Chất lượng tinh dịch và sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường bảo quản tinh dịch lợn không chứa kháng sinh ở nhiệt độ thấp

Đề tài này được tiến hành nhằm đánh giá chất lượng tinh dịch và sự phát triển của tổng số vi khuẩn hiếu khí trong môi trường bảo quản tinh dịch lợn không chứa kháng sinh ở 5°C. Tinh dịch lợn Duroc sau khai thác được bảo quản trong môi trường BTS và AndroStar Premium có chứa kháng sinh ở 17°C và không chứa kháng sinh ở 5°C. Mời các bạn cùng tham khảo!

Vietnam J Agri Sci 2021, Vol 19, No 9: 1150-1158 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(9): 1150-1158 www.vnua.edu.vn CHẤT LƯỢNG TINH DỊCH VÀ SỰ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN TRONG MÔI TRƯỜNG BẢO QUẢN TINH DỊCH LỢN KHÔNG CHỨA KHÁNG SINH Ở NHIỆT ĐỘ THẤP Bùi Huy Doanh*, Đinh Thị Yên, Đặng Thái Hải, Phạm Kim Đăng Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: bhdoanh@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 19.02.2021 Ngày chấp nhận đăng: 13.07.2021 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành nhằm đánh giá chất lượng tinh dịch phát triển tổng số vi khuẩn hiếu khí môi trường bảo quản tinh dịch lợn không chứa kháng sinh 5°C Tinh dịch lợn Duroc sau khai thác bảo quản môi trường BTS AndroStar Premium có chứa kháng sinh 17°C khơng chứa kháng sinh 5°C Các mẫu tinh dịch kiểm tra hoạt lực, tỉ lệ tinh trùng kỳ hình phát triển tổng số vi khuẩn hiếu khí sau 24, 72 120 bảo quản Kết cho thấy tinh dịch bảo quản 5°C môi trường AndPre có hoạt lực tinh trùng 75% sau ngày bảo quản khơng có sai khác so với mẫu đối chứng bảo quản 17°C (P 0,05) Tổng sổ vi khuẩn hiếu khí mẫu tinh dịch bảo quản 5°C không chứa kháng sinh nhỏ 10 CFU/ml, khơng có sai khác so với mẫu tinh dịch bảo quản 17°C (P >0,05) Do đó, bảo quản tinh dịch mơi trường AndPre khơng có kháng sinh 5°C khơng ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch, đồng thời góp phần hạn chế việc sử dụng kháng sinh chăn nuôi Từ khóa: Tinh dịch, bảo quản, chất lượng tinh, nhiệt độ, vi khuẩn Semen Quality and Bacterial Growth in Boar Semen Extender Preserved at Low Temperature ABSTRACT This study was to evaluate the effect of hypothermic preservation strategy on semen quality as well as the bacterial growth in antibiotic-free extender at 5°C Diluted boar semen containing antibiotic were stored in BTS and AndroStar Premium extenders at 17°C while antibiotic-free semen were stored at 5°C Sperm motility, proportion of abnormal spermatozoa and bacterial growth after 24, 72 and 120 hours preservation were investigated The results showed that the boar spermatozoa preserved in antibiotic-free AndroStar Premium extender at 5°C maintained high motility above 75% after days of preservation and did not significantly differ from the control stored at 17°C in extender containing antibiotic (P 0.05) The number of aerobic bacteria in semen samples stored at 5°C in antibiotic-free extenders was lower than 10 CFU/ml after 24, 72 and 120 hours preservation and did not