Phân tích methyl thủy ngân và thủy ngân tổng trong thủy hải sản bằng kỹ thuật dòng chảy kết hợp phổ hấp thu nguyên tử hóa hơi lạnh

Methyl thủy ngân (MeHg) và thủy ngân tổng số trong các loại hải sản được xác định bằng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử hóa hơi lạnh dùng chất khử NaBH4. Methyl thủy ngân được ly trích bằng HBr 47% và hợp chất MeHgBr được chiết định lượng vào toluene. MeHgBr trong pha toluene được chiết ngược vào pha nước chứa L-cysteine. Phức MeHg-L-cysteine và các hợp chất hữu cơ trong pha nước được oxy hóa bằng KMnO4/H2SO4 để chuyển thành Hg2+.

40 SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL NATURAL SCIENCES, VOL 2, NO 1, 2018 Phân tích methyl thủy ngân thủy ngân tổng thủy hải sản kỹ thuật dòng chảy kết hợp phổ hấp thu nguyên tử hóa lạnh Nguyễn Văn Đông, Lê Thị Huỳnh Mai, Huỳnh Vinh Đức, Hồ Thị Hồng Diễm, Nguyễn Thanh Phương Tóm tắt – Methyl thủy ngân (MeHg) thủy ngân tổng số loại hải sản xác định phương pháp phổ hấp thu nguyên tử hóa lạnh dùng chất khử NaBH4 Methyl thủy ngân ly trích HBr 47% hợp chất MeHgBr chiết định lượng vào toluene MeHgBr pha toluene chiết ngược vào pha nước chứa L-cysteine Phức MeHg-L-cysteine hợp chất hữu pha nước oxy hóa KMnO4/H2SO4 để chuyển thành Hg2+ Mẫu hải sản vô hóa trực tiếp HNO3:HCl (1:3) thành Hg2+ cho phân tích thủy ngân tổng số Giới hạn phát giới hạn xác định phương pháp phân tích MeHg 0,69 ng/g 1,3 ng/g (tính theo Hg) Hiệu suất thu hồi quy trình phân tích MeHg Hg tổng số 96,5–105% 93–101% khoảng nồng độ 2–700 ng/g Hg Hàm lượng MeHg Hg tổng số loại hải sản thông dụng 1,2 – 483,5 ng/g 4,0–663,4 ng/g Từ khóa – MeHg, tổng Hg, thủy hải sản MỞ ĐẦU xa xưa tính độc hại thủy ngân người biết đến thủy ngân sử dụng nhiều đời sống sản xuất Các dạng thủy ngân gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người chất lượng hệ sinh thái Hiện nay, thông tin nguyên dạng hợp chất thủy ngân mơi trường nói chung cá nói riêng mối quan tâm lớn giới khả tích lũy sinh học qua chuỗi thức ăn độc tính hợp chất với mức độ khác gây cho động vật người [1] T Ngày nhận thảo: 10-01-2017, ngày chấp nhận đăng: 30-9-2017, ngày đăng: 10-08-2018 Tác giả: Nguyễn Văn Đông, Lê Thị Huỳnh Mai, Huỳnh Vinh Đức, Hồ Thị Hồng Diễm, Nguyễn Thanh Phương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM (winternguyenvan@yahoo.com) Thông qua chuỗi thức ăn hợp chất thủy ngân tích lũy vào sinh vật, đặc biệt cá, người ăn cá phơi nhiễm thủy ngân, hợp chất thủy ngân MeHg tác động tiêu cực đến sức khỏe gây hậu nghiêm trọng Hiện nay, việc xác định hàm lượng kim loại nặng thực phẩm mối quan tâm tồn cầu, vấn đề định danh định lượng hợp chất thủy ngân đặc biệt quan tâm Trước tiêu chuẩn đánh giá thủy ngân thực phẩm Việt Nam dựa tiêu thủy ngân tổng số, gần nguyên dạng thủy ngân quan tâm nhiều hơn, cụ thể hàm lượng methyl thủy ngân thực