Mục tiêu nghiên cứu của luận án nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym vào quá trình thủy phân các hợp chất glycozit thực vật, tạo nên các sản phẩm có hoạt tính cao hơn đồng thời phát triển hướng nghiên cứu xanh trong hóa hữu cơ.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ …… ….***………… LÊ THỊ TÚ ANH NGHIÊN CỨU PHẢN ỨNG THỦY PHÂN MỘT SỐ GLYCOZIT TỰ NHIÊN BẰNG ENZYM β-GLUCOSIDASE VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC SẢN PHẨM NHẬN ĐƯỢC Chuyên ngành: Hóa hữu Mã số: 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Hà Nội – 2018 Cơng trình hồn thành tại: Học viện Khoa học Công nghệ Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Lê Trường Giang Người hướng dẫn khoa học 2: TS Đoàn Duy Tiên Phản biện 1: … Phản biện 2: … Phản biện 3: … Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ, họp Học viện Khoa học Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam vào hồi … ’, ngày … tháng … năm 201… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ Lê Thị Tú Anh, Đoàn Duy Tiên, Bá Thị Châm, Nguyễn Văn Tuyến, Nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật thủy phân glycosit thành aglycon có hoạt tính sinh học cao Tạp chí Hóa học, 2016 , 54 (6e2): 84-89 Lê Thị Tú Anh, Bá Thị Châm, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Thanh Trà, Nguyên Văn Tuyến, Nghiên cứu thủy phân astilbin rễ Thổ phục linh (Similax glabra) vi sinh vật, Tạp chí Hóa học, 2016, 54 (6e2): 223-227 Nguyễn Thị Thu Hà, Phạm Thị Thu Hằng, Nguyễn Thanh Trà, Bá Thị Châm, Lê Thị Tú Anh, Đặng Thị Tuyết Anh, Nguyễn Hà Thanh, Thành phần hóa học hoạt tính ức chế enzym khử HMG-Coenzym A vỏ đậu xanh (Vigna radiata), Tạp chí hóa học 2017, 55 (4e23), 2126 Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Thanh Trà, Bá Thị Châm, Lê Thị Tú Anh, Đặng Thị Tuyết Anh, Nguyễn Hà Thanh, Thành phần hóa học hoạt tính ức chế enzym khử HMG-Coenzym A Sen hồng (Nelumbo nucifera), Tạp chí hóa học 2017, 55 (4e23), 261-266 MỞ ĐẦU Tính cấp thiết luận án Hiện nay, vấn đề bảo vệ môi trường trở nên cấp thiết với lĩnh vực sống Trong lĩnh vực hóa học, tìm kiếm enzym xúc tác, hỗ trợ cho trình chuyển hóa, tổng hợp hữu coi hướng phát triển xanh thân thiện môi trường Nhờ ưu điểm vượt trội so với xúc tác thông thường, xúc tác enzym không giúp tăng hiệu suất phản ứng mà góp phần giảm thiểu nhiễm mơi trường β-Glucosidase (BGL) thuộc nhóm enzym có khả thủy phân liên kết glycosid hợp chất carbohydrat BGL tác động lên nhiều chất khác nhau, thủy phân liên kết glycosid hợp chất tự nhiên, giải phóng hợp chất có hoạt tính sinh học cao, dễ hấp thụ lĩnh vực quan tâm nghiên cứu, đem lại nhiều kết hứa hẹn Flavonoit nhóm hợp chất phong phú, đa dạng, ứng dụng nhiều lĩnh vực y dược học, thực phẩm, mỹ phẩm Flavonoit tồn hai dạng dạng tự (aglycon) liên kết với phân tử đường (glycozit) Trong đó, dạng aglycon có hoạt tính sinh học cao dễ hấp thụ vào thể, dạng glycosid chiếm tỉ lệ lớn nhiên khó hấp thụ có hoạt tính thấp Do việc phát triển xúc tác sinh học thủy phân glucozit tạo aglycon nghiên cứu hoạt tính cặp chất có ý nghĩa quan trọng có tính ứng dụng cao Quá trình nghiên cứu, phát triển xúc tác enzym không tránh khỏi việc nuôi cấy vi sinh vật (VSV) Những vi sinh vật thải mơi trường tạo ảnh hưởng khơng tốt, để đảm bảo quy trình nghiên cứu thân thiện với môi trường, việc xử lý khử trùng vi sinh vật trước loại bỏ cần thiết Nhằm mục đích nghiên cứu, tìm kiếm glycozit, aglycon thực vật có hoạt tính sinh học, có tiềm ứng dụng thực tiễn đồng thời phát triển phương pháp nghiên cứu – sinh chuyển hóa xúc tác sinh học, lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu phản ứng thủy phân glycozit tự nhiên enzym β-glucosidase đánh giá hoạt tính sinh học sản phẩm nhận được” Trong nghiên cứu này, chủng vi nấm P.citrinum phân lập từ rễ Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz), định danh sinh tổng hợp enzyme β-glucosidase Các flavonoit glycozit tách chiết từ thực vật Việt Nam thủy phân enzym β-glucosidase từ vi nấm Các flavonoit sản phẩm chuyển hóa tương ứng đánh giá hoạt tính sinh học Vi nấm sau q trình lên men nghiên cứu khử trùng công nghệ oxy hóa tiên tiến thân thiện với mơi trường Mục tiêu nghiên cứu luận án Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ enzym vào q trình thủy phân hợp chất glycozit thực vật, tạo nên sản phẩm có hoạt tính cao đồng thời phát triển hướng nghiên cứu xanh hóa hữu Các nội dung nghiên cứu luận án - Phân lập, định danh chủng vi sinh vật có khả sinh β-glucosidase - Lên men sinh tổng hợp, đánh giá thông số động học β-glucosidase dạng tự cố định từ P Citrinum - Nghiên cứu khử trùng sau lên men phương pháp oxy hóa tiên tiến - Nghiên cứu tách chiết hợp chất glycozit từ thực vật Việt Nam - Nghiên cứu thủy phân hợp chất glycozit từ thực vật với enzym βglucosidase - Đánh giá hoạt tính sinh học hoạt chất thu CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Enzym β-D-glucosidlase Trình bày nội dung liên quan đến β-glucosidase: nội dung sở liên quan đến định nghĩa, phân loại, chế phản ứng, cách tinh chế đánh giá hoạt tính enzym Tiếp đó, nội dung đa dạng khả sinh tổng hợp β-glucosidase VSV, cải tạo nguồn giống với mục đích tăng sản xuất BGL liên quan đến sản xuất BGL thương mại Cuối cùng, ứng dụng đa ngành β-glucosidase 1.2 Hợp chất flavonoit Trình bày nội dung liên quan đến flavonoit: khung sở, phân loại nhóm, sinh tổng hợp, phương pháp nhận biết thuốc thử hoạt tính sinh học nhóm chất 1.3 Flavonoit glycozit aglycon chúng Trình bày nội dung liên quan đến hấp thu, chuyển hóa flavonoit glycozit từ cho thấy tiềm aglycon so với glycozit chúng Tiếp theo tổng quan nghiên cứu sinh chuyển hóa flavonoit glycozit công bố giới CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 2.1 Nguyên liệu Mẫu bã đậu nành (Glycine max) từ Công ty cổ phần dầu thực vật Quang Minh, Kim Động, Hưng Yên Mẫu sen (Nelumbo nucifera) vỏ đậu xanh (Vigna radiata) thu Hà Nội Bắc Giang Mẫu hoa hòe (Styphnolobium japonicum (L.) Schott) thu Nam Định Mẫu Cốt khí củ (Rhizoma Polygoni cuspidati) thu Thôn Nghĩa Trai - xã Tân Quang - Huyện Văn Lâm Hưng Yên 2.2 Hóa chất, thiết bị 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp phân lập, định danh lưu vi sinh vật sinh enzym 2.3.1.1 Phân lập vi sinh vật dạng khiết: 2.3.1.2 Phương pháp định danh: đại thể, vi thể, định danh chủng nấm phân lập PCR giải trình tự 2.3.2 Phương pháp xác định họat độ enzym: đánh giá khả thủy phân pnitrophenyl-β-glucopyranosid (pNPG) 2.3.3 Phương pháp cô lập xác định cấu trúc hợp chất glycozit: sắc ký cột phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 2.3.4 Các phương pháp thủy phân: với enzym tự enzym cố định - Khảo sát số điều kiện ảnh hưởng đến trình thủy phân - Xử lý số liệu thí nghiệm tối ưu hóa thực nghiệm 2.3.5 Phương pháp khử trùng vi sinh vật nghiên cứu 2.3.6 Các phương pháp xác định hoạt tính sinh học - Phương pháp thử hoạt tính chống oxi hóa hệ DPPH - Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase - Phương pháp xác định hoạt tính ức chế enzym Angiotensin I 2.3.7 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu cho trình thủy phân Tối ưu hóa pp qui hoạch thực nghiệm với phần mềm Modde 5.0 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM 3.1 Nghiên cứu phân lập chủng nấm sinh