differ significantly with samples containing antibiotic extender stored at 17°C (P >0.05) Therefore, semen preservation in antibiotic-free AndPre extender at low temperatures might be applied to minimize the use of antibiotics in livestock Keywords: Semen, preservation, semen quality, temperature, bacteria ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện giới, 90% lợn nái thụ tinh nhân tạo (TTNT) tinh dịch bảo quản dạng lỏng có thời gian đến ngày (Riesenbeck, 2011) Quá trình khai thác bảo 1150 quản tinh dịch lợn nước ta chưa quan tâm thích đáng Tinh dịch lợn chủ yếu cung cấp trực tiếp cho trang trại hệ thống địa phương lân cận Trong nghiên cứu chất lượng tinh dịch bảo quản nhiệt độ 17°C Bùi Huy Doanh, Đinh Thị Yên, Đặng Thái Hải, Phạm Kim Đăng (Hà Xuân Bộ & cs., 2011; Hà Xuân Bộ & cs., 2013) Nghiên cứu bảo quản tinh dịch lợn nhiệt độ thấp ảnh hưởng nhiệt độ thấp đến chất lượng tinh dịch khả thụ tinh tinh trùng chưa có Việt Nam Bảo quản tinh nhiệt độ thấp có ưu điểm: giảm trao đổi chất tinh trùng, hạn chế phát triển vi khuẩn giảm sử dụng kháng sinh môi trường bảo quản Tuy nhiên, màng tế bào tinh trùng lợn có nhiều điểm khác biệt so với tinh trùng động vật khác lượng cholesterone thấp, tỉ lệ axit béo khơng bão hịa/axit béo bão hịa cao nên tinh trùng lợn mẫn cảm với nhiệt độ nói chung shock lạnh nói riêng, dẫn tới ảnh hưởng đến tính chất màng tế bào (Yeste, 2015; Jäkel & cs., 2021b) Hơn nữa, tinh dịch lợn dễ bị nhiễm khuẩn trình khai thác, pha loãng, bảo quản nguyên nhân ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch theo thời gian bảo quản, làm giảm tỉ lệ thụ thai Trong tinh dịch bảo quản, vi khuẩn tác động đến khả di chuyển tinh trùng gây biến đổi bất thường mặt hình thái (Auroux & cs., 1991; Ubeda & cs., 2013), gây đông vón tinh dịch (Wolff & cs., 1993), giảm tính ngun vẹn màng acrosome khả sống (El-Mulla & cs., 1996; Sepúlveda & cs., 2014) Ngoài ra, vi khuẩn nguồn lây lan bệnh từ đực giống sang nhiều khác Vi khuẩn làm giảm sức khỏe khả thụ thai (Payne & cs., 2008; Martín & cs., 2010) Một nghiên cứu Ba Lan cho biết, nhiễm khuẩn sảy 99% mẫu tinh dịch lợn (Gączarzewicz & cs., 2016) Sự nhiễm khuẩn chủ yếu nhóm vi khuẩn Gram (-) phổ biến họ Enterobacteriaceae (Gączarzewicz & cs., 2016; Waberski & cs., 2019a), ngồi cịn có nhóm vi khuẩn Gram (+) Lactobacillus (Schulze & cs., 2018) Việc bổ sung kháng sinh vào mơi trường pha lỗng bảo quản tinh dịch lợn cần thiết để giảm thiểu ảnh hưởng vi khuẩn Tuy nhiên, việc bổ sung kháng sinh làm xuất chủng vi khuẩn kháng kháng sinh (Speck & cs., 2014; Schulze & cs., 2017) Đặc biệt, kháng kháng sinh người thách thức lớn nhân loại Việc hạn chế sử dụng kháng sinh nhiều nước giới đưa thành đạo luật Tại Việt Nam, theo Bộ NN&PTNT, chu kỳ chăn nuôi 72% số trang trại sử dụng loại kháng sinh để phịng bệnh kích thích sinh trưởng Trong chăn ni lợn, có đến 286,6mg hoạt chất/kg lợn (QĐ 2625/QĐBNN-TY) Điều cho thấy vấn đề lạm dụng kháng sinh kháng kháng sinh nước ta ngày nghiêm trọng Đối với việc TTNT lợn, vòng hai