Đang tải... (xem toàn văn)
Một số bài viết trên tạp chí: Tình trạng vi khuẩn mang gen ESBL trên người khỏe mạnh tại xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam; Nghiên cứu quá trình giải phóng thuốc quinin sulfat từ vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan/quinin sulfat; Bào chế gel vi nhũ tương từ cao khô Rau đắng đất [Glinus oppositifolius (L.) Aug. DC., Molluginaceae]; Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp kỹ thuật đến khả năng nhân giống hữu tính cây Xạ can (Belamcanda chinensis (L.) DC.)...
Khoa học Y - Dược Tình trạng vi khuẩn mang gen ESBL người khỏe mạnh xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam Phạm Thị Thanh Hường1, Vũ Thanh Phương1, Vũ Anh Thư1, Nguyễn Quang Huy1, Phạm Duy Thái2, Trần Huy Hoàng2* Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Ngày nhận 8/3/2019; ngày chuyển phản biện 11/3/2019; ngày nhận phản biện 8/4/2019; ngày chấp nhận đăng 15/4/2019 Tóm tắt: Nghiên cứu mơ tả tình trạng vi khuẩn mang gen ESBL kháng kháng sinh (KKS) nhóm betalactam phổ rộng phân lập mẫu phân người khỏe mạnh xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam năm 2018 94 mẫu cấy môi trường MacConkey agar có kháng sinh ceftazidime µg/ml sử dụng để tiến hành phân tích khả sinh trưởng vi khuẩn kháng thuốc tỷ lệ vi khuẩn mang gen ESBL Kết cho thấy: i) tình trạng vi khuẩn phân lập từ phân người khỏe mạnh kháng thuốc cao: 93/94 (99%), đồng thời mức độ KKS vi khuẩn phân lập khác chia làm bốn loại; ii) tỷ lệ vi khuẩn mang gen KKS nhóm ESBL cao: cao TEM (85,1%), tiếp đến CTX-M (71,3%) thấp SHV (5,3%) Điều cho thấy tình trạng vi khuẩn mang gen ESBL KKS cộng đồng Tràng An, Bình Lục, Hà Nam nghiêm trọng cần giám sát chặt chẽ Nghiên cứu chứng tỏ nguy KKS tiềm ẩn hộ gia đình khỏe mạnh cộng đồng Qua rằng, việc theo dõi tình trạng KKS cộng đồng Hà Nam địa phương khác vô cần thiết nhằm bảo vệ sức khỏe người Từ khóa: CTX-M, ESBL, SHV, TEM Chỉ số phân loại: 3.3 Đặt vấn đề Hiện nay, KKS vấn đề quan tâm hàng đầu giới Tình trạng vi khuẩn KKS trở thành vấn đề nghiêm trọng sức khỏe người với ngành y tế toàn cầu Ngày nhiều bệnh lây nhiễm trở nên khó chữa, chí vơ phương cứu chữa, dẫn đến tỷ lệ tử vong ngày tăng Theo báo cáo, hàng năm có nửa triệu người chết bệnh truyền nhiễm có nguyên nhân chủng vi khuẩn KKS [1, 2] Theo “Review on Antimicrobial Resistance” Jim O’Nell cộng xuất vào ngày 14/5/20151, có lý khiến KKS dần trở thành mối nguy với tình hình y tế cộng đồng giới Thứ nhất, trình nghiên cứu phát triển thuốc, đặc biệt thuốc kháng sinh, có dấu hiệu chậm lại Thứ hai, việc sử dụng thuốc kháng sinh nói chung có dấu hiệu gia tăng vài thập kỷ gần Chính việc sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh đặc hiệu với liều lượng cao để điều trị bệnh vi https://amr-review.org/sites/default/files/SECURING%20NEW%20 DRUGS%20FOR%20FUTURE%20GENERATIONS%20FINAL%20 WEB_0.pdf khuẩn gây tạo điều kiện cho chúng nâng cao khả kháng thuốc Ở nhiều nước, kháng sinh mua dễ dàng mà khơng cần có đơn thuốc, dẫn đến việc sử dụng thuốc bừa bãi, tràn lan [3, 4] Hơn nữa, việc sử dụng thuốc kháng sinh diện rộng nông nghiệp việc bác sĩ kê sai đơn thuốc khiến tình hình KKS đà gia tăng Tại Việt Nam, nghiên cứu vi khuẩn đường ruột sinh ESBL nhiều, nhiên tập trung chủ yếu sở điều trị nhóm bệnh nhân mà chưa có nhiều nghiên cứu cộng đồng nhóm người lành khỏe mạnh Nghiên cứu thực nhằm xác định đặc điểm KKS vi khuẩn sinh ESBL tỷ lệ mang gen mã hóa ESBL phân lập người lành khỏe mạnh xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam Phương pháp nghiên cứu Đối tượng địa điểm nghiên cứu Nghiên cứu thực nhóm người lành khỏe mạnh sinh sống xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam năm 2018 Tác giả liên hệ: Email: thh@nihe.org.vn ∗ 61(5) 5.2019 Khoa học Y - Dược Prevalence of ESBL-producing bacteria on healthy people in Trang An commune, Binh Luc district, Ha Nam province Thi Thanh Huong Pham1, Thanh Phuong Vu1, Anh Thu Vu1, Quang Huy Nguyen1, Duy Thai Pham2, Huy Hoang Tran2* University of Science and Technology of Hanoi, Vietnam Academy of Science and Technology National Institute of Hygiene and Epidemiology Received March 2019; accepted 15 April 2019 Abstract: The cross-sectional study aimed to describe the status of extended-spectrum beta-lactamases (ESBL)-producing bacteria isolated from stool samples of healthy people in Trang An commune, Binh Luc district, Ha Nam province in 2018 A total of 94 samples were cultured on MacConkey agar containing µg/ml ceftazidime for evaluating the growth of drug-resistant strains and the rate of bacteria carrying ESBL-encoding genes The results showed that: (1) the proportion of ESBL-producing bacteria were found very high in the participants (99%); nevertheless, the levels of antibiotic resistance were associated with the rate of bacterial growth; (2) the TEM was the most prevalent ESBLencoding gene (85.1%), followed by CTX-M (71.3%) and SHV (5.3%) These results exhibited that the status of ESBL-producing bacteria was very serious in the Trang An population Therefore, it is essential to monitor the antibiotic resistance in this region as well as other regions for the long-term