Bài viết trình bày một số kết quả thụ tinh trứng trâu trong ống nghiệm trên nguồn nguyên liệu là trứng thu được từ lò mổ, nhằm tìm hiểu về các điều kiện nuôi thành thục trứng, thụ tinh trứng, nuôi phôi sau khi thụ tinh, tạo ra một mô hình thử nghiệm với các thông số kỹ thuật nhằm tiến tới sản xuất phôi trâu cao sản.
27(3): 82-87 Tạp chí Sinh học 9-2005 tạo phôi trâu Việt Nam thụ tinh in vitro Lê Văn Ty Viện Công nghệ sinh học Hoàng Nghĩa Sơn Viện Sinh học nhiệt đới Nguyễn Mộng Hùng Trờng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG Hà Nội Trâu Việt Nam gia súc truyền thống gắn liền với sản xuất lúa nớc mắt xích sinh thái quan trọng nông nghiệp nớc ta Mặc dù có tầm quan trọng nhng công việc chăn nuôi trâu nớc ta cha đợc quan tâm Con trâu bị cạnh tranh bò vùng có điều kiện sinh thái thích hợp cho loài động vật này, nh nơi trình độ chăn nuôi ngời dân bị hạn chế, đặc biệt vùng núi Việc đa ạt giống động vật thay loài động vật đ thích nghi lâu đời câu hỏi đặt cho chiến lợc phát triển bền vững chăn nuôi quốc gia Nói riêng đàn trâu, theo số liệu thông kê, có xu ổn định giảm Nếu giữ ổn định số đến năm 2010, đàn trâu Việt Nam có khoảng triệu Khi số lợng tăng rõ ràng nhu cầu đặt phải tăng chất lợng Sự gia tăng chất lợng, suất đa dạng sản phẩm chắn định hớng cho chăn nuôi trâu môi trờng cạnh tranh Để đáp ứng nhu cầu này, việc cải tạo di truyền trâu xu tất yếu Cấy phôi trâu lần thành công vào năm 1983 [5] Hoa Kỳ đ mở khả đẩy nhanh tiến độ di truyền loài động vật Tuy nhiên sau ®ã ng−êi ta thÊy r»ng kü tht g©y rơng trøng nhiều trâu không đáp ứng đợc việc đa công nghệ vào áp dụng ca gây rụng trứng tạo nghé Những năm gần đây, nhờ có dò siêu âm có tần số cao việc hút trứng từ động vật lớn nh trâu đợc cải tiến, cho phép thu trứng hai lần tuần, đặc biệt 82 kỹ thuật thực trạng thái sinh lý vật; điều mà gây rụng trứng nhiều không thực đợc đ tạo nguồn nguyên liệu trứng trâu lớn, gợi lại hy vọng sử dụng kỹ thuật kết hợp với thụ tinh in vitro để tạo lợng phôi lớn từ động vật có suất cao Kỹ thuật thu trứng bò, trứng trâu ovum-pickup (OPU) đợc cập nhật nớc ta Để chuẩn bị cho việc thụ tinh in vitro trứng trâu thu đợc từ trâu có suất cao, khuôn khổ công trình muốn đa số kết thụ tinh trứng trâu ống nghiệm nguồn nguyên liệu trứng thu đợc từ lò mổ, nhằm tìm hiểu điều kiện nuôi thành thục trứng, thụ tinh trứng, nuôi phôi sau thụ tinh, tạo mô hình thử nghiệm với thông số kỹ thuật nhằm tiến tới sản xuất phôi trâu cao sản I phơng pháp nghiên cứu Thu nuôi thành thục trứng trâu Thí nghiệm đợc tiến hành từ tháng đến tháng năm 2004 Viện Sinh học nhiệt đới, Hồ Chí Minh Trứng trâu đợc thu lò mổ Vissan, vào lúc mổ trâu buồng vô trùng lu động có gắn đèn cực tím Trứng đợc hút từ nang có kích thớc từ ®Õn 8mm nhê mét xy-lanh 10ml cã g¾n kim sè 18, đợc bảo quản ống poliethylen 10ml chứa 3ml dung dịch Hepes-TCM 199,5 IU/ml heparin, 5% FBS 5% dịch nang đ đợc lọc qua màng vô trùng Phần không gian lại ống