đầu sau thụ tinh có tới 70-90% liều tinh (30-80ml) từ đường sinh dục lợn nái thải ngồi, có kháng sinh vi khuẩn xâm nhập vào chuỗi thức ăn người (Waberski & cs., 2019a) Trong đó, bảo quản nhiệt độ thấp giải pháp làm giảm khả phát triển vi khuẩn mà sử dụng kháng sinh Một số nghiên cứu việc bảo quản sử dụng tinh trùng 5°C cơng bố bước đầu có kết khả quan (Schmid & cs., 2013a; Schmid & cs., 2013b; Waberski & cs., 2019a; Menezes & cs., 2020; Jäkel & cs., 2021a) Tuy nhiên, việc bảo quản tinh dịch 5°C gặp nhiều khó khăn q trình hạ nhiệt độ từ khai thác, sau pha loãng xuống 5°C bảo quản tác động mạnh tới chất lượng tinh trùng Xuất phát từ thực tế đó, nghiên cứu nhằm đánh giá chất lượng tinh dịch tổng số vi khuẩn hiếu khí mơi trường bảo quản tinh dịch lợn không chứa kháng sinh 5°C PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Số lượng 30 mẫu tinh nguyên khai thác từ 06 lợn đực Duroc khỏe mạnh từ đến năm tuổi nuôi Công ty Cổ phần Giống gia súc Hà Nội từ tháng đến tháng 11/2020 Các đực giống nuôi dưỡng chăm sóc điều kiện, có máng ăn, máng uống riêng tiêm phòng vacxin đầy đủ Nghiên cứu sử dụng hai loại môi trường bảo quản tinh dịch dạng lỏng: (1) Beltsville Thawing Solution (BTS) môi trường bảo quản từ đến ngày) 1151 Chất lượng tinh dịch phát triển vi khuẩn môi trường bảo quản tinh dịch lợn không chứa kháng sinh nhiệt độ thấp gồm Glucose, Hepes, Na3C6H5O7, KCl, NaHCO3, Ethylene Diaminete Traacetic axit; (2) AndroStar Premium (AndPre) môi trường bảo quản từ đến ngày gồm Glucose, Hepes, KCl, NaHCO3, Ethylene Diaminete Traacetic axit, Công ty Minitube (Tiefenbach, CHLB Đức) 2.2 Nội dung nghiên cứu Ngay sau khai thác, tinh dịch lợn kiểm tra thể tích, nồng độ, hoạt lực tinh trùng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình trước pha môi trường bảo quản dạng lỏng Chất lượng tinh dịch đưa vào nghiên cứu đạt tiêu theo TCVN 9111:2011, giống lợn ngoại - Yêu cầu kỹ thuật (hoạt lực > 80%; tỉ lệ kỳ hình < 15%, mật độ tinh trùng > 250 triệu/ml) Tinh dịch lợn bảo quản cơng thức thí nghiệm khác (Bảng 1) Môi trường BTS dùng để so sánh mẫu đối chứng dương 17°C, đối chứng âm 5°C Các môi trường bảo quản tinh dịch sử dụng nghiên cứu sản xuất theo đơn đặt hàng nhóm nghiên cứu với cơng ty Minitube (Tiefenbach, CHLB Đức) Hai môi trường bảo quản 17°C có bổ sung 0,25 mg/ml kháng sinh gentamicin sulphate tương tự việc bổ sung sản phẩm thương mại thị trường Tinh dịch đực giống pha thành liều (90 ml/liều, 20 triệu tinh trùng/ml) dùng để phân tích hoạt lực tinh trùng, tỉ lệ tinh trùng kỳ hình sau 24, 48, 72 120 bảo quản phát triển vi khuẩn sau 24, 72 120 bảo quản tủ bảo quản có hệ thống điều khiển theo dõi nhiệt độ 2.3 Phương pháp nghiên cứu Tinh dịch khai thác từ lợn đực giống thực vào buổi sáng với chu kỳ khai thác lần/tuần Mẫu tinh dịch bảo quản 17°C để nhiệt độ phòng (25°C) trước cho vào tủ bảo quản 17°C Các mẫu tinh dịch bảo quản 5°C để nhiệt độ phịng (25°C) sau để 10°C sau chuyển vào tủ bảo quản 5°C Hoạt lực tinh trùng (A, 0% ≤ A ≤ 100%) xác định hệ thống phân