development strategy to prevent the emergence and spread of antibiotic-resistant bacteria Keywords: CTX-M, ESBL, SHV, TEM Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu mô tả cắt ngang phân tích phịng thí nghiệm Cỡ mẫu: 94 mẫu phân thu thập từ người khỏe mạnh xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam Tiêu chuẩn lựa chọn thành viên tham gia nghiên cứu: người dân khỏe mạnh, sinh sống hộ gia đình tự nguyện tham gia nghiên cứu Tiêu chuẩn loại trừ người không lấy mẫu phân mắc phải bệnh mạn tính Các kỹ thuật xét nghiệm - Nuôi cấy vi khuẩn môi trường chọn lọc khả sinh ESBL: thành viên chọn vào nghiên cứu thu thập mẫu phân để làm xét nghiệm Mỗi người lấy g phân thời điểm điều tra Các mẫu phân bảo quản vận chuyển theo thường quy Phòng thí nghiệm KKS Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương ngày Mẫu phân cấy trực tiếp lên mơi trường MacConkey có bổ sung ceftazidime (2 µg/ml) ủ 37oC qua đêm Các đĩa có khuẩn lạc chọn để lưu giữ tiến hành thí nghiệm - PCR phát vi khuẩn mang gen ESBL bao gồm gen TEM (TEM-F: TTTTCGTGTCGCCCTTATTCC; T E M - R : C G T T C AT C C ATA G T T G C C T G A C T C ) , CTX-M (CTX-M F: CGATGTGCAGTACCAGTAA; CTX-M R: TTAGTGACCAGAATCAGCGG), SHV (SHV-F:3TTATCTCCCTGTTAGCCACC;3SHV-R: GATTTGCTGATTTCGTCGG): chủng vi khuẩn mọc môi trường chọn lọc tách chiết ADN phương pháp tách nhiệt 950C 10 phút Sau đó, mẫu ADN sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR để phát gen KKS Phân tích số liệu Dữ liệu lưu phân tích phần mềm Microsoft Excel Classification number: 3.3 Đạo đức nghiên cứu Nghiên cứu Hội đồng Y đức thông qua nhận chấp thuận tham gia nghiên cứu hộ gia đình xã Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam Kết Kiểu hình sinh ESBL phản ánh nguy KKS cộng đồng 94 mẫu phân nuôi cấy môi trường chọn lọc khả sinh ESBL vi khuẩn Kết cho thấy 93 mẫu dương tính với ESBL mẫu âm tính với ESBL Kiểu hình mẫu dương tính với ESBL phân làm loại 61(5) 5.2019 Khoa học Y - Dược dựa theo đặc điểm sinh trưởng khuẩn lạc vi khuẩn: loại (khuẩn lạc mọc thưa thớt yếu), loại (khuẩn lạc mọc nhiều sinh trưởng yếu), loại (khuẩn lạc mọc dày sinh trưởng tốt), loại (khuẩn lạc mọc dày sinh trưởng mạnh) Kết phân bố loại vi khuẩn dương tính ESBL thể bảng Bảng Tỷ lệ phân bố loại kiểu hình vi khuẩn có vi khuẩn sinh ESBL phân lập từ mẫu phân nghiên cứu Kết nuôi cấy Loại Loại Loại Loại Tổng 22 (23,66%) 37 (39,78%) 25 (26,88%) (9,68%) 93 Kết PCR phát gen ESBL KKS Nghiên cứu tiến hành kỹ thuật PCR phát gen KKS nhóm ESBL bao gồm TEM, CTX-M, SHV với 94 chủng vi khuẩn phân lập Kết PCR thể qua Kết PCR phát gen ESBL KKS Nghiên tiến diện hành kỹtrong thuật PCR phát hình ảnhcứuđại hình gen KKS nhóm ESBL bao gồm TEM, CTX-M, SHV với 94 chủng vi khuẩn phân lập Kết PCR thể qua hình ảnh đại diện hình Hình Biểu đồ thể số lượng mẫu dương tính với gen TEM, SHV, CTX-M Kết PCR cho thấy tần suất xuất gen KKS mẫu vi khuẩn nghiên cứu Có vi khuẩn mang ba gen KKS TEM, CTX-M SHV Tuy nhiên, có nhiều trường hợp vi khuẩn mang đa gen KKS, cụ thể có tới 60 trường hợp (63,8%) phát gen KKS trường hợp phát gen KKS Tần suất gen kháng xuất mẫu phân lập thể cụ thể bảng Bảng Tần suất xuất gen KKS mẫu phân lập Đơn gen Tần suất xuất kiểu gen Đa gen CTX-M (%) TEM (%) Phát gen (%) CTX-M/ TEM (%) SHV/TEM (%) (6,38) 17 (18,09) (3,19) 58 (61,70) (2,13) Khơng có gen (%) (8,51) Bàn luận Hình (A) Kết PCR đại diện phát gen CTX-M (B) Kết PCR đại diện phát gen TEM KếtPCR PCR diện phát phát gen gen SHV CTX-M M thang chuẩn Hình (A) Kết (C) đạiđạidiện (B) Kết DNA (GeneRuler 1kb DNA Ladder); P: chứng dương; N: chứng âm PCR đại diện phát gen TEM (C) Kết PCR đại diện phát gen SHV M thang chuẩn DNA (GeneRuler 1kb DNA Ladder); P: chứng dương; N: chứng âm Trong 94 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu nghiên cứu, số chủng dương tính với gen TEM cao nhất: 80/94 chủng, chiếm 85,1% tổng số chủng Tiếp theo CTX-M với 67/94 chủng, tương đương 71,3% Tỷ lệ dương tính thấp SHV với 5/94 chủng dương tính, chiếm khoảng 5,3% Có chủng vi khuẩn âm tính với gen (hình 2) 61(5) 5.2019 Kết sàng lọc mẫu vi khuẩn từ phân người thu thập nghiên cứu cho thấy, tỷ lệ vi khuẩn sinh ESBL cao (93/94 mẫu vi khuẩn phân lập được) Kết chứng tỏ diện vi khuẩn đường ruột sinh ESBLtrên mẫu phân người khỏe mạnh Hà Nam cao nhiều so với số nghiên cứu trước Việt Nam [5-7] Điều cho thấy tình trạng báo động vi khuẩn KKS lưu hành cộng đồng Tỷ lệ vi khuẩn KKS cao phân lập từ người khỏe mạnh phản ánh tình trạng sử dụng kháng sinh bừa bãi, khơng kiểm sốt cộng đồng dẫn đến vi khuẩn thích ứng kháng lại kháng sinh phổ biến Tuy nhiên, kết nuôi cấy môi trường chọn lọc cho thấy mức độ kháng thuốc vi khuẩn không đồng mẫu phân lập Cụ thể, khoảng 23,66% số mẫu mọc thưa thớt yếu môi trường bổ sung kháng sinh, 39,78% số mẫu mọc nhiều sinh trưởng yếu, 26,88% số mẫu mọc nhiều sinh trưởng tốt, có khoảng 9,68% số mẫu mọc nhiều Khoa học Y - Dược phát triển mạnh mơi trường có kháng sinh (bảng 1) Như vậy, khơng có can thiệp quản lý tốt hành vi sử dụng kháng sinh cộng đồng, tình trạng KKS vi khuẩn ngày tăng số lượng mức độ kháng thuốc Kết PCR phát gen TEM, CTX-M, SHV KKS vi khuẩn phân lập nghiên cứu cho thấy mức độ KKS cao vi khuẩn, dương