Bài viết nghiên cứu Nghiên cứu môi trường bảo tồn tinh dịch của cừu ở nhiệt độ 5 °C; so sánh sức sống của tinh trùng cừu được bảo tồn trong môi trường TR và môi trường TR-glyxêrol 1%...
27(3): 88-91 9-2005 Tạp chí Sinh học Nghiên cứu môi trờng bảo tồn tinh dịch cừu nhiệt độ 5oC Đỗ Văn Thu, Lê Thành Đô, Nguyễn Anh Viện Công nghệ sinh học Nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thụ tinh tinh trùng sau bảo tồn giảm hoạt lực tinh trùng tăng số tinh trùng bị phá huỷ cấu trúc Để trì sức sống tinh trùng thời gian bảo tồn, cần quan tâm đến môi trờng pha lo ng nhiệt độ bảo tồn tinh dịch Nếu bảo tồn tinh dịch nhiệt độ 15oC môi trờng sữa đ loại bỏ chất béo, tinh trùng có khả thụ tinh tốt vòng 24 sau lấy tinh [5]; bảo tồn tinh dịch 5oC môi trờng Tris-fructoza-lòng đỏ trứng gà, tinh trùng có khả trì vận động khả thụ tinh khoảng thời gian dài [4] Tuy nhiên, tinh dịch cừu đợc bảo tồn 5oC có thay đổi màng sinh chất tinh trùng, gây nhiệt độ lạnh [2] Trong công trình này, nghiên cứu môi trờng bảo tồn tinh dịch cừu 5oC I Phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Thí nghiệm đợc thực với 60 mẫu tinh dịch đợc lấy từ cừu ®ùc gièng Phan Rang cã träng l−ỵng 30-50 kg, ë tuổi đến năm, khoẻ mạnh, giao phối thục, đợc nuôi Trung tâm nghiên cứu dê thỏ Sơn Tây Phơng pháp Lấy tinh dịch âm đạo giả (nhiệt độ âm đạo giả 45oC) Kiểm tra chất lợng tinh dịch sau lấy, sử dụng mẫu tinh dịch có hoạt lực tiến thẳng tinh trùng 70% Hoạt lực tiến thẳng (A) tinh trùng đợc xác định theo phơng ph¸p cđa Milovanov (1962) Tû lƯ tinh trïng sèng theo phơng pháp Morozov (1938) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình theo phơng pháp Serdiuc (1970) Môi trờng pha lo ng: môi trờng Tris (TR): Tris-axit xitric-fructoza-lòng đỏ trứng gà88 chất kháng khuẩn; môi trờng Tris-bổ sung 1% glyxêrol (TR-Gly1%); môi trờng Tris-bổ sung 5% glyxêrol (TR-Gly5%); môi trờng Tris-bổ sung 6% dimethylsulfoxit (TR-DMSO 6%) Pha môi trờng vào tinh dịch theo tỷ lệ 1:6 (tinh dịch:môi trờng), nhiệt độ môi trờng pha lo ng vào tinh dịch 34oC Tinh dịch pha lo ng đợc đựng lọ kín cân cốc nớc 34oC, sau chuyển vào tủ bảo tồn 5oC Trong thời gian bảo tồn, tinh dịch pha lo ng đợc đảo nhẹ Theo dõi sức sống tinh trùng bảo tồn 5oC thời điểm sau pha lo ng: giê, 24 giê, 48 giê, 72 giê, 96 120 Khi đánh giá phẩm chất tinh dịch pha lo ng, mẫu tinh dịch đợc đ ë 38oC Sư dơng kÝnh hiĨn vi Olympus víi độ phóng đại 100-1000 lần Số liệu xử lý theo chơng trình phần mềm excel 5.0 II Kết thảo luận So sánh sức sống tinh trùng cừu đợc bảo tồn môi trờng TR môi trờng TR-glyxêrol 1% Kết trình bày bảng cho thấy: sau 96 bảo tồn tinh dịch hai môi trờng TR TR-Gly1%, tinh trùng có hoạt lực tiến thẳng tỷ lệ sống khác không cã ý nghÜa (p > 0,05) Nh−ng sau 120 giê bảo tồn, tinh trùng bảo