enzym β-glucosidase 3.1.1 Phân lập chủng sinh enzym β-glucosidase Từ mẫu rễ Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz), tiến hành phân lập chủng nấm mốc chủng có khả sinh β-glucosidase Chủng nấm mốc có khả sinh enzym β-glucosidase với hoạt tính cao định danh sử dụng xuyên suốt nghiên cứu 3.1.2 Định danh chủng vi nấm phân lập Phương pháp vi thể, đại thể, PCR giải trình tự gen 3.2 Nghiên cứu phân lập thông số động học β-glucosidase Lên men với môi trường Pd, sử dụng phương pháp muối tách với (NH4)2SO4, rửa muối cột Sephadex đông khô thu enzym Hằng số phân ly biểu kiến Km Vmax β-glucosidase chất βpNG với nồng độ β-pNG khoảng 0.05mM đến 2.0mM, phản ứng diễn 10 phút 60oC đo bước sóng 410nm BGL-P nghiên cứu cố định calci alginat bã cà phê Hiệu suất cố định enzym (%) tính theo cơng thức: Hiệu suất cố định (%) =(Et- Es)/Et x100 Et hoạt độ enzym trước cố định, Es hoạt độ enzym sau cố định 3.3 Nghiên cứu phân lập glycozit số thực vật Việt Nam 3.3.1 Phân lập glycozit aglycon từ khô đậu tương 200g khô đậu tương - EtOH: H2O (80:20) Cô loại dung môi Cao lỏng màu nâu - Chiết aceton x lần Cô kiệt dung mơi - Hòa tan EtOAc Chiết nước Cặn Aceton - Dịch EtOAc - Cô kiệt dung môi Cột silica gel: EtOAc:H2O EtOAc:H2O:EtOH (95:3:2) F3-F4 F1-F2 F5 Sephadex LH-20, EtOH F1 Kết tinh CH2Cl2 D1.1 (12.8mg ) Dịch nước Chạy cột silica gel: EtOAc:MeOH (96:4) D5.3 (251.2mg) F1 Kết tinh CH2Cl2 D1.2 (3.4 mg) (97:3) F6 F7-F10 Chạy cột silica gel: EtOAc:MeOH (95:5) D6.4 (198.7mg) 3.3.2 Phân lập glycozit aglycon từ Sen 3.3.3 Phân lập glycozit từ vỏ đậu xanh 3.3.4 Phân lập rutin từ hoa Hòe Đặc điểm hợp chất phân lập được: Nhiệt độ nóng chảy: 242oC H NMR (500 MHz, DMSO-d6): =0,99 ppm (3H, d, J= 6,5Hz, HRha-6’’’); 3,095,00 (các proton CH-OH đường); 5,2 (1H, brs, HRha-1’’’); 5,34 (1H, d, J= 7,0 Hz, HGlc-1’’); 6,19 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-6); 6,38 (1H, d, J= 2,0 Hz, H-8); 6,84 (1H, d, J= 8,0 Hz, H-5’); 7,52 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’); 7,55 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-6’); 12,58 (1H, s, OH-5) 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): 156,5 (C-2); 133,3 (C-3); 177,4 (C-4); 161,2 (C-5); 100,1 (C-6); 164,1 (C-7); 93,6 (C-8); 156,4 (C-9); 103,9 (C-10); 121,1 (C-1’); 115,2 (C-2’); 144,7 (C-3’); 148,4 (C-4’); 116,2 (C-5’); 121,5(C6’); 101,2 (CGlc-1’’); 74,1 (CGlc-2’’); 76,4 (CGlc-3’’); 70,3 (CGlc-4’’); 75,8 (CGlc5’’); 66,9 (CGlc-6’’); 98,7 (CRha-1’’’); 70,5 (CRha-2’’’); 71,3(CRha-3’’’); 71,8 (CRha-4’’’); 68,2 (CRha-5’’’); 18,6 (CRha-6’’’) 3.3.5 Phân lập glycoszit aglycon từ củ Cốt khí ` Cặn CC(15 g) - SKC Silicagel 0,063 ÷ 0,2 - CH2Cl2 : CH3OH F1 F2 - Cô kiệt F3 F4 - SKC Silicagel 0,04÷0,063 - CH2Cl2 - SKC Silicagel 0,04 ÷ 0,063 - CH2Cl2 : CH3OH - Kết tinh F8 F7 (2,0g) F6 F5 (2,4g) C2.1 (290mg) 7-1 7-2 7-3 7-4 7-5 - Cô, kết tinh 5-1 5-2 5-3 5-4 C7.3 (155mg) - Cô, kết tinh C5.2 (97mg) C8.4 (20mg) 3.4 Sinh chuyển hóa hợp chất glycozit Hiệu suất thủy phân tính theo cơng thức [140]: C8.5 (15mg) Trong đó: Qc: lượng sản phẩm thủy phân Qo: lượng glucozit ban đầu đưa vào phản ứng M1: khối lượng phân tử glycozit M2: khối lượng phân tử sản phẩm thủy phân 3.5 Khử trùng vi sinh vật nghiên cứu phương pháp oxi hóa tiên tiến 3.5.1 Chuẩn bị thiết bị mẫu vi sinh vật phân tích mẫu điện phân 3.5.2 Thiết kế quy trình điện phân với bào tử B cereus 3.5.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ dòng điện đến khả diệt khuẩn 3.5.