tích tinh dịch tự động (Computer assisted sperm analysis, AndroVision® (Minitube, Đức)), sử dụng lam kính bốn buồng đếm với độ sâu 20m (Leja, 1152 Nieuw Vennep, Netherlands) với kính hiển vi có độ phóng đại 100 lần Các mẫu tinh dịch bảo quản trộn sau lấy khoảng 2ml đem ủ bể ấm 38°C 30 phút trước kiểm tra hệ thống AndroVision có kính hiển vi, lam kính cài đặt nhiệt độ 38°C Hoạt lực tinh trùng mẫu tinh dịch pha loãng đánh giá (24, 48, 72 120 giờ) sau bảo quản thực Công ty Giống gia súc Hà Nội Nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml) xác định buồng đếm Neubauer kính hiển vi có độ phóng đại 400 lần (Paulenz & cs., 1995) Tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC, tỷ/lần) xác định tích ba tiêu V, A C Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình (K, %) xác định số tinh trùng kỳ hình (có hình thái khơng bình thường) tổng số 200 tinh trùng dung dịch 4% formol citrate kính hiển vi có độ phóng đại 1.000 lần với vật kính soi dầu Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình tinh nguyên sau 24, 48, 72 120 sau bảo quản tinh pha loãng Hình thái khơng bình thường tinh trùng xác định thơng qua việc kiểm tra hình dáng đầu, cổ tinh trùng Phần đầu tinh trùng: hình thái bất thường đầu; có mặt giọt bào tương phần đầu Phần cổ tinh trùng: tinh trùng kỳ hình cổ có mặt giọt bào tương cổ Phần thân tinh trùng: hình thái thân tinh trùng có mặt giọt bào tương thân Phần đuôi tinh trùng: hình thái (đi cong, cuộn) có mặt giọt bào tương Tỉ lệ tinh trùng tổn thương acrosome tinh nguyên tinh dịch bảo quản sau 24, 48, 72 120 thực tương tự kiểm tra hình thái tinh trùng Trong 200 tinh trùng kiểm tra hình thái bất thường acrosome acrosome bị hỏng, màng acrosome bị bong, màng không cân đối hay màng mỏng Việc kiểm tra phát triển vi khuẩn tinh dịch lợn tiến hành Phịng Thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ sinh học Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam Tổng số vi khuẩn hiếu khí xác định mơi trường thạch thường 37°C/24 theo tiêu chuẩn quốc gia TCVN 4884-1:2015 Bùi Huy Doanh, Đinh Thị Yên, Đặng Thái Hải, Phạm Kim Đăng Bảng Công thức bảo quản tinh dịch Thành phần AndPre-17°C BTS-17°C 5°C 17°C + AndPre-5°C BTS-5°C + + + BTS + AndPre + Gentamicin sulphate + + + + Ghi chú: + có áp dụng với cơng thức thí nghiệm Bảng Chất lượng tinh dịch lợn Duroc (n = 30) Chỉ tiêu Mean ± SD Cv (%) 234,12 ± 42,83 14,61 85,80 ± 4,25 4,82 Nồng độ tinh trùng (triệu/ml) 329,40 ± 54,30 18,25 Tổng số tinh trùng tiến thẳng (tỷ/lần) 65,55 ± 13,84 21,43 9,44 ± 3,60 36,38 Thể tích (ml) Hoạt lực tinh trùng (%) Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình (%) Bảng Hoạt lực tinh trùng (%) qua thời gian bảo quản (LSM) Thời gian bảo quản 24h AndPre-17°C a 84,40 a BTS-17°C 82,40 ab b AndPre-5°C b 81,80 b BTS-5°C SEM c 0,66 c 67,40 48h 82,40 77,20 77,92 60,80 0,69 72h 80,40a 74,80b 76,92b 58,80c 0,94 a b a c 0,60 120h 77,08 70,80 75,92 57,40 Ghi chú: Trong hàng giá trị LSM có chữ khác cho biết sai khác có ý nghĩa điều kiện bảo quản (P