tồn môi trờng TRGly1% có hoạt lực tiến thẳng cao có ý nghĩa (p < 0,05) so víi m«i tr−êng TR Sau 96 bảo tồn tinh dịch môi trờng TR, tỷ lệ sống tinh trùng khác ý nghĩa, so với bảo tồn tinh dịch môi trờng TR-Gly1% Kết nhận đợc cho thấy: bảo tồn tinh dịch vòng 96 không cần bổ sung glyxêrol vào môi trờng Bảng Hoạt lực tû lƯ sèng cđa tinh trïng hai m«i tr−êng TR TR- Gly1% Số Hoạt lực tiến thẳng (%) cđa tinh trïng Tû lƯ sèng (%) cđa tinh trïng TR TR-Gly 1% TR TR-Gly 1% 87,86±5,08 88,75±3,54 - - 24 78,89±11,83 79,17±3,76 79,88±12,17 79,98±5,32 48 76,00±3,87 74,17±3,76 76,14±11,53 74,31±6,07 72 68,33±4,50 64,17±8,01 70,60±11,87 64,70±11,46 96 51,50±18,58 55,00±4,08 64,67±13,43 60,22±3,74 120 30,30±20,33 45,00±7,07 46,33±13,08 51,59±12,48 b¶o tån tinh trùng cừu nhiệt độ 5oC không cần thiết phải bổ sung glyxêrol với nồng độ 5% Việc bổ sung glyxêrol với nồng độ 5% làm thay đổi đặc điểm hóa lý môi trờng TR, đặc biệt độ nhớt theo hớng lợi cho tr× søc sèng cđa tinh trïng Tû lƯ sèng tỷ lệ kỳ hình tinh trùng khác ý nghĩa tinh trùng đợc bảo tồn m«i tr−êng TR so víi m«i tr−êng TR-Gly 5% So sánh sức sống tinh trùng cừu đợc bảo tồn môi trờng TR môi trờng TR-glyxêrol 5% KÕt qu¶ ë b¶ng cho thÊy: bỉ sung 5% glyxêrol vào môi trờng TR, khả trì sức sống tinh trùng không đợc cải thiện, chí hoạt lực tiến thẳng tinh trùng giảm cã ý nghÜa (P < 0,05) so víi m«i tr−êng TR, sau 96 bảo tồn Điều có nghĩa Bảng Kết bảo tồn tinh dịch cừu hai môi trờng TR TR-Gly 5% Số Hoạt lực tiến thẳng (A%) TR TR-Gly5% Tỷ lệ tinh trïng sèng (%) Tû lƯ tinh trïng kú h×nh (%) TR 88,33 ± 4,08 TR-Gly5% 91,14 ± 5,34 TR TR-Gly5% 3,03 ± 1,12 24 81,67±2,89 81,67±2,89 86,25±1,61 88,03±2,27 3,32±0,56 3,06±1,02 48 73,33±2,89 73,33±2,89 82,24±2,43 80,75±1,69 4,41±0,83 3,92±1,48 72 68,33±2,89 65,00±5,00 80,92±2,54 79,78±1,25 4,97±1,20 4,76±1,00 96 41,67±27,54 31,67±22,55 75,15±2,77 73,93±2,60 5,69±0,58 5,15±1,39 120 26,67±25,17 20,00±26,46 58,85±8,29 56,68±1,50 6,06±0,72 5,88±1,28 So sánh sức sống tinh trùng cừu đợc bảo tồn môi trờng TR-Gly1% môi trờng TR-DMSO 6% Kết bảng cho thấy: hoạt lực tiến thẳng tinh trùng bảo tồn môi trờng TR-DMSO 6% cao ý nghĩa (P > 0,05) so với bảo tồn tinh dịch môi trờng TR-Gly1% Tinh dịch đợc bảo tồn môi trờng TR-DMSO 6% có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thấp có ý nghĩa (p < 0,05) so với tinh dịch đợc bảo tồn môi trờng TR-Gly1% Theo chúng tôi, việc bổ sung 6% dimethylsulfoxit vào môi trờng TR có tác dơng tr× søc sèng cđa tinh trïng v× chóng có khả giúp cho tinh trùng chống đợc tợng sốc lạnh, tinh trùng bị tổn thơng cấu trúc trình đông lạnh bảo tồn lạnh 87 89 Bảng Kết bảo tồn tinh dịch cừu hai môi trờng TR-Gly 1% TR-DMSO 6% Giờ Hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%) TR-Gly1% Tû lƯ tinh trïng kú h×nh (%) TR-DMSO 