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng pH dung dịch đến khả diệt khuẩn 3.5.3 Nghiên cứu khả diệt khuẩn thiết bị với P citrinum 3.6 Đánh giá hoạt tính sinh học glycozit sản phẩm thủy phân tương ứng 3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH [117-119] Thời gian phản ứng 30 phút 370C, đọc mật độ hấp phụ DPPH chưa phản ứng máy Genios Tecan bước sóng 517 nm % bắt gốc tự (scavenging capacity %) DPPH mẫu thử tính theo công thức: SC% = (OD trắng – OD mẫu thử)/ ODtrắng (%) EC50 tính theo giá trị SC tương quan với nồng độ khác chất thử, thí nghiệm lặp lại với n = 3.6.2 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase [120-123] Thí nghiệm ủ nhiệt độ 37o C Phản ứng dừng 100 µl Na2CO3 Độ hấp thụ phản ứng xác định máy BIOTEK với bước sóng 410 nm (A) Khả ức chế enzyme - glucosidase mẫu thử xác định công thức: Độ ức chế (%) = [A(đối chứng âm) – A(mẫu thử)] / A(đối chứng âm) x 100% IC50 - half maximal inhibitory concentration - nồng độ chất thử ức chế 50% hoạt động -glucosidase, tính phần mềm Tablecurve 3.6.3 Đánh giá hoạt tính ức chế enzym ACE [124-126]: Phản ứng nhiệt độ 37o C, pH 7,0, 30 phút Độ hấp thụ sau phản ứng xác định máy BioTek với bước sóng 410 nm (A) Phần trăm ức chế hoạt độ ACE mẫu thử tính theo công thức: % ức chế = (Ađối chứng dương - Amẫu thử)/(Ađối chứng dương – Ablank) Trong đó, mẫu đối chứng dương: không chứa chất thử; mẫu blank: chất HHL thay đệm phản ứng Chất tham khảo: captopril 10 Bã cà phê Trung nguyên hoạt hóa glutaraldehyt sử dụng làm chất mang BGL-P, đạt hiệu suất 82% Tuy nhiên, tái sử dụng lần với chất pNPG trước 50% hoạt tính Bảng 4.3 Thơng số động học enzym BGL-P tự cố định Dạng enzym Nhiệt độ pH Vmax Km R2 * Tự 60 6.0 13,91 0,011 0,9994 Cố định/alginat 50 6.0 13,09 0,034 0,9978 Cố định bã cà phê 40 6.0 14,45 0,022 0,9992 * hệ số R phương trình đồ thị Lineaweaver Burk 4.2 Kết nghiên cứu phân lập glycozit số thực vật Việt Nam Bằng phương pháp phổ, 20 hợp chất phân lập từ loài thực vật xác định cấu trúc hóa học sau: TT Kí hiệu Cấu tạo Tên hợp chất Nguồn gốc D1.1 D1.2 D5.3 Genistein Đậu nành Daidzein Đậu nành Genistein 7-O- Đậu nành beta-D-glucoside D6.4 Daidzein7-O- Đậu nành beta-D-glucoside S3.1 MB5 catechin Lá sen hồng, vỏ đậu xanh 11 S5.2 S7.3 quercetin-3-O-β- Lá sen galactoside hồng quercetin Lá sen hồng S8.4 kaemferol Lá sen hồng S8.5 isorhamnetin-3- Lá sen O-β-D- hồng glucuronide 10 11 S8.6 HO MB3 OH OH 4'' 6'' 3'' 5'' 2'' HO HO O 3' 2' 1'' 1' O 12 MB4 Lá sen D-glucuronide hồng apigenin-6-C- Vỏ đậu glucoside xanh (vitexin) 5' 6' 10 OH OH 4' quercetin-3-O-β- O apigenin-6-C- Vỏ đậu glucoside xanh (isovitexin) 12 13 MB1 luteolin Vỏ đậu xanh 14 MB2 taxifolin Vỏ đậu xanh 15 OH HH1 2' HO OH 1' O 10 O HO O 4' 2'' 17 C2.1 C5.2 (rutin) 3'' OH 4'' O OH 5'' 1'' 6'' 4'''HO Hoa hòe rutinoside 5' 6' 6''' 5''' H3C HO 16 quercetin-3-O- OH 3' O 1''' O 3''' 2''' OH resveratrol Cốt khí củ Resveratrol – Cốt khí củ beta-mono-Dglucoside (picied) 18 C7.3 emodin Cốt khí củ 19 C8.4 emodin-8-O-β-D- Cốt khí củ glucopyranoside 13 20 C8.5 physcion-8-O-β- Cốt khí củ Dglucopyranoside Ví dụ: Phân tích cấu trúc hóa học hợp chất vitexin (MB1) Hợp chất MB1 phân lập dạng chất rắn màu vàng nhạt, đnc: 247-249ºC Phổ khối ESI-MScho pic ion phân tử proton hóa m/z 433 [M+H]+ Trên phổ IR có đỉnh hấp thụ mạnh nhóm OH nhóm carbonyl 3410, 1656, 1566cm1 Trên phổ 1H-NMR cho tín hiệu proton dạng AA’BB’ H 8,01 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-2’, H-6’); 6,89 (2H, dd, J = 8,0 Hz, H-3’, 5’) chứng tỏ vị trí C-4’ vòng B bị Ngồi ra, tín hiệu proton vòng thơm dạng singlet H 6,75 (1H, s, H-3); 6,24 (1H, s, H-6) proton anomeric H 4,71 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-1’’) quan sát thấy phổ H-NMR Tất liệu phổ gợi ý hợp chất flavone gắn với phân tử đường