phẩm dạng có độc tính cao Để đáp ứng u cầu này, phòng thí nghiệm phân tích phát triển phương pháp phân tích thiết bị phân tích nguyên dạng Hg chủ yếu dựa vào sắc ký lỏng (LC) ghép nối khối phổ ghép cặp cảm ứng cao tần (ICP-MS) Việc phân tích nguyên dạng hợp chất Hg dựa hệ LC-ICPMS tương đối phức tạp chi phí mua sắm/vận hành thiết bị cao Trong thực tế Hg thực phẩm tồn chủ yếu dạng: methyl thủy ngân thủy ngân vô [2] gần EU chấp nhận phương pháp phân tích đơn giản hơn: phân tích Hg tổng số riêng MeHg MeHg tách khỏi hợp chất Hg vô phương pháp không sắc ký phân tích đầu dò đủ nhạy chọn lọc Hiện thiết bị quang phổ hấp thu nguyên tử dùng kỹ thuật hóa lạnh (CV-AAS) phổ biến có độ nhạy với Hg cao đủ đáp ứng yêu cầu phân tích Hg thủy sản Do đó, việc nghiên cứu quy trình phân tích riêng rẽ MeHg tổng Hg thủy sản thiết bị AAS cần thiết Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành kiểm định hiệu lực hóa phương pháp phân tích TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 1, 2018 T-Hg MeHg thủy sản theo phương pháp CV-AAS VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Hóa chất Tất dung dịch chuẩn bị nước cất lần HNO3 (65– 67%), HBr (47%), HCl (37%), toluene, MeHgCl, Hg2+ 1000 ppm, KMnO4, CH3COONa, Na2SO4 hạng tinh khiết phân tích, Lcysteine, NaBH4 mua tù hãng Merck, Đức Thiết bị Máy phân tích thủy ngân chuyên dụng FIMS 100 (Perkin Elmer) kèm theo autosample S10 tự động lấy mẫu, loop lấy mẫu dung tích 500 µL Cân phân tích (Mettler Toledo, Switzerland) xác đến 0,1 mg, bể điều nhiệt (Lauda, Germany), máy vortex (WTW, Germany), máy ly tâm dụng cụ thí nghiệm thơng thường khác Máy FIMS 100 vận hành dùng khí mang Ar lưu lượng 100 mL/phút, bơm nhu động 120 vòng/phút Lấy mẫu xử lý sơ Mẫu hải sản mua chợ siêu thị Đối với cá thể có kích thước lớn chọn mua phần thịt ăn khoảng 100–200 g Đối với cá thể nhỏ chọn nhiều cá thể cho tổng khối lượng khoảng 300–400 g Dao, thớt cối xay rửa xà phòng, tráng rửa HNO 10 % sau rửa lại nước thường nước cất trước sau lần sử dụng Mẫu cá rửa sạch, bỏ phần nội tạng, xương da, giữ lại phần thịt cho vào cối xay thịt xay nhuyễn Mẫu sau xay cho vào túi zipper, ký hiệu tên cho mẫu bảo quản tủ đông Mẫu rã đông tự nhiên nhiệt độ phòng trước thực xử lý mẫu Xử lý mẫu xác định Hg tổng số Khoảng g (±0,0001 g) mẫu thủy sản tươi đồng cân vào ống thủy tinh 10 mL có nắp vặn (loại ống dùng phân tích COD), thêm mL HNO3:HCl (1:3), đậy nắp, để yên 30 phút Khi phần cá tan hoàn toàn, dịch mẫu đun lò COD 120 oC Mẫu để nguội phần lipid tách bỏ cách chiết lần lần với mL hexane Pha nước định mức 50 mL nước cất Dung dịch sử dụng để xác định tổng Hg thiết bị FI-CV-AAS Xử lý mẫu xác định MeHg mẫu thủy sản Khoảng 0,7–0,8 g (±0,0001 g) mẫu thủy sản tươi đồng cho vào ống ly tâm polypropylene 50 mL Sau thêm 10 mL HBr (48 %), hỗn hợp lắc xoáy (vortex) 41 mẫu tan hoàn toàn (1–5 phút) Dịch mẫu vortex 10 phút với 20 mL toluene ly tâm khoảng phút Pha toluene chuyển sang ống ly tâm khác có sẵn mL L-cysteine 1% Phần dịch cá HBr tiếp tục chiết lần nữa, lần với 15 mL toluene pha toluene thu từ lần chiết gộp chung MeHg pha toluene vortex với L-cysteine phút ly tâm Pha L-cystein chuyển vào vial thủy tinh 40 mL thêm mL H2SO4 đặc, mL KMnO4 5% mL HCl 1% Hỗn hợp đun cách thủy khoảng h 95℃ Kết tủa đen MnO2 hòa tan hồn tồn lượng tối thiểu (2 giọt) hydroxylamine 10% khoảng phút KẾT QUẢ- THẢO LUẬN Xác định MeHg- tối ưu hóa trình chiết lỏng-lỏng Tỷ lệ thể tích pha nước: pha hữu Tối ưu tỷ lệ thể tích pha nước/toluene số lần chiết thực dung dịch MeHgCl tiêu chuẩn 2,5 mL chuẩn MeHgCl 100 ppb + 10 mL HBr 47% thể tích toluene định lấy vào vial thủy tinh 40 mL có nắp lót septum silicon/PTFE Tỷ lệ thể tích HBr: toluene số lần chiết sau :  V1: HBr : toluene = 2:1 lần chiết (mỗi lần mL toluene, tổng thể tích toluene: 20 mL)  V2: HBr : toluene = 1:1, lần chiết (mỗi lần 10 mL toluene, tổng thể tích toluene: 30 mL)  V3: HBr : toluene = 1:2, lần chiết (mỗi lần 20 mL toluene, tổng thể tích toluene: 40 mL) Kết cho thấy MeHg chiết hiệu sang toluene với tỷ lệ thể tích mẫu/toluene 1:2 sau lần chiết (97,1±1,6 %, n=4, P=95 %) so với tỷ lệ thể tích mẫu/toluene 1:1 sau lần chiết (79,6±2,7 %, n=4, P=95 %) tỷ lệ thể tích mẫu/toluene 2:1 sau lần chiết (68,1±6,8 %, n=4, P=95 %) Thể tích toluene nhỏ (5 mL 10 mL so với 20 mL) số lần chiết lặp nhiều (3 so với 2) tỏ hiệu hiệu suất chiết thời gian chiết dùng toluene Tính chọn lọc trình chiết MeHg Hg cá tồn hai dạng: Hg vô MeHg dạng liên kết chặt với protein/peptide Việc xác định riêng rẽ MeHg có giá trị trình chiết MeHg chọn lọc tức Hg2+ không bị chiết sang toluene với MeHg Khi có mặt HBr nồng độ cao, hợp chất Hg vơ MeHg hình thành phức HgBri(2-i)+ (i=1÷4) hay MeHgBr MeHgBr phân cực nên dễ 42 SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT JOURNAL NATURAL SCIENCES, VOL 2, NO 1, 2018 dàng chiết qua toluene phức HgBri(2-i)+ phân cực cao nên khó chiết vào toluene Kết khảo sát hiệu trình chiết hợp chất Hg2+, MeHgCl hỗn hợp Hg2+ + MeHgCl nồng độ khác (Bảng 1) từ pha nước cho thấy Hg2+ bị chiết sang toluene nhỏ (97 %) Xu hướng tương tự xảy mẫu thực (cá) cho thấy độ tin cậy phương pháp chiết chọn lọc việc xác định MeHg mẫu cá hay mẫu thủy hải sản nói chung (Bảng 1) Bảng Khả chiết chọn lọc MeHg khỏi Hg2+ từ pha nước % tìm thấy (tính theo Hg) sau chiết Hợp chất Khoảng Nền nước cất Nền mẫu cá nồng độ pha Pha hữu Pha nước Pha hữu nước Pha nước Hg2+ 94,8±0,61 10ppb MeHg - - 89,3±1,3 - 98,5±3,2 - 97,6±0,89 2+ Hg + 91,8±1,63 102,9±1,2 91,8±1,7 MeHg 100ppb 90,4±0,79 Hg2+ 98,3±0,23 1,7±2,1 98,3±1,1 2,9±1,5 MeHg 2,0±0,61 98,0±1,1 3,0±2,0 98,2±1,7 2+ Hg + 98,2±2,7 96,2±1,8 101,8±0,88 102,1±0,91 MeHg Hg2+ 101,8±1,9 0,29±0,91 101,5±1,1 1000ppb 0,56±1,1 