6% TR-Gly1% 88,75±2,50 TR-DMSO 6% 2,36±1,24 24 77,50±2,89 82,50±5,00 5,36±2,84 4,10±1,94 48 72,50±2,89 77,50±2,89 7,83±3,57 4,40±2,34 72 65,00±0,00 68,75±2,50 10,31±5,09 5,02±1,94 96 55,00±4,08 57,50±2,89 10,96±5,40 6,48±3,69 120 45,00±7,07 48,75±6,29 11,36±6,30 8,132,74 So sánh hoạt lực tiến thẳng tinh trùng cừu đợc bảo tồn 5oC bốn môi trờng Hoạt lực tiến thẳng tinh trùng cừu bảo tån ë 5oC m«i tr−êng TR, TRGly1%, TR-Gly 5% TR-DMSO 6% đợc trình bày bảng Bảng cho thấy tinh dịch cừu pha lo ng với bốn môi trờng đợc bảo tồn 5oC có hoạt lực tiến thẳng tinh trùng giảm dần tỷ lệ thuận với thời gian bảo tồn Sau 48 bảo tồn tinh dịch môi trờng, hoạt lực tiến thẳng tinh trùng khác ý nghĩa Tuy nhiên, hoạt lực tiến thẳng tinh trùng cao trờng hợp tinh dịch đợc pha với môi trờng TR TRDMSO 6% thời điểm 72 sau bảo tồn, tinh dịch đợc pha với môi trờng TR-Gly 5% có hoạt lực tiến thẳng thấp có ý nghĩa so với môi trờng khác Hoạt lực tiến thẳng tinh trùng giảm nhiều sau 96 bảo tồn tinh dịch môi trờng TR môi trờng TR-Gly 5% Bảng o Hoạt lực tiến thẳng (%) tinh trùng cừu đợc bảo tồn ë C m«i tr−êng Giê M«i tr−êng TR 24 48 72 96 120 87,45 81,02 75,61 68,47 44,59 28,49 M«i tr−êng TRGly1% 88,75 78,47 73,06 64,31 55,00 45,00 Kết cho thấy môi trờng có thành phần tris có ảnh hởng tốt, trì sức sống tinh trùng bảo tồn Thành phần tỷ lệ khác chất bảo vệ lạnh có ảnh hởng khác khả trì sức sống bảo vệ cấu trúc tinh trùng Tris môi trờng có tác dụng đệm tốt khuyếch tán dễ dàng vào tế bào tinh trùng, thoả m n giống nh chất nội bào Trong trình bảo tồn lạnh, màng tinh 90 88 Môi trờng TRGly5% 88,54 81,88 74,06 58,44 27,38 20,00 M«i tr−êng TRDMSO 6% 88,75 82,50 77,50 68,75 57,50 48,75 trùng bị phá huỷ thay đổi xảy trình hạ nhiệt độ từ 37oC đến 5oC trình ủ 5oC [9] Bảo tồn tinh dịch cừu 15oC không trì khả thụ tinh tinh trùng sau số ngày Bảo tồn tinh dịch cừu 5oC có khả trì vận động khả thụ tinh tinh trùng khoảng thời gian dài Tuy nhiên, tinh dịch cừu bảo tồn 5oC có thay đổi màng sinh chất gây nhiệt độ lạnh [2] Tinh dịch ủ 5oC, thay đổi sốc nhiệt tạo thay đổi tinh trùng, nhng không đến mức phá huỷ tinh trùng Tinh trùng cần chất trao đổi dễ dàng để trì lợng cho hoạt động chúng; lòng đỏ trứng cung cấp chất cho trao đổi chất tinh trùng; phôtpholipit lòng đỏ trứng bảo vệ màng tinh trùng chống lại sốc nhiệt [7]; lòng đỏ trứng có khả làm giảm tốc ®é peroxy hãa ë tinh trïng cõu [3] ViƯc thªm số chất chống ôxy hóa vào môi trờng tris có ảnh hởng tốt trì sức sống bảo vƯ acrosom cđa tinh trïng b¶o tån láng ë 5oC [6] Hoạt động bảo vệ nhân tố bảo vệ lạnh nh glyxêrol có khả đệm muối, giảm đợc phá huỷ điện giải loại nớc [1] Thêm glyxêrol vào môi trờng có tác dụng nâng cao sức sống tinh trùng bảo quản 4oC [8] III Kết luận Môi trờng có thành phần tris có khả trì