tính với gen TEM 80/94 chủng (chiếm 85,1%), CTX-M 67/94 chủng (71,3%) SHV 5/94 chủng (5,3%) Tỷ lệ vi khuẩn dương tính với kiểu gen nghiên cứu cao hẳn so với nghiên cứu trước Hà Nam năm 2015 với tỷ lệ vi khuẩn mang gen TEM, CTX-M, SHV 47,6; 37; 1,5% Đồng thời, kết phát gen kháng ESBL nghiên cứu cho tỷ lệ tương đồng với nghiên cứu Karen Bush cs hay nghiên cứu Panjarat Suntarasamit [8, 9] Điều cho thấy tình trạng vi khuẩn KKS cộng đồng ngày gia tăng Không thế, vi khuẩn mang gen ESBL lưu hành cộng đồng ngày đa dạng kiểu gen kháng thuốc, cụ thể mẫu vi khuẩn phân lập mang nhiều loại gen KKS khác (bảng 2) Điều lý giải việc lạm dụng nhiều loại kháng sinh điều trị nhiễm khuẩn dùng kháng sinh với liều lượng không cách, không tuân theo khuyến cáo bác sĩ, dẫn đến vi khuẩn dần kháng lại kháng sinh Bên cạnh đó, vi khuẩn có khả lan truyền gen KKS loài loài khác thơng qua nhiều hình thức plasmid, transposons intergrons [10] Do đó, cần có biện pháp cấp bách cụ thể để hạn chế khả phát triển lan truyền gen KKS vi khuẩn nhằm bảo vệ sức khỏe cộng đồng Kết luận Qua nghiên cứu cho thấy, tình trạng KKS mẫu vi khuẩn phân lập từ phân người khỏe mạnh Tràng An, huyện Bình Lục, tỉnh Hà Nam mức cao (99%) kháng nhiều mức độ khác thơng qua kiểu hình mọc mơi trường chọn lọc có kháng sinh Tỷ lệ vi khuẩn mang gen ESBL cao, cụ thể gen TEM chiếm tỷ lệ cao khoảng 85,1%, CTX-M chiếm 71,3% thấp SHV chiếm 5,3% tổng số chủng Bên cạnh đó, tần suất xuất gen KKS đa dạng Có chủng vi khuẩn phát ba loại gen KKS nêu Tuy nhiên, có chủng lại phát tới hai ba gen KKS nghiên cứu 61(5) 5.2019 LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu hỗ trợ Dự án 23HN: Thực trạng sử dụng kháng sinh tỷ lệ người mang số vi khuẩn KKS cộng đồng xã tỉnh Hà Nam năm 2018 Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Đơn vị Nghiên cứu lâm sàng Trường Đại học Oxford (OUCRU) tài trợ TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Amr-review.org (2019), Background|AMR Review, [online] available at: https://amr-review.org/background.html [accessed 12 Feb 2019] [2] Who.int (2018), Antibiotic resistance, [online] available at: https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/antibioticresistance [accessed 12 Feb 2019] [3] C.L Ventola (2015), “The antibiotic resistance crisis: part 1: causes and threats”, P&T: A Peer-Reviewed Journal for Formulary Management, 40(4), pp.277-283 [4] Nature.com 495(7440), p.141 (2013), “The antibiotic alarm”, Nature, [5] Hoang Huy Tran, Soudeh Ehsani, Keigo Shibayama, Mari Matsui, Satowa Suzuki, Minh Binh Nguyen, Duong Nhu Tran, Van Phuong Tran, Dieu Linh Tran, Hoai Thu Nguyen, Duc Anh Dang, Hong Son Trinh, Tran Hien Nguyen, and Heiman F.L Wertheim (2015), “Common isolation of New Delhi Metallo-beta Lactamase 1-producing Enterobacteriaceae in a large surgical hospital in Vietnam”, Eur J Clin Microbiol Infect Dis., 34(6), pp.1247-1254 [6] Mai Văn Tuấn, Nguyễn Thanh Bảo (2006), “Khảo sát trực khuẩn gram âm sinh men betalactam phổ rộng phân lập Bệnh viện Trung ương Huế”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 12, phụ số 1, tr.150-156 [7] Nguyễn Đỗ Phúc, Nguyễn Lý Hoàng Ngân (2014), “Tần suất mang gen sinh ESBL AMPC Enterobacteriacae cộng đồng TP Hồ Chí Minh năm 2013”, Tạp chí Y học TP Hồ Chí Minh, 18, phụ số 6, tr.388-392 [8] Karen Bush, Grogre A Jacoby, and Antone A Medeiros (1995), “A functional classification scheme for β-lactamases and its correclation with molecular structure”, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 39(6), pp.1211-1233 [9] Panjarat Suntarasamit (2007), Characterization of extended spectrum-β-lactamase (ESBL) in E coli and K pneumoniae and their responsers to combinations of piperacillin/tazobactam plus amikacin or ciprofloxacin versus meropenem, thesis PhD, Mahidol University [10] M.N Alekshun, S.B Levy (2007), “Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance”, Cell, 128(6), pp.1037-1050 Khoa học Y - Dược Nghiên cứu q trình giải phóng thuốc quinin sulfat từ vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan/quinin sulfat Hoàng Thanh Đức1*, Nguyễn Thị Thu Trang2 Trường Đại học Công nghiệp Hà Nội Viện Kỹ thuật Nhiệt đới, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Ngày nhận 21/1/2019; ngày chuyển phản biện 24/1/2019; ngày nhận phản biện 25/3/2019; ngày chấp nhận đăng 29/3/2019 Tóm tắt: Gần đây, vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan sử dụng làm chất mang thuốc để điều chỉnh tốc độ giải phóng thuốc nhằm tăng hiệu giảm liều dùng thuốc Vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan mang 10-50% thuốc quinin sulfat (QS) chế tạo theo phương pháp vi nhũ nước/dầu/nước để nghiên cứu q trình giải phóng QS Ảnh hưởng hàm lượng QS, độ pH động học q trình giải phóng thuốc QS nghiên cứu Kết cho thấy, với mẫu vật liệu polylactic axit/chitosan mang hàm lượng QS cao tốc độ giải phóng QS chậm Mẫu vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan mang 50% QS có tốc độ giải phóng QS nhỏ Trong môi trường pH=7,4, tốc độ giải phóng QS lớn mơi trường pH=2,0 Q trình giải phóng thuốc QS từ vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan/QS tn theo mơ hình động học Korsmeyer-Peppas