đợc bơm hỗn khÝ 5% CO2, 7% O2, 88% N trén s½n từ gối khí ống đợc đậy kín, giữ ổn nhiệt xách tay nhiệt độ 38o C đa phòng thí nghiệm Tại phòng thí nghiệm, trứng đợc rửa hai lần ba loại môi trờng đồng thời ba loại môi trờng nuôi (bảng 1) Các trứng loại A B [12], có lớp cumulus toàn vẹn, đợc chọn để tiến hành nuôi thành thục Bảng Các môi trờng để nuôi thành thục trứng trâu Môi trờng M1 M2 M3 Thành phần TCM 199, 10 % FBS, 50 µM xysteamin, 10 IU/ml eCG, IU/ml hCG, 1àg/ml estradiol TCM 199, 20 % dịch nang trâu, 50 àM xysteamin TCM 199, 20 % dịch nang trâu, àg/ml estradiol, 50 àM xysteamin Dịch nang buồng trứng trâu (BFF) đợc thu từ nang không thoái hoá có đờng kính 68mm; dịch nang đợc lọc vô trùng, phân thành lợng 1ml, bảo quản đông lạnh nhiệt độ20oC, giải đông dùng hết lần 10 trứng đợc tuyển chọn nh đợc nuôi thành thục giọt (50 àl) dung dịch có thành phần nêu có phủ dầu, đĩa nhựa cm Trong suốt trình thao tác, nhiệt độ dung dịch đợc trì 36-39oC Trứng đợc nuôi thành thục 18 đến 20 điều kiện hạn chế áp suất O2, trì thành phần trộn 5% CO2, 7% O2, 88% N2 hộp nhựa, có đáy chứa nớc, đợc đặt tủ nuôi nhiệt độ ổn định 39oC Mỗi thử nghiệm đợc bố trí cho có lần lặp lại Hoạt hoá tinh trùng trâu Do nguồn tinh trùng trâu đông lạnh, thí nghiệm đợc tiến hành với tinh trùng tơi đợc thu trực tiếp từ mào tinh hoàn trâu ®ùc tõ lß mỉ Trong thêi gian vËn chun, tinh hoàn đợc giữ nớc sinh lý vô trùng để đa phòng thí nghiệm tiến hành thu tinh trùng vòng Do có số lợng tinh trùng lớn, tinh trùng đợc trực tiếp sử lý swim-up môi trờng Tyrode cải tiến không chứa BSA (Sperm-TALP) 60 phút [8] Các tinh trùng khoẻ pha dung dịch đợc thu lại ly tâm 200 g, 10 Tinh trïng tr©u sau ly t©m đợc pha vào dung dich Sperm-TALP (bảng 2) Bảng Môi trờng thụ tinh in vitro (TALP) Thành phần NaCl KCl Na HCO3 Na H2PO4H2O Hepes Na Lactat (siro 60%) Phenol Red CaCl2 2H2O MgCl2 6H2O Nång ®é (mM) 100 3,10 25,0 0,29 10,0 21,6 l/ml 2,10 1,50 Thụ tinh trứng trâu Việc thụ tinh đợc tiến hành giọt 50àl môi trờng thụ tinh TALP-IVF (không mg/100 ml 582 23,0 209 4,10 238 368 µl 100 µl 29,0 31,0 mg/500 ml 2910 115,0 2910 20,50 1190 1840 àl 500 àl 145,0 155,0 chứa BSA glucoza), cã bæ sung IU/ml heparin (H3149, Sigma), 10 mM penixillamin (P4875, Sigma), 15 mM hypotôrin (H1384, Sigma) mM epinephrin (E4250, Sigma) 83 Môi trờng đợc cân pha khí nhiệt độ trớc chuyển 10 trứng đ thành thục vào Tinh trùng đ hoạt hóa đợc ly tâm lần thứ hai, pha lại vào dung dịch TALP-IVF đợc đa vào giọt thụ tinh với thĨ tÝch cho nång ®é cđa tinh trïng giọt môi trờng đạt 2x106 /ml Nuôi trứng với tinh trùng điều kiện giống nh nuôi thành thục trøng: nhiƯt ®é 39o C, khÝ trén 5% CO2, 7% O2, 88% N2, độ ẩm b o hoà, 20-22 Tạo cụm tế bào ống dẫn trứng trâu ống dẫn trứng trâu động dục (căn vào mức độ phát triển thể vàng buồng trứng bên) đợc thu sau trâu bị giết mổ Các ống dẫn trứng đợc bảo quản dịch sinh lý có bổ sung chất kháng sinh đợc chuyển phòng thí nghiệm Tại đây, ống