glucose Hằng số tương tác lớn (J = 9,0 Hz) proton anomeric H-1’’ cho phép xác định cấu hình β phần đường glucose.Tín hiệu OH H 13,15 đặc trưng cho liên kết cầu hydro nội phân tử vị trí C-5 quan sát thấy phổ 1H-NMR.Trên phổ 13C-NMR phổ DEPT của MB1 cho biết có mặt 21 nguyên tử cacbon 15 cacbon sp2 cacbon sp3 tương ứng với nhóm carbonyl C 182,1 (C-4), nhóm methin vòng thơm C 102,4 (C-3);98,4 (C-6), 129,7 (C-2’, C-6’); 115,9 (C-3’, C-5’), nhóm methylen C 61,4 (C-6’’), nhóm oxymethin cacbon bậc Các mảnh cấu trúc sau kết nối nhờ phân tích phổ HMBC Tương tác HMBC proton OH-5 (δH13,15) C-5 (δC160,4)/C-6 (δC98,4)/C-10 (δC104,6), tương tác proton H-6 (δH6,24) với C-5 (δC 160,4)/C-7 (δC 162,8)/C-8 (δC 104,7)/C-10 (δC 104,7) tương tác proton H-1’’ (δH4,71) với C-7 (δC 162,8)/C-8 (δC 104,7)/C-9(δC 156,1) xác nhận cấu trúc vòng A bị vị trí cho phép xác định đường glucose gắn với khung flavone vị trí C-8 vòng A.Tương tác HMBC H-2’, 6’(δH8,01) với C-2 (δC164,2) tương tác H-3’, 5’ (δH 6,89) C-1’ (δC121,1)/C-4’ (δC161,1) xác nhận cấu trúc vòng B liên kết C-1’ C-2 Ngồi ra, cấu trúc vòng C thiết lập qua tương tác xa phổ HMBC H-3 (δH6,75) với C-2 (δC164,2)/C-4 (δC182,1)/ C-10 (δC104,7) 14 Kết hợp liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, ESI-MS, HSQC, HMBC so sánh với tài liệu tham khảo [32] cho phép xác định MB1 vitexin Hình 4.44 Cơng thức cấu tạo số tương tác phổ HMBC chất vitexin 4.4 Kết nghiên cứu thủy phân hợp chất glycozit thực vật Việt Nam sử dụng enzym BGL-P: Các glycozit phân lập đề tài có liên kết β, việc ứng dụng BGL-P tách chiết từ chủng P citrinum hứa hẹn nhiều khả thi 4.4.1 Kết thủy phân sử dụng enzym β- glucosidase tự do: 4.4.1.1 Nghiên cứu thủy phân glycozit quercetin: Tiến hành thủy phân quercetin -3-O-beta-galactoside với nồng độ enzym BGL-P khác 0,1U/ml; 0,55U/ml 1,0U/ml, thời gian 2h, 4h, 6h; thu hiệu suất thực tế thí nghiệm Từ số liệu thực tiễn thu được, tiến hành giải toán quy hoạch thực nghiệm phần mềm Modde 5.0 Khi dựng phương trình hồi quy hệ trục không gian chiều phần mềm Modde 5.0 thu đồ thị hình 4.74 Hình 4.74: Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy thể vùng tối ưu cặp yếu tố nồng độ enzym thời gian thủy phân hệ trục không gian ba chiều Hình 4.75: Đồ thị biểu diễn mặt đáp ứng nồng độ enzym thời gian phản ứng tới hiệu suất thủy phân Sau thực tối ưu hóa phương pháp quy hoạch thực 15 nghiệm, nhận thấy: enzym thực phản ứng tốt với hiệu suất 98,3% nồng độ 0,6U/ml thời gian 4,5h Tuy nhiên giảm nồng độ enzym tăng thời gian ủ thu hiệu suất cao Dựa vào đồ thị, chọn nồng độ enzym 0,4U/ml thời gian phản ứng 5h, kết thực nghiệm thu hiệu suất 98%, tương tự kết quy hoạch Thủy phân quercetin-3-O-β-D-glucuronide Điều kiện thủy phân tối ưu hóa sử dụng để thủy phân quercetin-3-O-β-Dglucuronide: nồng độ enzym 0,4U/ml, nhiệt độ phản ứng 60oC 5h, đạt hiệu suất 90% Trong đó, theo nhiều tài liệu tham khảo, việc thủy phân glucoronides với xúc tác hóa học vơ khó, dùng acid đặc đạt 20% [128] Hình 4.77 Thủy phân hợp chất quercetin enzym BGL-P Tiến hành thủy phân quercetin-3-O-rutinoside (rutin) Với cấu tạo gồm phần aglycon quercetin gắn với đường rutinose, để tiếp cận liên kết β-glucozit enzym BGL-P bị cản trở phân tử đường α-Lrhamnopyranosyl mà khơng thể phân cắt Vì vậy, hiệu suất thủy phân BGL-P với rutin thấp, 25% với thời gian kéo dài cần khuấy trộn nhẹ 4.4.1.2 Nghiên cứu thủy phân flavonoid glycozit khác Tương tự với flavonoit glucozit khác, nhóm thu hiệu suất phản ứng cao 16 Tiến hành thủy phân genistin daidzin điều kiện: nồng độ enzym BGL-P 0,4U/ml với thời gian ủ 5h, phản ứng dừng cách thêm 10ml MeOH Kết thủy