khuếch tán theo định luật Fick Từ khóa: chitosan, giải phóng thuốc, polylactic axit, QS, vật liệu tổ hợp Chỉ số phân loại: 3.4 Mở đầu Polylactic axit (PLA) chitosan (CS) hai polyme thiên nhiên ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác [1-3] Tổ hợp PLA/CS sử dụng để làm chất mang thuốc hỗ trợ cho điều trị bệnh ung thư, tăng huyết áp, tim mạch…[4, 5] Nhờ khả tương tác thuốc với hai polyme, tổ hợp polyme PLA/CS có kích thước nano, thuốc giải phóng nhanh giai đoạn đầu có kiểm sốt giai đoạn sau, góp phần tăng hiệu thuốc, giảm liều dùng, giảm số lần sử dụng thuốc ngày Trong nghiên cứu này, chế tạo vật liệu tổ hợp PLA/CS mang thuốc QS, với hàm lượng QS khác từ 10-50% so với PLA theo phương pháp vi nhũ [6, 7] Nghiên cứu giải phóng QS vật liệu tổ hợp để xác định ảnh hưởng hàm lượng QS, ảnh hưởng độ pH xác định động học trình giải phóng thuốc QS Các mẫu vật liệu tổ hợp polylactic axit/chitosan/quinin sulfat (PCQS) với hàm lượng QS từ 10-50% đánh giá tiến trình giải phóng QS dung dịch có pH=2 pH=7 thời gian từ đến 30 Đây môi trường pH đặc trưng cho dung dịch axit mạnh dày (pH=2) dung dịch kiềm yếu ruột non (pH=7,4) thể người Tốc độ giải phóng QS đánh giá thông qua giá trị hàm lượng QS giải phóng khỏi vật liệu Động học trình giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp PCQS xác định thông qua việc khảo sát lựa chọn phù hợp mơ hình động học bậc (ZO), bậc (FO), mơ hình Higuchi (HG), mơ hình Hixson-Crowell (HCW) mơ hình KorsmeyerPeppas (KMP) Nội dung nghiên cứu Vật liệu, hóa chất thiết bị nghiên cứu - Các hóa chất dùng để chế tạo vật liệu tổ hợp PCQS bao gồm: PLA có độ nhớt dL/g, khối lượng phân tử trung bình Mw=260.000 g/mol, độ đa phân tán polyme Mw/ Mn=1,5, dạng hạt; CS có độ axetyl hóa >77%, độ nhớt 1220 cP, Mn=1,61x105 Da; Polyetylen Oxit (PEO) có Mw=100.000 g/mol, nhiệt độ thủy tinh hóa Tg=-67,00C QS hãng Sigma-Aldrich sản xuất - Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FTIR) ghi thiết bị quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier Impact 410 Nicolet Mật độ quang đo thiết bị phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến UV-Vis Tác giả liên hệ: Tel: 0983844815; Email: ducht68@yahoo.com.vn * 61(5) 5.2019 Khoa học Y - Dược Study on the release of quinine sulphate from polylactic acid/chitosan/quinine sulfate composite materials Thanh Duc Hoang1*, Thi Thu Trang Nguyen2 Hanoi University of Industry Institute of Tropical Technology, Vietnam Academy of Science and Technology Recevied 21 January 2019; accepted 29 March 2019 Abstract: Recently, the polylactic acid/chitosan composite has been used as a drug carrier to regulate the drug release aim to increase the effectiveness and decrease the drug dosage Polylactic acid/chitosan composite materials that carry 10-50% quinine sulfate were prepared by the water/ oilwater microemulsion method to study the release of quinine sulfate Effects of quinine sulfate content, pH, and kinetics of quinine sulfate release were investigated The results showed that polylactic acid/chitosan composite materials with higher quinine sulfate content exhibited slower speed release of quinine sulfate The polylactic acid/chitosan composite materials that carry 50% quinine sulphate resulted in the slowest speed of quinine sulfate release In pH=7.4 medium, the release rate of quinine sulfate was greater than the pH=2.0 The process of releasing quinine sulfate from polylactic acid/ chitosan/quinine sulfate composites was in accordance with the Korsmeyer-Peppas kinetic model and diffused according to the Fick law Keywords: chitosan, composite materials, drug release, polylactic acid, QS pH=7,4 - Động học q trình giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp xác định thông qua khảo sát đánh giá phù hợp mơ hình động học: mơ hình bậc (ZO): Wt = Wo + K1.t; mơ hình bậc (FO): logC = logCo - K2.t/2,303; mơ hình Higuchi (HG): W = K3.t1/2; mơ hình Hixson-Crowell (HCW): Wo1/3 - Wt1/3 = K4.t; mơ hình Korsmeyer Peppas (KMP): Mt/M∞ = K5.tn Kết thảo luận Ảnh hưởng hàm lượng QS đến giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp PCQS Các mẫu vật liệu tổ hợp chế tạo với hàm lượng QS từ 10 đến 50% ký hiệu theo thứ tự: PCQS10, PCQS20, PCQS30, PCQS40 PCQS50 Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng QS vật liệu tổ hợp PCQS đến tốc độ giải phóng QS thực hai dung dịch có mơi trường axít pH=2 kiềm yếu pH=7,4 Hàm lượng QS giải phóng khỏi mẫu vật liệu PCQS dung dịch có pH=2 pH=7,4 thể (bảng 1, hình 1) (bảng 2, hình 2) Trong dung dịch pH=2, sau 30 ngâm mẫu hàm lượng QS giải phóng từ vật liệu tổ hợp nhỏ 50% Các mẫu vật liệu mang hàm lượng QS lớn 20% hàm lượng lớn, lượng QS giải phóng nhỏ Mẫu PCQS10 có hàm lượng QS giải phóng sau 30 41,68%, mẫu PCQS20 44,23% (lớn nhất) Các mẫu vật liệu PCQS30, PCQS40 có hàm lượng QS giải phóng nhỏ mẫu PCQS50 có hàm lượng QS giải phóng nhỏ nhất, 33,41% (bảng 1) Bảng Hàm lượng QS giải phóng từ mẫu vật liệu PCQS dung dịch pH=2 Thời gian (giờ) Classification number: 3.4 Phương pháp nghiên cứu - Các mẫu vật liệu tổ hợp PCQS với hàm lượng QS từ 10-50% chế tạo theo phương pháp vi nhũ tương tự tài liệu tham khảo [6-8] Hàm lượng QS giải phóng khỏi