dẫn trứng đợc loại bỏ mô liên kết mô mỡ bám dính, cắt bỏ phần phễu, nhúng nhanh vào cồn 900 thấm khô vòng 30 giây Dùng xy-lanh 10ml bơm vào ống dẫn trứng 1ml dung dịch TCM 199 Dïng kĐp vt nhĐ èng theo chiỊu tõ phía tử cung xuống, cho lớp niêm mạc bên tách rời vào dung dịch chảy vào ống nhùa 1,5ml Dïng xy-lanh 10ml víi kim 18 hót lªn đẩy xuống vài lần cho mảnh niêm mạc vỡ thành cụm có kích thớc tơng đối đồng 200-400à Nuôi cụm tế bào m«i tr−êng TCM 199, 10% FBS 10-12 giê; kiĨm tra thấy cụm tế bào chuyển động mạnh nhờ vi-lông, không bị nhiễm dùng để nuôi kết hợp với phôi Nuôi phôi sau thụ tinh Hai dạng môi trồng nuôi phôi sau thụ tinh đợc thử nghiệm SOF, 5% FBS [8] SOF, 5% FBS kết hợp với cụm tế bào ống dẫn trứng trâu giai đoạn sau rụng trứng Năm trứng sau thụ tinh IVF đợc chuyển vào giọt nuôi 50 àl có thành phần nêu Trờng hợp nuôi kết hợp với cụm tế bào cho vào giọt khoảng 200 cụm Các giọt nuôi có phủ dầu đợc cân nhiệt ®é vµ pha khÝ tr−íc chun trøng ® thơ tinh vào Việc nuôi phôi sau thụ tinh đợc trì mức ấp suất O2 thấp, có chế độ khí nhiệt độ nh nuôi thành thục trứng Sau ngày, phôi lại đợc chuyển sang môi trờng mới, có thành phần tế bào tơng tự, đ đợc c©n b»ng khÝ trén tr−íc chun Ýt nhÊt Tình trạng phát triển cuả phôi đợc đánh giá dới kính hiển vi lập thể vào lúc thay môi trờng nuôi Tỷ lệ phôi từ hai tế bào trở lên, phôi nang phôi dâu đợc tính vào thời điểm kết thúc nuôi phôi vào ngày thứ II Kết nghiên cứu Cả ba môi trờng nuôi thành thục trứng cho kết thụ tinh IVF tạo phôi phát triển đến giai đoạn có phôi dâu phôi nang Nếu nh môi trờng có kết hợp với FBS hoóc-môn môi trờng đợc bổ sung 20% dịch nang cho tỷ lệ tạo phôi từ tế bào trở lên tỷ lệ tạo phôi dâu phôi nang nh môi trờng đợc bổ sung dịch nang hoócmôn tỏ có u tỷ lệ thụ tinh tỷ lệ tao phôi dâu phôi nang Trong hai trờng hợp, P nhỏ 0,05 (bảng 3) Bảng Sự phát triển phôi sau IVF Môi trờng M1 (n=5) M2 (n=5) M3 (n=5) Sè trøng 500 450 450 Số phôi > tế bào (%) Số PD, PN 281 (56+17,6)a 258 (57,3+5,57)b 318 (70,7+16,16)c 82 69 117 PD+PN/ P2TB (%) 30,0+4,1a 28,4+4,6b 37,5+6,2c PD+PN/TS (%) 16,4+3,6a 15,3+3,8b 26,0+4,4c Ghi chú: PD: phôi dâu; PN: phôi nang; P2TB: phôi có từ tế bào trở lên; TS: tổng số trøng c-b, P < 0,05; c-a, P < 0,05 Tû lệ tạo phôi dâu phôi nang đợc cải thiện nu«i ph«i sau thơ tinh m«i tr−êng SOF có bổ sung cụm tế bào Môi 84 trờng SOF cã bỉ sung tÕ bµo còng lµm cho tû lệ phôi nang phát triển tổng số phôi dâu phôi nang sau ngày nuôi cao có ý nghÜa so víi m«i tr−êng SOF kh«ng bỉ sung tế bào (Các trứng tham gia vào thí nghiệm đợc nuôi thành thục môi trờng M2 đợc thụ tinh điều kiện nh nhau) (bảng 4) Bảng So sánh hai môi trờng nuôi phôi sau thụ tinh Thông số Số trứng đa vào nuôi Số phôi > tế bào (%) Số phôi dâu, phôi nang (%) Sè ph«i nang (%) SOF 450 258 (57,3+5,8) 69 (28,4+4,6) 32 (44,4+2,9)a SOF+tÕ bµo 450 263 (58,4+8,8) 109 (43,5+7,2) 71 (66,2+15,9)b Ghi chó: b-a, P < 0,05 III Thảo luận Hiện tợng sốc