phân cho thấy, hiệu suất phản ứng đạt cao với chất genistin daidzin 98% Hình 4.78 Thủy phân hợp chất genistin daidzin Với picied, nhóm nghiên cứu đạt hiệu suất 99% sau 5h thủy phân 60oC Cao nhiều so với nghiên cứu trước giới, 40% với phương pháp hóa học 60% với phương pháp enzym [131] Hình 4.79 Thủy phân hợp chất picied Trong điều kiện tương tự, việc thủy phân isorhamnetin-3-O-β-Dglucuronide, cho hiệu suất đến 85% sau 5h, hiệu suất thấp thủy phân hợp chất chứa gốc đường chất glucose Hình 4.80 Thủy phân hợp chất isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide Enzym BGL-P có khả thủy phân isoapigenin-6-C-glucoside apigenin-8-C-glucoside, với hiệu suất tương đương 1'' 2'' 3'' 5'' 4'' 6'' 60 oC ,5 h, 95 % 17 Hình 4.81 Thủy phân hợp chất isoapigenin-6-C-glucoside apigenin-8-Cglucoside 4.4.1.3 Nghiên cứu thủy phân anthraquinone glycozit Thủy phân emodin-8-O-β-D-glucopyranoside (19) physcion-8-O-β-Dglucopyranoside (20) nhận thấy: với cấu trúc liên kết O-glucozit, việc thủy phân hợp chất anthraquinone glycozit cho hiệu suất cao tương đương thủy phân glycozit Hình 4.82 : Ứng dụng BGL-P thủy phân hợp chất anthraquinone glycozit Sản phẩm thủy phân physcion-8-O-β-D-glucopyranoside (20) sau xác định cấu trúc phổ NMR cho thấy physcion 18 4.4.2 Kết thủy phân sử dụng enzym β- glucosidase cố định: Tiến hành thí nghiệm chất quercetin -3-O-beta-galactoside với enzym cố định cá Hình 4.84: Đồ thị biểu diễn khả tái sử dụng enzym cố định chất mang Enzym BGL-P cố định vào ca-alginat tái sử dụng lần trước 50% hoạt tính Đây kết khả quan để ứng dụng việc cố định enzym thủy phân hợp chất góp phần nâng cao hiệu sử dụng enzym giảm chi phí sản xuất 4.5 Kết hoạt tính sinh học hợp chất glycozit aglycon tương ứng: 4.5.1 Khả trung hòa gốc oxy hóa tự DPPH Nghiên cứu tiến hành nghiên cứu khả trung hòa gốc oxy hóa tự DPPH hợp chất thu đề tài: Bảng 4.14 : Hoạt tính trung hòa gốc oxy hóa tự DPPH aglycon glycozit EC50 STT Tên hoạt chất (mM) (µg/ml) Quercetin 0,027 8,2 quercetin-3-O-β-galactoside 0,055 25,6 quercetin-3-O-rutinoside 0,143 87,4 quercetin-3-O-β-D-glucuronide 0,047 22,5 Luteolin 0,015 4,3 Kaemferol 0,060 17,2 Isorhamnetin 0,032 10,1 isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide 0,133 65,5 19 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Apigenin 0,047 12, apigenin-6-C-glucoside 0,055 23,8 apigenin-8-C-glucoside 0,055 23,8 Genistein >0,948 >256 Genistein 7-O-beta-D-glucoside 0,256 110,7 Daidzein 0,532 135,3 Daidzein7-O-beta-D-glucoside >0,615 >256 Resveratrol 0,036 8,2 Resveratrol –beta-mono-D-glucoside 0,043 16,8 Emodin 0,205 55,4 emodin-8-O-β-D-glucopyranoside >0,592 >256 Physcion 0, 731 207,8 physcion-8-O-β-D-glucopyranoside >0,573 >256 Catechin 0,038 11,0 Các flavonoid thu có hoạt tính chống oxy hóa hầu hết aglycon có hoạt tính cao glycozit chúng Khả trung hòa gốc tự DPPH nhóm aglycon glucozit tương ứng xếp theo thứ tự giảm dần sau: quercetin > quercetin-3-O-β-D-glucuronide > quercetin-3-O-βgalactoside > rutin; hay resveratrol > resveratrol –beta-mono-D-glucoside; isorhamnetin > isorhamnetin-3-O-β-D-glucuronide Việc thủy phân glycozit thành aglycon giúp tạo hợp chất có tiềm chống oxy hóa cao tăng khả ứng dụng 4.5.2 Khả ức chế enzym alpha- glucosidase: Để đánh giá khả ứng dụng vào điều trị bệnh tiểu đường, tiến hành thử hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase số hợp chất thu Bảng 4.15 : Kết hoạt tính ức chế enzym α- glucosidase IC50 STT Tên hoạt chất (µg/ml) (mM) quercetin 6,3 0,021 quercetin-3-O-β-galactoside 44,1 0,095 quercetin-3-O-rutinoside 131,9 0,216 quercetin-3-O-β-D-glucuronide 68,9 0,144 apigenin 53,46 