MeHg 0,56±2,0 97,3±1,6 0,26±0,72 101,3±1,7 Hg2++ 94,4±0,68 91,7±1,5 95,4±0,24 96,8±0,59 MeHg Q trình chuyển hóa phức MeHg với Lcysteine thành Hg2+ Hg2+ bị q trình vơ hóa mẫu mơi trường oxy hóa khơng đủ mạnh phản ứng khử cục Hg2+ với số chất khử mẫu xét mặt tổng thể, môi trường phản ứng có tính oxy hóa Để khắc phục tình trạng này, trước đun cách thủy cần có mặt ion Cl- để giữ Hg2+ dạng phức bền HgCl2 (β=1017.33), biện pháp chứng tỏ có hiệu (Hình 1) việc vơ hóa MeHg dịch chiết với L-cysteine Hình Hiệu suất thu hồi MeHg+ tính theo Hg khơng có ion Cl- có mL HCl % Đường chuẩn Đối tượng phân tích nghiên cứu MeHg, đường chuẩn phân tích phương pháp CV-AAS lại dựa vào mối tương quan nồng độ Hg2+ độ hấp thu nên độ kết phân tích có chuyển hóa MeHg thành Hg2+ ổn định định lượng Điều chứng minh qua việc xử lý dung dịch chuẩn MeHg có nồng độ khác theo quy trình xử lý mẫu xác lập tương quan nồng độ độ hấp thu dung dịch chuẩn Đường chuẩn dựng từ Hg2+ pha trực tiếp đường chuẩn dựng từ MeHgCl có qua xử lý mẫu AHg = (0,01318 ± 0,00010)CHg + (0,0018 ± 0,0011) AHg = (0,01374 ± 0,00046)CHg + (0,0210 ± 0,0067) So sánh thống kê cho thấy hệ số góc hai đường chuẩn khác biệt (p= 0,000011; 95 %), nhiên chênh lệch độ nhạy 4,2 % mức chấp nhận hàm lượng ppb Độ tuyến tính đường chuẩn MeHg qua xử lý mẫu (R2 = 0,9983) đường chuẩn Hg2+ (R2 = 0,9998) bất ổn q trình xử lý mẫu Tung độ góc đường chuẩn qua xử lý thể nhiễm bẩn Hg từ hóa chất thuốc thử Nhiễm bẩn hóa chất thể qua tung độ góc đường chuẩn MeHg qua xử lý tương đối nhỏ dễ dàng khắc phục qua việc bù trừ mẫu trắng Như từ dùng đường chuẩn Hg2+ để định lượng MeHg TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ: CHUYÊN SAN KHOA HỌC TỰ NHIÊN, TẬP 2, SỐ 1, 2018 Hình Đường chuẩn xây dụng từ Hg2+ từ MeHg qua xử lý Đánh giá ảnh hưởng mẫu Việc chiết MeHg từ mẫu thủy hải sản có phức tạp sang toluene giúp lập chọn lọc thành phần có tính phân cực thấp từ mẫu phức tạp gồm protein/peptide, béo… mẫu thủy sản phân tán pha nước Sau đó, việc tiếp tục chiết ngược pha toluene dung dịch L-cysteine giúp chiết chọn lọc MeHg dạng phức ion lưỡng cực CH3HgS-CH2CH(NH3)+COO- vào pha nước, hợp chất phân cực nằm lại pha toluene Tuy việc đánh giá ảnh hưởng mẫu đến độ kết phân tích MeHg cần tiến hành Trong nghiên cứu này, nồng độ MeHg gần mẫu cá xác định phương pháp đường chuẩn, việc thêm chuẩn thực đường để kiểm tra ảnh hưởng mẫu 43 Hình A Thêm chuẩn MeHg mẫu cá nhám cá hường, B thêm chuẩn T-Hg mẫu cá thu cá ngân Thực thêm chuẩn MeHg cá có nồng độ cao nồng độ thấp (cá nhám cá hường) Hg2+ cá thu cá ngân cho thấy đường thêm chuẩn xây dựng có khoảng tuyến tính tương đối dài tương tự đường chuẩn, hệ số góc đường thêm chuẩn dao động khoảng 0,0136–0,0139 xấp xỉ với hệ số góc đường chuẩn (0,0132 0,0136) (Hình Hình 3) Nồng độ Cx xác định từ đường chuẩn đường thêm chuẩn có độ chệch