vật liệu xác định phương pháp phân tích phổ UV-Vis theo cơng thức: % thuốc giải phóng = Ct/C0x100, đó: C0 Ct lượng mang thuốc lượng thuốc giải phóng thời gian t - Tốc độ giải phóng QS đánh giá thơng qua hàm lượng QS giải phóng dung dịch thử nghiệm theo thời gian Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng mang thuốc QS đến tốc độ giải phóng QS mẫu vật liệu tổ hợp PCQS thực hai môi trường pH=2 61(5) 5.2019 Lượng QS giải phóng (%) PCQS10 PCQS20 PCQS30 PCQS40 PCQS50 22,34 24,46 21,97 22,65 19,97 24,76 25,78 24,12 23,98 20,34 26,83 28,43 25,16 26,76 22,89 29,89 29,78 26,98 27,75 23,68 31,12 30,69 27,56 28,76 24,82 32,95 32,14 29,62 29,98 25,67 33,56 34,54 30,12 31,89 26,71 35,21 36,13 32,56 32,09 28,42 12 38,96 37,89 36,25 33,73 30,05 16 39,34 40,34 36,57 34,78 31,34 20 40,45 42,14 37,29 36,07 32,92 24 41,75 43,58 37,49 36,71 33,15 26 42,09 44,01 38,67 36,92 33,32 28 42,12 44,54 38,34 37,02 33,45 30 41,68 44,23 38,98 37,01 33,41 Khoa học Y - Dược Hình Đồ thị giải phóng QS từ mẫu vật liệu PCQS10, PCQS20, PCQS30, PCQS40 PCQS50 dung dịch pH=2 Trong dung dịch có pH=7,4, tốc độ giải phóng QS mẫu vật liệu PCQS nhanh dung dịch có pH=2 Sau 12 thử nghiệm, hàm lượng QS giải phóng 50% Mẫu PCQS20 có tốc độ giải phóng QS lớn nhất, sau 12 đạt 62,89% Các mẫu có hàm lượng QS lớn có tốc độ giải phóng QS nhỏ Mẫu PCQS50 có tốc độ giải phóng QS chậm nhất, sau 12 50,54% sau 30 54,72% (bảng 2) Bảng Hàm lượng QS giải phóng từ mẫu vật liệu PCQS dung dịch pH= 7,4 Thời gian (giờ) Lượng QS giải phóng (%) PCQS10 PCQS20 PCQS30 PCQS40 PCQS50 32,54 34,76 29,98 26,78 29,09 35,78 37,89 33,56 28,98 30,96 36,52 42,56 35,62 34,78 33,56 39,12 44,21 38,78 36,79 36,78 40,89 45,95 39,78 42,67 38,45 43,89 50,95 45,68 43,63 40,09 47,04 54,49 49,67 44,58 44,68 52,48 57,78 52,43 48,94 48,08 12 61,96 62,89 55,68 53,21 50,54 16 65,34 63,76 57,21 54,89 53,67 20 67,98 64,54 58,97 55,05 54,07 24 69,78 65,21 58,68 56,21 53,89 26 70,72 65,56 59,02 56,11 55,04 28 70,98 65,21 58,97 56,78 54,89 30 70,03 65,78 58,79 55,98 54,72 61(5) 5.2019 Hình Đồ thị giải phóng QS từ mẫu vật liệu PCQS10, PCQS20, PCQS30, PCQS40 PCQS50 dung dịch pH=7,4 Như vậy, hai môi trường pH axit kiềm yếu, hàm lượng QS vật liệu tổ hợp cao tốc độ giải phóng QS chậm Rõ ràng hàm lượng QS vật liệu tổ hợp PCQS có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ giải phóng QS Mẫu vật liệu có hàm lượng QS 20% có tốc độ giải phóng QS lớn Ảnh hưởng pH dung dịch đến giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp PCQS Mẫu vật liệu PCQS20 có tốc độ giải phóng QS nhanh chọn để khảo sát ảnh hưởng pH dung dịch đến giải phóng QS Hai môi trường pH chọn thử nghiệm dung dịch có pH=2 pH=7,4 Kết thu (bảng 3, hình 3) cho thấy, pH dung dịch ảnh hưởng đáng kể đến giải phóng thuốc QS từ vật liệu tổ hợp PCQS20 Sau 30 giờ, hàm lượng QS giải phóng dung dịch pH=7,4 đạt gần 70%, dung dịch pH=2 đạt 44% Rõ ràng, tốc độ giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp PCQS20 dung dịch kiềm yếu (pH= 7,4) lớn dung dịch axit (pH=2) Điều phù hợp cho hấp thụ thuốc tốt ruột non Sự giải phóng thuốc QS 12 đầu xảy với tốc độ nhanh, sau 12 giải phóng thuốc chậm lại ổn định hơn, kiểm sốt tốc độ giải phóng QS sử dụng chất tương hợp POE hay điều chỉnh hàm lượng mang thuốc chế tạo vật liệu tổ hợp PCQS Điều phù hợp với công bố M Prabaharan nghiên cứu vật liệu tổ hợp PLA/CS mang thuốc Lamivudin [5] Khoa học Y - Dược Bảng Hàm lượng QS giải phóng từ mẫu vật liệu PCQS20 dung dịch pH=2 pH = 7,4 Thời gian (giờ) % QS pH=2,0 % QS pH=7,4 24,46 34,76 25,78 37,89 28,43 42,56 29,78 44,21 30,69 45,95 32,14 50,95 34,54 54,49 36,13 57,78 12 37,89 62,89 16 40,34 63,76 20 42,14 64,54 24 43,58 65,21 26 44,01 65,56 28 44,54 65,21 30 44,23 65,78 liệu PCQS dung dịch pH=2 pH=7,4 theo thời gian từ 1-30 tính tốn theo mơ hình động học, cơng cụ xử lý thống kê MS-Excel để phân tích hồi quy xây dựng phương trình động học Từ kết phân tích hồi quy xây dựng phương trình động học xác định động học q trình giải phóng QS mẫu vật liệu tổ hợp PCQS, nhằm tìm chế giải phóng thuốc chất mang thuốc Đồ thị, phương trình động học hệ số hồi quy tương ứng với mơ hình động học q trình giải phóng QS khỏi mẫu vật liệu PCQS20 dung dịch pH=2 thu được thể hình 4-8 Đồ thị, phương trình động học hệ số hồi quy tương ứng với mơ hình động học q trình giải phóng QS khỏi mẫu Hình vật 4.liệu PCQS20 dung dịch pH=2 thu hàm Phương trình động học bậc phản ánh phụ thuộc được thể hình 4-8 lượng QS giải phóng từ vật liệu tổ hợp PCQS20 dung dịch pH=2 theo thời gian , , , Hình Đồ thị giải phóng QS từ vật liệu PCQS20 dung dịch pH=2 pH=7,4 , , , Động học trình giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp PCQS Nghiên cứu động học giải phóng QS từ vật liệu tổ hợp PCQS dung dịch pH=2 pH=7,4 tiến hành dựa vào việc phân tích, đánh giá trình giải phóng QS theo mơ hình động học: bậc 0, bậc một, mơ hình Higuchi, mơ hình Hixson-Crowell mơ hình KorsmeyerHình Phương trình động học bậc phản Peppas , , , Hình Phương trìnhhọcđộng học ánh bậcsự1phụ phản Hình Phương trình động bậc phản thuộc hàm lượng QS giải phóng từ vật liệu tổ hợp PCQS20 ánh phụ thuộc hàm lượng QS giải dung dịch pH=2 theo thời gian ánh phụ thuộc hàm lượng QS giải phóng từ vật liệu t ổ hợp PCQS20 phóng từ vật liệu tổ hợp PCQS20 dung dịch pH= theo thời gian dung dịch pH=2 theo thời gian Các kết hàm lượng QS giải phóng từ mẫu vật 61(5) 5.2019 , , , Khoa học Nông nghiệp Bảng Giá trị TMA-N mẫu tơm thí nghiệm theo thời gian bảo quản Thời gian bảo quản Mẫu ĐC Mẫu CK Mẫu PP Mẫu PP/CK 0,67a±0,04 0,40a±0,03 0,59a±0,02 0,40a±0,04 0,89b±0,05 0,59b±0,03 0,75b±0,02 0,51b±0,04 1,08c±0,02 0,79c±0,01 0,98c±0,05 0,66c±0,01 1,53d±0,02 0,89d±0,02 1,37d±0,04 0,85d±0,02 2,09e±0,01 1,21e±0,02 1,63e±0,04 1,21e±0,03 3,34f±0,01 1,66f±0,05 2,48f±0,01 1,43f±0,06 5,15g±0,04 2,24g±0,05 3,27g±0,01 1,90g±0,07 7,36h±0,07 3,02h±0,06 4,94h±0,04 2,39h±0,02 9,14i±0,04 3,97i±0,07 5,83i±0,03 3,28i±0,04 10 10,48k±0,01 4,42k±0,03 7,19k±0,02 4,22k±0,01 11 6,01l±0,05 9,21l±0,07 5,41l±0,02 12 7,24m ±0,01 11,41m±0,01 7,02m±0,03 13 10,13n±0,05 9,57n±0,05 14 12,24o±0,01 11,88o±0,05 y = 0,28x + 0,35 R² = 0,957 Phương trình hồi quy x: đến tuyến tính y: TMA y = 1,76x – 6.93 x: ngày R² = 0,994 x: đến 10 y = 0,24x + 0,10 R² = 0,948 x: đến y = 0,27x + 0,25 R² = 0,980 x: đến y = 0,21x + 0,10 R² = 0,964 x: đến y = 1,39x – 8,46 R² = 0,936 x: đến 14 y = 1.46x – 6.82 R² = 0,977 x: đến 12 y = 1,41x – 9,06 R² = 0,940 x: đến 14 Kết nghiên cứu cho thấy, giá trị TMA-N ngày 0,67 mg/100 g; 0,4 mg/100 g; 0,59 mg/100 g 0,4 mg/100 g, tương ứng với mẫu ĐC, CK, PP PP/ CK Tương tự biến đổi TVB-N, giá trị TMA-N thay đổi chậm giai đoạn đầu nhanh giai đoạn sau Tuy nhiên khoảng thời gian mẫu hoàn toàn khác nhau, nguyên nhân ảnh hưởng việc xử lý bảo quản mẫu Khoảng thời gian giai đoạn chậm từ ngày đến ngày với mẫu ĐC, đến ngày với mẫu CK, đến ngày với mẫu PP đến ngày với mẫu PP/CK Tại thời điểm giá trị TMA-N 1,53 mg/100 g; 1,66 mg/100 g; 1,63 mg/100 g 1,43 mg/100 g, tương ứng cho mẫu ĐC, CK, PP PP/CK Theo thông báo Bonnell [32], cá tuyết (cod) chất lượng tươi có TMA-N thấp 1,5 mg/ 100 g Giá trị tương đồng với đánh giá Le, et al (2017) tôm sú, chất lượng tôm đạt loại tốt có giá trị TMA-N thấp 1,51 mg/100 g [18] TMA-N mẫu khảo sát có giá trị gần 1,5 mg/100 g thời điểm 61(5) 5.2019 cuối giai đoạn (1,86 mg/100 g; 1,66 mg/100 g; 1,63 mg/100 g; 1,43 mg/100 g), trước vào giai đoạn phân hủy Tại thời điểm xem giới hạn hạn sử dụng, giá trị TMA-N mẫu đạt sau: 7,36 mg/100 g; 7,24 mg/100 g; 7,19 mg/100 g 7,02 mg/100 g, tương ứng với mẫu ĐC, CK, PP PP/CK Phương trình hồi quy tuyến tính TVB-N, TMA-N hạn sử dụng mẫu khảo sát Các giá trị số nhìn chung tăng theo thời gian bảo quản Hạn sử dụng mẫu khảo sát đánh giá dựa kết TVC Các số TVB-N TMA-N tăng theo thời gian bảo quản Vì vậy, giá trị chúng có tương quan tuyến tính với Tuy nhiên, phương trình hồi quy tuyến tính thể giai đoạn khác bàn luận trên, có khác biệt khoảng thời gian mẫu Đánh giá cảm quan theo phương pháp QIM cho kết điểm chất lượng tôm sú biến đổi tuyến tính theo ngày bảo quản Các phương trình hổi quy tuyến tính chứng minh điều Sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính ước tính hạn dụng cịn lại cho mẫu khảo sát Bằng cách tiến hành đánh giá chất lượng tơm QIM để có điểm QI mơ tả bảng Tiếp theo, điểm QI thay vào phương trình hồi quy tương ứng để xác định ngày bảo quản So sánh số ngày bảo quản với hạn sử dụng suy hạn bảo quản lại Bảng mô tả bàn luận đề cập Bảng Phương trình hồi quy tuyến tính TVB-N, TMA-N, hạn sử dụng, phương trình hồi quy tuyến tính QI ngày bảo quản mẫu khảo sát Mẫu ĐC Mẫu CK Mẫu PP Mẫu CK/PP Giai đoạn biến đổi chậm TVB = 5,71TMA + 2,73 R² = 0,996 Từ ngày đến ngày TVB = 4,50TMA TVB = 4,44TMA + 3,84 + 2,50 R² = 0,924 Từ ngày đến ngày R² = 0,933 Từ ngày đến ngày TVB = 4,63TMA + 2,58 R² = 0,985 Từ ngày đến ngày Giai đoạn biến đổi nhanh TVB = 2,55TMA + 9,39 R² = 0,980 Từ ngày đến ngày 10 TVB = 2,46TMA + 7,32 R² = 0,980 Từ ngày đến ngày 14 TVB = 2,51TMA + 9,09 R² = 0,994 Từ ngày đến ngày 12 TVB-N = 2,41TMA + 8,30 R² = 0,979 Từ ngày đến ngày 14 Hạn sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính QI ngày bảo quản HSD: ngày y = 1,74x + 0,3778 R² = 0,9928 52 HSD: 12 ngày y = 1,03x – 1,2198 R² = 0,9876 HSD: 10 ngày y = 1,19x – 0,2446 R² = 0,9973 HSD: 12 ngày y = 0,90x – 0,5181 R² = 0,996 Khoa học Nông nghiệp Kết luận Springer Science & Business Media Sự biến đổi chất lượng tôm sú sau thu hoạch xử lý kỹ thuật bảo quản khác tiến hành nghiên cứu Các yếu tố cảm quan, hóa sinh vi sinh sử dụng nghiên cứu chứng minh hiệu chúng Các số chất lượng sử dụng vào tiến trình đánh giá phát huy lực, phản ánh biến đổi chất lượng suốt trình bảo quản Các số chất lượng hóa học TVB-N, TMA-N có tương quan tuyến tính với thời gian bảo quản theo hai giai đoạn khác nhau, tương ứng với giai đoạn tự phân phân hủy Tại thời điểm đánh giá hạn sử dụng TVB-N = 26,17; 27,49; 28,05 27,19 mg/100g tương ứng với mẫu ĐC, CK, PP PP/ CK Tương tự, giá trị TMA-N thời điểm 7,36; 7,24; 7,19; 7,02 tương ứng cho cho mẫu khảo sát Phương trình hồi quy tuyến tính TVB-N TMA-N xây dựng cho mẫu khảo sát theo hai giai đoạn khác Đây điểm nghiên cứu Đặc biệt, phương pháp QIM thể hiệu đánh giá cảm quan Giá trị QI cho ước tính hạn sử dụng cịn lại tơm Giá trị QI thời điểm giới hạn có khác biệt mẫu Cụ thể QI = 14,33; 11,37; 11,58; 10,40 tương ứng với