nhiệt đựợc hạn chế tối ®a nhê viƯc hót trøng sau bng trøng đợc cắt rời khỏi thể vật; trứng đợc chuyển vào môi trờng nuôi cho vào bình ổn nhiệt xách tay (38oC) Những tổn thơng học đợc hạn chế loại trừ trớc chuyển vào giọt nuôi thành thục, tổ hợp trứng có lớp tế bào cumulus nguyên vẹn đợc chọn cho mục đích thí nghiệm Tuy nhiên, việc đánh giá đồng chất nguyên sinh tế bào trứng giai đoạn không Để hạn chế trứng chất lợng, trứng đợc thu từ nang 2-8mm có dịch nang không bị đục Việc nuôi thành thục trứng trâu môi trờng có bổ sung dịch nang [2] d đợc tiến hành nhiều công trình IVF trâu Dịch nang mét mỈt cã thĨ thay thÕ hut thanh, mỈt khác không thiết phải bổ sung hooc-môn Dịch nang nh thu dễ dàng từ nang không thoái hoá có kích thớc từ 8mm trở lên, đợc sử dụng hiệu cho IVF thay phải loại bỏ trình thu trứng Dịch nang buồng trứng trâu chứa sẵn đa dạng hoócmôn nh FSH, LH, estradiol, progiesteron [9], c¸c u tè ph¸t triĨn chuyển hoá protein ức chế [10] Một số yếu tố phát triển nh IGF-2, EGF TGF- tìm thấy dịch nang số loài động vật có vú khác [1] Sự hữu ích dịch nang trâu xuất phát từ yếu tố kích thích Thực tế cho thấy yếu tố phát triển tách từ nang trứng trợ giúp trình thành thục trứng, thụ tinh phát triển phôi sau thụ tinh; yếu tố hoạt động nh đồng kích thích với gonadotropin lên trứng không riêng trâu mà loài thú khác [7] Thêm vào đó, mARN phiên m cho thụ quan IGF-1 có biểu tế bào cumulus, tế bào nang tổ hợp trứng trâu, IGF-1 thân insulin làm tăng thành thục, tăng thụ tinh tăng tỷ lệ phát triển thành phôi nang [11] Các yếu tố có dịch nang nh vậy, dới tác dụng FSH làm gia tăng nguyên phân, tăng tổng hợp protein steroit Việc thử nghiệm nuôi thành thục trứng trâu với yếu tố dịch nang cho kết dơng tính: EGF làm gia tăng độ tơi phồng lớp cumulus, gia tăng độ thành thục nhân tỷ lệ thụ tinh [3] Còn thêm IGF-2 làm tăng tỷ lệ tạo phôi nh tỷ lệ phôi đạt giai đoạn phát triển phôi nang [4] Ngay từ bớc thành thục trứng, tạo mét trøng thµnh thơc toµn vĐn cã hoµn chØnh thành phần, đảm bảo cho trình thụ tinh, trình phát triển phôi đến giai đoạn phôi nang mà cho toàn trình phát triển hoàn thiện cá thể động vật Việc sử dụng dịch nang cho trình thành thục trứng kéo trình tạo phôi in vitro gần với trình tạo phôi in vivo Việc nuôi thành thục trứng trâu môi trờng có bổ sung 20% dịch nang cho kết thụ tinh kết phôi phát triển đến giai đoạn phôi nang phôi dâu tơng tự nh trờng hợp dùng FBS có bổ sung eCG, hCG estradiol; đó, môi trờng có bổ sung dịch nang 20% kết hợp với hooc-môn có mức estradiol cao (3 àg/ml) làm gia tăng tỷ lệ thụ tinh mà làm tăng tỷ lệ tạo phôi dâu phôi nang Điều không loại trừ khả tác dụng trực tiếp hooc-môn lên thành thục trứng, làm cho trứng có khả phát triển giai đoạn Chất 83 85 estradiol tơng đối nhậy cảm buồng trứng trâu nói chung trình nuôi thành thục trứng trâu nói riêng Khi kết hợp với FSH PMSG, Uoc et al 1992 [13] cho thấy estradiol làm gia tăng số trứng rụng trâu có chu kỳ Trong điều kiện in vitro, estradiol làm gia tăng độ thành thục trứng, gia tăng tỷ lệ hình thành cực cầu [12] Thí nghiệm tạo phôi trâu IVF mặt khẳng định điều kiện phòng thí nghiệm tơng thích để tạo phôi thông qua việc sử dụng quy trình tạo phôi thông thờng với việc nuôi thành thục trứng trâu TCM 199 có bổ sung 10% FBS hoócmôn với kết 16% phôi nang phôi dâu tổng số trứng nuôi 30% số trứng thụ tinh ThÝ nghiƯm còng cho thÊy −u thÕ cđa viƯc sử dụng dịch nang buồng trứng trâu rõ ràng Có nguồn dịch nang thuận tiện để nuôi thành thục trứng trâu, nhiên để có hiệu tốt hơn, việc bổ sung chất kích thích nhằm phát huy yếu tố có ích kìm h m yếu tố ức chế chắn mục đích nghiên cứu giai đoạn tới Việc nuôi phôi trâu sau thụ tinh đối tợng công trình nghiên cứu Chính giai đoạn định chất lợng phát triển phôi giai đoạn Hiện tợng thai to quan sát thấy việc tạo phôi IVF bò [6] đặt câu hỏi vấn đề dinh dỡng phôi, việc bổ sung huyết axit amin giai đoạn In vivo, hợp tử hình thành ống dẫn trứng chuyển vào tử cung từ ngày thứ 5, phôi đạt giai đoạn phát triển thành phôi dâu phôi nang Trong công trình nghiên cứu đầu tiên, tác giả đ sử dụng ống dẫn trứng động vật để nuôi phôi sau thụ tinh Các phôi nang hoàn chỉnh ống dẫn trứng có khả chịu đợc trình bảo quản đông lạnh giải đông, cho tỷ lệ cấy phôi cao lần đ cho nghé phôi đợc nuôi ống dẫn trứng cừu sau thụ tinh [6] Tuy quy trình làm gia tăng chất lợng phôi nhng khó khăn áp dụng cho sản xuất phôi với số lợng lớn Việc kết hợp môi trờng SOF với cụm tế bào ống dẫn trứng trâu giai đoạn trâu vừa rụng trứng (suy đoán từ trạng thái thể vàng) giải pháp vừa kết hợp đợc yếu tố tế bào vừa kết hợp đợc yếu tố môi trờng, lại hoàn toàn thực 82 86 phòng thí nghiệm Các tế bào khai thác từ ống dẫn trứng nh bảo quản đông lạnh nh tái sử dụng Trong thí nghiệm, tỷ lệ tạo phôi nang môi trờng có bổ sung tế bào cao có ý nghĩa (P < 0,05) so với trờng hợp nuôi môi trờng SOF thông thờng, tổng số phôi nang phôi dâu đợc cải thiện (P < 0,05) nuôi phôi sau thụ tinh môi trờng IV Kết luận Nhìn chung lại, với việc sử dụng môi trờng nuôi thành thục trứng trâu thông thờng môi trờng cải tiến với 20% dịch nang buồng trứng trâu nh− thư nghiƯm nu«i ph«i sau thơ tinh môi trờng SOF SOF kết hợp với tế bào ống dẫn trứng, công trình tạo phôi thụ tinh ống nghiệm đ có thông số: tỷ lệ tạo phôi đạt 28.4 đến 43,5 % phôi dâu phôi nang Việc dùng môi trờng SOF có bổ sung cụm tế bào ống dẫn trứng cho phép tỷ lệ phôi nang căng nở đạt tới 66,2 % tổng số phôi dâu phôi nang Việc nâng cao tỷ lệ thành thục trứng tỷ lệ tạo phôi nang nh thách thức nhằm đa việc sản xuất phôi trâu in vitro áp dụng vào thực tế Tài liệu tham kh¶o Ackland J F et al., 1992: Physio Rev., 72: 731-787 Chauhan M S et al., 1997: Theriogenology, 48: 461-469 Chauhan M S et al., 1999: Vet Rec., 144: 266-267 Chauhan M S et al., 1998: Vet Rec., 142: 727-728 Drost M., 1983: II Symposium on advanced Tops in Animal Reproduction: 167-179 Galli