán mơ đánh giá nhiều bệnh nhân mộng thịt để đánh giá cách tồn diện hiệu keo fibrin tự thân so với keo thương mại so với khâu để phát triển quy trình điều. .. giản để tạo keo dán nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị người bệnh, cụ thể trường hợp điều trị phẫu thuật mộng thịt Keo fibrin cho thấy hiệu quả, an toàn giảm bớt gánh nặng chi phí điều trị cho người... từ huyết tự thân) , khơng có trường hợp bị nhiễm trùng(12) Đánh giá hiệu bước đầu bệnh nhân điều trị phẫu thuật mộng thịt Chúng tiến hành sử dụng quy trình thiết lập để thử nghiệm keo fibrin trường