0,198 apigenin-6-C-glucoside 117,2 0,271 apigenin-8-C-glucoside 107,2 0,248 genistein 13,5 0,050 20 10 11 12 genistein 7-O-beta-D-glucoside >256 >0,592 daidzein 26,9 0,106 daidzein7-O-beta-D-glucoside >256 >0,615 acarbose 192,1 0,297 Nhóm hợp chất flavonoit từ thực vật Việt Nam có tiềm to lớn để ứng dụng điều trị tiểu đường, nhiều hợp chất có khả ức chế enzym α- glucosidase cao chất đối chứng acarbose (hoạt chất sử dụng điều trị bệnh) Trong phép thử quercetin, apigenin, genistein daidzein đạt giá trị IC 50 nồng độ thấp glycozit chúng 456.3 Khả ức chế enzym ACE hợp chất Với mục đích so sánh khả ức chế enzym Angiotensin I (gây co mạch làm tăng huyết áp) aglycon sau thủy phân so với glycozit tương ứng, tiến hành thử khả ức chế enzym Angiotensin I hợp chất quercetin Kết thu sau: Bảng 4.16: Kết khả ức chế ACE hợp chất IC50 Tên hoạt chất (µg/ml) (mM) Quercetin 23,6 0,078 quercetin-3-O-rutinoside 70,34 0,115 quercetin-3-O-β-D-glucuronide >256 >0,535 Captopril 0,000326 0,000015 Như vậy, khả ức chế ACE chất nghiên cứu dù thấp chất đối chứng nhiều lần, nhiên kết nghiên cứu rằng: hoạt tính quercetin cao glycozit chúng Từ nghiên cứu hoạt tính sinh học nêu trên, nhóm nghiên cứu nhận thấy hầu hết thử nghiệm in vitro, hoạt tính aglycon thường cao glycozit chúng Đó dấu hiệu tốt cho khả ứng dụng hợp chất vào thực tế tự nhiên, flavonoit thường tồn dạng glycozit việc sử dụng enzym thủy phân, việc tạo lượng lớn aglycon khả thi 4.6 Kết nghiên cứu khử trùng vi sinh vật băng phương pháp điện hóa Trong nghiên cứu có sử dụng vi sinh vật, việc giữ an tồn mơi trường, kiểm sốt phát tán vi sinh vật sau nghiên cứu quan trọng Do đó, sau thí nghiệm vi sinh vật cần tiệt trùng cẩn thận trước thải bỏ Trên sở đảm bảo an tồn sinh học, nhóm nghiên cứu trước tiên tiến hành thí nghiệm chủng vi khuẩn thị Dựa vào sức sống bền bỉ 21 bào tử điều kiện khắc nghiệt, nghiên cứu chọn bào tử B cereus làm thị cho nghiên cứu mơ hình Nhóm nghiên cứu thu kết điều kiện tối ưu phương pháp điện hóa: dòng điện có cường độ 2A, nồng độ dung dịch Cl- 50mg/L pH 6,8 với đệm phosphate 0,01M, có khả diệt 100% bào tử B cereus nồng độ 105 tế bào/ml sau thời gian lưu mẫu 30 phút Áp dụng kết nghiên cứu trên, nhóm nghiên cứu tiến hành khử trùng mẫu bào tử nấm P citrinum Thí nghiệm tiến hành phương pháp trực tiếp (dung dịch điện phân chứa bào tử qua buồng điện phân) gián tiếp(dung dịch điện phân thêm vào bình chứa bào tử nấm) Kết nhận thấy, khử trùng bào tử nấm theo cách cách trực tiếp thời gian lưu mẫu cần thiết 30 phút gián tiếp thời gian lưu mẫu cần thiết 60 phút Hình 4.88: Ảnh hưởng thời gian lưu trữ mẫu đến khả diệt bào tử P citrinum phương pháp điện hóa KẾT LUẬN Phân lập định danh chủng nấm Penicillium citrinum có khả sinh tổng hợp β-glucosidase cao từ rễ Bọ mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz): - Phân lập 05 chủng nấm khiết từ mẫu rễ Bọ mẩy đánh giá khả sinh β-glucosidase chúng số mơi trường - Chủng nấm có khả sinh β-glucosidase tốt định danh phương pháp đại thể, vi thể, sinh học phân tử, xác định Penicillium citrinum với độ tương đồng 100% từ sở liệu NCBI 22 Lên men sinh tổng hợp đánh giá thông số động học βglucosidase dạng tự cố định từ P citrinum: - P citrinum nuôi cấy môi trường lỏng Pd, ngày, 27oC, 200 rpm Enzym kết tủa phương pháp muối tách, loại muối Cephadex G200, tinh sạch, đông khô, enzym hoạt độ 62,412 U/mg - Enzym tự do: to: 60oC, pH: 6,0, Km= 0,011 µmol, Vmax= 13,91 µmol/phút - Enzym cố định calci alginat: 50 oC, pH: 5,5-6,2, Km= 0,034 µmol, Vmax = 13,09 µmol/phút Tái sử dụng lần với β-NPG lần với quercetin-3-O-beta-galactoside - Enzym cố định bã cà phê: to: 40oC, pH: 