C et al., 2001: Theriogenology, 55: 1341-1357 Gasparrini B., 2002: Theriogenology, 57: 237-258 Holm P et al., 1999: Theriogenology, 52: 683-700 9 Palta P et al., 1996: Ind J Exp Biol., 36: 768-774 10 Palta P et al., 1996: Ind J Exp Biol., 34: 606-608 11 Pawshe C H et al., 1998: Mol Reprod Dev., 49: 277-285 12 Ty L V et al., 2001: Theriogenology, 55: 406 abst 13 Uoc N T et al., 1992: Theriogenology, 38: 471-478 production by in vitro fertilization of VietNam swamp buffalo embryos Le Van Ty, Hoang nghia son, nguyen mong Summary This study was undertaken in order to test the ability of replacement of the foetal bovine serum (FBS) supplemented with hormones by the buffalo follicular fluid (BFF) in the oocyte maturation medium and the effect of co-culture with oviduct cells on the subsequent embryo development in Vietnam swamp buffalo 1400 cumulus enclosed oocytes (COC) were collected from the buffalo ovaries in slaughter-house in the way with minimize temperatural choc COCs were randomtly cultured in three maturation medium varieties: TCM 199 supplemented with 10% FBS, 10 IU/ml eCG, IU/ml hCG, µg/ml estradiol (M1); TCM 199 with 20% buffalo follicular fluid (BFF) without hormones (M2) or TCM 199 with 20% BFF and the same level of eCG, hCG as M1 but µg/ml estradiol (M3) The effect of oviduct cells was evaluated by the embryo co-culture in two medium varieties: synthetic oviduct fluid (SOF) and SOF with oviduct cells after the maturation in the medium M2 and IVF No significal differences were observed in the maturation and the formation of morulas and blastocyts by using the routine maturation medium (M1) and TCM 199 supplemented with 20% BFF but the rate of formation of two-cell and more-cell embryos and the rate of total morula and blastocyts were clearly improved in the case of combined BFF and hormones (M3) (26.5% vs 16.3%, P < 0.05) The co-culture with oviduct cells not only improved the percentage of total embryos developed into morula blastocyt stage but also increased the rate of blastocyt formation in comparision with the medium without cells (66.2% vs 44.4%, P < 0.05) This first try of in vitro embryo production in the swamp buffalo indicated the comparable rate (approximately 20%) of blastocyts can be obtained from total using oocytes Ngµy nhËn bµi 5- 6-2004 83 87 ... thành thục trứng kéo trình tạo phôi in vitro gần với trình tạo phôi in vivo Việc nuôi thành thục trứng trâu môi trờng có bổ sung 20% dịch nang cho kết thụ tinh kết phôi phát triển đến giai đoạn phôi. .. Hoạt hoá tinh trùng trâu Do nguồn tinh trùng trâu đông lạnh, thí nghiệm đợc tiến hành với tinh trùng tơi đợc thu trực tiếp từ mào tinh hoàn trâu đực từ lò mổ Trong thời gian vận chuyển, tinh hoàn... nghiệm nuôi phôi sau thụ tinh môi trờng SOF SOF kết hợp với tế bào ống dẫn trứng, công trình tạo phôi thụ tinh ống nghiệm đ có thông số: tỷ lệ tạo phôi đạt 28.4 đến 43,5 % phôi dâu phôi nang Việc dùng