tốt sức sống tinh trùng cừu bảo tồn nhiệt độ 5oC Bổ sung 1% glyxêrol 6% dimethylsulfoxit vào môi trờng tris có ảnh hởng tốt trì hoạt lực tiến thẳng tinh trïng cõu b¶o tån ë 5oC Bỉ sung 5% glyxêrol vào môi trờng tris có ảnh hởng làm giảm khả trì sức sống tinh trùng cừu sau 72 bảo tồn Tài liệu tham khảo Graham E F., 1978: Fundamentals of the preservation of spermatozoa The integrity of frozen spermatozoa: 4-44 Nat Acad Sci., Washington DC Holt W V and North R D., 1984: J Exp Zool , 230: 473-483 Jones R., Mann T., 1977: J Reprod Fertil , 50: 261-268 Lãpez A et al., 1999: Acta vet Scand., 40: 19 Lãpez-S¸ez A et al., 2000: Archi Andro., 44: 155-164 Maxwell W M C and Stojanov T., 1996: Reprod Fertil Dev., 8: 1013-1020 Maxwell W M C., Salamon S., 1993: Reprod Fertil Dev., 5: 613-38 Shannon P., 1964: N Z J Agric Res., 7: 357-363 White I G., 1993: Reprod Fertil Dev., 5: 639-58 research on the diluents for liquid storage at 5oC of ram semens Do Van Thu, Le Thanh Do, Nguyen Anh Summary This research was performed on 60 semen samples collected from four Phanrang breed rams at the Sontay goat and rabbit research Centre (Hatay province) After the collection, only the samples with good progressive motion (> 70%) were accepted and diluted into diluents The finally dilute rate was 1:6 (semen:diluent) The temperature of diluents when they were diluted into the semens was 34oC and the stored temperature was 5oC Research was performed on four diluents: TR diluent (Tris-citric acid-fructose-egg yolk-penicillin and streptomycin), TR diluent with 1% Glycerol, TR diluent with 5% glycerol and TR diluent with 6% DMSO The progressive motion, the survival rate and the abnormal rate of spermatozoa were evalued during the storage time The results showed that the TR diluent had maitained a good viability of spermatozoa Semens stored in the diluents, which had been added either with 1% glycerol or 6% DMSO, had good viability uper 96 hours The addition of 5% glycerol into the TR diluent reduced its ability to maitain the viability of permatozoa after 72 hours of storage Ngµy nhËn bµi: 28-6-2004 89 91 ... nhiệt độ từ 37oC đến 5oC trình ủ 5oC [9] Bảo tồn tinh dịch cừu 15oC không trì khả thụ tinh tinh trùng sau số ngày Bảo tồn tinh dịch cừu 5oC có khả trì vận động khả thụ tinh tinh trùng khoảng thời... 77 ,50 ±2,89 82 ,50 5, 00 5, 36±2,84 4,10±1,94 48 72 ,50 ±2,89 77 ,50 ±2,89 7,83±3 ,57 4,40±2,34 72 65, 00±0,00 68, 75 2 ,50 10,31 5, 09 5, 02±1,94 96 55 ,00±4,08 57 ,50 ±2,89 10,96 5, 40 6,483,69 120 45, 007,07 48, 756 ,29... 68,33±2,89 65, 00 5, 00 80,92±2 ,54 79,78±1, 25 4,97±1,20 4,76±1,00 96 41,67±27 ,54 31,67±22 ,55 75, 15 2,77 73,93±2,60 5, 69±0 ,58 5, 15 1,39 120 26,67± 25, 17 20,00±26,46 58 , 85 8,29 56 ,68±1 ,50 6,06±0,72 5, 88±1,28