6,0, Km= 0,022 µmol, Vmax= 14,45 µmol/phút Khả tái sử dụng Phân lập xác định cấu trúc phương pháp phổ đại với 17 hợp chất flavonoit glycozit aglycone: Genistein, daidzein, genistin, daidzin, catechin, hyperoside, quercetin, kaempferol, isorhamnetin-3-O-β-Dglucuronide, quercetin-3-O-β-D-glucuronide, vitexin, isovitexin, luteolin, taxifolin, rutin, resveratrol, picied, hợp chất anthraquinone glycozit aglycon: emodin, emodin-8-O-β-D-glucopyranoside, physcion-8-O-β-Dglucopyranoside Xác định quy trình thủy phân hợp chất enzym BGL-P phân lập từ P citrinum cho hiệu suất cao: Phản ứng diễn với enzym nồng độ 0,4U/ml đệm citrat pH 6,0, thời gian ủ 5h nhiệt độ 60 oC Tiến hành thủy phân 10 hợp chất glycozit phân lập điều kiện tối ưu cho hiệu suất cao từ 85 đến 98%, ngoại trừ rutin với hiệu suất 25% Xác định điều kiện phù hợp để khử trùng VSV sau trình lên men: - Thiết kế quy trình điện phân với bào tử B cereus - Xác định điều kiện khử trùng (100%) đối tượng P citrinum: Phương pháp điện hóa với thiết bị hàng A-dept (Đan mạch), cường độ dòng 2A, đệm phosphat pH 6,8, nồng độ Cl - 50mg/L, thời gian 60 phút, nhiệt độ phòng Hoạt tính sinh học đa số aglycon cao so với dạng glycozit tương ứng, xét khả chống oxy hóa (hệ DPPH), điều trị tiểu đường (α-glucosidase), điều trị cao huyết áp (enzyme Angiotensin I), đem lại tiềm ứng dụng thực tiễn 23 - Trên hệ DPPH: aglycon có hoạt tính cao hàng chục lần glycozit tương ứng - Trên hệ α-glucosidase: aglycon có hoạt tính cao glycozit tương ứng Một số aglycon có hoạt tính cao nhiều so với acarbose- hoạt chất đối chứng- sử dụng điều trị - Trên hệ enzym angiotensin: hoạt tính aglycon cao glycozit nhiên thấp nhiều so với chất đối chứng KIẾN NGHỊ BGL-P phân lập từ chủng nấm P citrinum thuộc nhóm β-glucosidase phổ rộng, có hoạt tính với nhiều chất khác Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu enzym góp phần mở rộng ứng dụng BGL-P enzym có hoạt tính cao, thủy phân flavonoit glucozit, anthraquinone glycozit cho hiệu suất từ 85 đến 98% với điều kiện nhiệt độ thấp thời gian ngắn, có tiềm ứng dụng vào thực tế Do đó, cần tiếp tục nghiên cứu sử dụng quy mô lớn nhằm tạo hoạt chất aglycon phục vụ cho đời sống 24 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN Lần phân lập định danh chủng nấm sinh enzym betaglucosidase hoạt tính cao từ rễ Bọ Mẩy (Clerodendron cyrtophyllum Turcz) Penicilium citrinum Lần nghiên cứu sử dụng enzym beta-glucosidase phân lập từ Penicilium citrinum để thủy phân hợp chất glycozit có thực vật Việt Nam cho hiệu suất cao Lần nghiên cứu cách hệ thống, liên ngành từ việc tuyển chọn định danh chủng vi sinh vật sinh enzym , phân lập enzym nghiên cứu điều kiện hoạt động nó; phân lập hợp chất glycozit từ thực vật Việt Nam để ứng dụng enzym từ chủng vi sinh vật thủy phân chất này, kiểm tra so sánh hoạt tính hợp chất glycozit ban đầu sản phẩm sau thủy phân; cuối nghiên cứu khử trùng vi sinh vật sử dụng nghiên cứu trước thải bỏ đảm bào an toàn cho môi trường sống ... pháp nghiên cứu – sinh chuyển hóa xúc tác sinh học, lựa chọn đề tài: Nghiên cứu phản ứng thủy phân glycozit tự nhiên enzym β-glucosidase đánh giá hoạt tính sinh học sản phẩm nhận được Trong nghiên. .. Đánh giá hoạt tính sinh học glycozit sản phẩm thủy phân tương ứng 3.6.1 Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa hệ DPPH [117-119] Thời gian phản ứng 30 phút 370C, đọc mật độ hấp phụ DPPH chưa phản ứng. .. nghiên cứu luận án Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ enzym vào q trình thủy phân hợp chất glycozit thực vật, tạo nên sản phẩm có hoạt tính cao đồng thời phát triển hướng nghiên cứu xanh hóa hữu Các