mẫu ĐC, CK, PP, PP/CK Tôm bảo quản điều kiện chân không kết hợp với xử lý qua dung dịch polyphenol có khả ức chế tiến trình tạo đốm đen, tăng giá trị mặt cảm quan, tăng giá trị kinh tế Kỹ thuật bảo quản chân khơng có hạn sử dụng 12 ngày so với bảo quản thông thường ngày [6] H.H Huss (1995), Quality and quality changes in fresh fish, FAO fisheries technical paper TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] N.A Ashie, J.P Smith, B.K Simpson, N.F Haard (1996), Spoilage and shelflife extension of fresh fish and shellfish”, Critical Reviews in Food Science & Nutrition, 36(1-2), pp.87-121 “ [2] V.K Reddy, P.A Shinde, F.R Sofi, P.S Shelar, & S.B Patange (2014), “Effect of antimelanotic treatment and vacuum packaging on melanosis and quality condition of ice stored farmed tiger shrimp (penaeus monodon)”, SAARC Journal of Agriculture, 11(2), pp.33-47 [3] C.O.R Okpala, W.S Choo, and G.A Dykes (2014), “Quality and shelf life assessment of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) freshly harvested and stored on ice”, LWT-Food Science and Technology, 55(1), pp.110-116 [4] R.K Kalleda, Y.L Han, J.E Toler, F Chen, H.J Kim, & P.L Dawson (2013), “Shelf life extension of shrimp (white) using modified atmosphere packaging”, Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 63(2), pp.87-94 [5] G.W Gould (2012), New methods of food preservation, 61(5) 5.2019 [7] P Howgate (2010), “A critical review of total volatile bases and trimethylamine as indices of freshness of fish Part Formation of the bases, and application in quality assurance”, Electronic Journal of Environmental, Agricultural & Food Chemistry, 9(1), pp.58-83 [8] G Hyldig & D.M Green-Petersen (2004), “Quality Index Method-An objective tool for determination of sensory quality”, Journal of Aquatic Food Product Technology, 13(4), pp.71-80 [9] E Martinsdóttir, R Schelvis, G Hyldig, & K Sveinsdóttir (2009), “Sensory evaluation of seafood: methods Fishery ProductsQuality, Safety and Authenticity”, Wiley-Blackwell, pp.425-443 [10] R.S Singhal, P Kulkarni & D Reg (1997), Handbook of indices of food quality and authenticity, Elsevier [11] D.F Maffei, N.F de Arruda Silveira, & M.d.P.L.M Catanozi (2013) “Microbiological quality of organic and conventional vegetables sold in Brazil”, Food Control, 29(1), pp.226-230 [12] R.P Naik, B.B Nayak, M.K Chouksey, T.K Anupama, T.L.S.S Moses, & V Kumar (2014), “Microbiological and biochemical changes during ice storage of farmed black tiger shrimp (Peneaus monodon)”, Bionano Frontier, 7(2), pp.249-253 [13] TCVN 3726-89: Tôm nguyên liệu tươi - Fresh shrimps for food processing [14] A.A Gonỗalves and A.R.M de Oliveira (2016), “Melanosis in crustaceans: A review”, LWT-Food Science and Technology, 65, pp.791-799 [15] R Kossah, C Nsabimana, H Zhang, & W Chen (2010), Optimization of extraction of polyphenols from Syrian Sumac”, Research Journal of Phytochemistry, 4(3), pp.146-153 “ [16] K.L Sallam (2007), “Chemical, sensory and shelf life evaluation of sliced salmon treated with salts of organic acids”, Food Chemistry, 101(2), pp.592-600 [17] M.J Leboffe, B.E Pierce (2012), Microbiology: laboratory theory and application, Morton Publishing Company [18] N.T Le, N.K Doan, B.T Nguyen, T.V.T Tran (2017), Towards improved quality benchmarking and shelf life evaluation of black tiger shrimp (Penaeus monodon)” Food Chemistry, 235, pp.220-226 “ [19] B Jinadasa (2014), “Determination of quality of marine fishes based on total volatile base nitrogen test (TVB-N)”, Nature and Science, 5(12), pp.106-111 [20] J Hungerford (1998), “AOAC Official Method 971.14 Trimethylamine Nitrogen in Seafood Colorimetric Method Fish and Other Marine Products”, Official Methods of Analysis of AOAC International, 7, pp.421-434 [21] ISO 14502:2005: Determination of substances characteristic of green and black tea Part 1: Content of total polyphenols in tea 53 Khoa học Nông nghiệp Colorimetric method using Folin-Ciocalteu reagent [22] G.J.E Nychas, D.L.Marshall, J.N Sofos (2007), Meat, poultry, and seafood, ASM Press, pp.105-140 [23] A.C Rohani, M Faridah, O.A Shokri (2008), “The effects of modified atmosphere packaging on chemical, sensory and microbiological changes in black tiger prawn (Penaeus monodon)”, J Trop Agric and Fd Sc., 36(2), pp.211-219 [24] N.P Nirmal, & S Benjakul (2009), “Effect of ferulic acid on inhibition of polyphenoloxidase and quality changes of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during iced storage”, Food Chemistry, 116(1), pp.323-331 [25] V.T Pardio, K.N Waliszewski, & P Zuñiga (2011), Biochemical, microbiological and sensory changes in shrimp (Panaeus aztecus) dipped in different solutions using face centred central composite design”, International Journal of Food Science & Technology, 46(2), pp.305-314 “ [26] J Huang, Q Chen, M Qiu, & S Li (2012), “Chitosan based edible coatings for quality preservation of postharvest whiteleg shrimp (Litopenaeus vannamei)”, Journal of Food Science, 77(4), pp.C491-C496 61(5) 5.2019 [27] H Mu, H Chen, X Fang, J Mao, H Gao (2012), “Effect of cinnamaldehyde on melanosis and spoilage of Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) during storage”, Journal of the Science of Food and Agriculture, 92(10), pp.2177-2182 [28] R Rosa, L Nunes (2004), “Nutritional quality of red shrimp, Aristeus antennatus (Risso), pink shrimp, Parapenaeus longirostris (Lucas), and Norway lobster, Nephrops norvegicus (Linnaeus)”, Journal of the Science of Food and Agriculture, 84(1), pp.89-94 [29] L Srikar, H Seshadari, A Fazal (1989), “Changes in lipids and proteins of marine catfish (Tachysurus dussumieri) during frozen storage”, International Journal of Food Science & Technology, 24(6), pp.653-658 [30] L.M Nollet, F Toldrá (2009), Handbook of seafood and seafood products analysis, CRC Press [31] B.Q Phillippy (1985), Characterization of the in situ tmaoase system of red hake muscle, Ph.D thesis, University of Massachusetts, Amherst [32] A.D Bonnell (2012), Quality assurance in seafood processing: a practical guide, Springer Science & Business Media 54 Khoa học Nông nghiệp Đánh giá khả chịu hạn số tiêu sinh hóa dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A điều kiện hạn nhân tạo giai đoạn Đồn Thị Bích Thảo1, Nguyễn Xn Thắng1*, Lê Tuấn Anh1, Lê Công Tùng1, Nguyễn Thị Thu Hồi1, Lê Cơng Lực1, Nơng Văn Hải2, Bùi Mạnh Cường1 Viện Nghiên cứu ngô, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Ngày nhận 12/2/2019; ngày chuyển phản biện 18/2/2019; ngày nhận phản biện 20/3/2019; ngày chấp nhận đăng 8/4/2019 Tóm tắt: Nhóm yếu tố phiên mã DREB (Dehydration Responsive Element Binding) liên quan chặt chẽ đến chế phản ứng thực vật điều kiện bất thuận hạn Trong nghiên cứu này, dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A đánh giá khả chịu hạn số tiêu sinh hóa giai đoạn Trong điều kiện gây hạn nhân tạo, dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A có tỷ lệ sống cao khoảng 2,5 lần so với dịng khơng chuyển gen Hình thái dịng mang gen ZmDREB2A có biểu chịu hạn tốt so với dịng nền, chiều dài rễ dòng chuyển gen lớn 21-28% so với dòng Khi gặp hạn, dòng chuyển gen ZmDREB2A trì hàm lượng chlorophyll (Chl) cao 10% so với dịng nền, đồng thời tích lũy lượng chất điều hòa thẩm thấu proline tăng 2,5-4,5 lần, carbohydrate không cấu trúc (Non Structural Carbohydrate - NSC) nhiều 28-35% so với dịng Từ khóa: ngô, chịu hạn, chuyển gen, proline, ZmDREB2A Chỉ số phân loại: 4.6 Đặt vấn đề Thực vật phải đối mặt với nhiều yếu tố bất thuận có điều kiện mơi trường hạn, mặn, nóng Các yếu tố bất thuận ảnh hưởng tới khoảng 10% diện tích đất trồng dẫn tới sụt giảm 50% sản lượng trung bình trồng giới, có ngơ [1] Tình hình hạn hán đã, tiếp tục diễn nghiêm trọng, khiến cho việc nghiên cứu nâng cao khả chịu hạn trồng nói chung ngơ nói riêng ngày cấp thiết Cơ chế đáp ứng với yếu tố bất thuận thực vật liên quan đến nhóm gen mã hóa yếu tố phiên mã Trong đó, DREB nhóm yếu tố phiên mã quan trọng, đóng vai trị chủ đạo đáp ứng với nhiều yếu tố bất thuận khác Thơng qua yếu tố DREB có tác động cis vùng bám ADN AP2/ERF, yếu tố phiên mã DREB giúp tăng cường khả chống chịu trồng điều kiện hạn, mặn, nóng [2] Gen ZmDREB2A mã hóa cho nhân tố phiên mã nhóm DREB ngô tăng cường biểu ngô gặp điều kiện hạn, mặn, nóng lạnh Nghiên cứu chuyển gen ZmDREB2A vào mơ hình Arabidopsis thaliana cho thấy, gen đóng vai trị điều hịa biểu gen liên quan đến điều kiện hạn nóng, làm tăng cường biểu gen mã hóa protein LEA, gen liên quan đến sốc nhiệt giải độc tế bào [3] Chuyển gen thuộc nhóm DREB giúp tăng khả chống chịu điều kiện bất thuận trồng khác thuốc [4], lúa [5] lúa mì [6] Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá khả chịu hạn số tiêu sinh hóa dịng ngô chuyển gen ZmDREB2A giai đoạn Kết nghiên cứu sở để sàng lọc lựa chọn nguồn vật liệu phục vụ cho công tác chọn tạo giống ngơ lai có khả chịu hạn Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A dòng tương ứng (bảng 1) Bảng Danh sách dịng ngơ tham gia thí nghiệm TT Tên dịng Ghi K3 Dịng khơng chuyển gen K3-CG Dòng chuyển gen ZmDREB2A K7 Dịng khơng chuyển gen K7-CG Dịng chuyển gen ZmDREB2A Tác giả liên hệ: Email: nxthang@gmail.com * 61(5) 5.2019 55 Khoa học Nông nghiệp Evaluation of biochemical parameters and drought resistance in ZmDREB2A transgenic maize at the seedling stage Thi Bich Thao Doan1, Xuan Thang Nguyen1*, Tuan Anh Le1, Cong Tung Le1, Thi Thu Hoai Nguyen1, Cong Luc Le1, Van Hai Nong2, Manh Cuong Bui1 National Maize Research Institute Institute of Genome Research Received 12 February 2019; accepted April 2019 Abstract: DREB transcription factor group is related to responses of plants to abiotic stresses including drought In this study, the ZmDREB2A transgenic maize lines at the seedling stage were evaluated for drought resistance and biochemical characteristics The survival rate of ZmDREB2A lines were 2.5 times higher than wildtype plants in artificial drought tests Morphological characteristics also showed the root length of ZmDREB2A lines were 21-28% higher than that of control groups, which indicates ZmDREB2A lines could suffer drought better Moreover, the chlorophyll concentration of ZmDREB2A lines was 10% higher than the wildtype in drought condition Other parameters such as proline and nonstructural carbohydrate accumulation of the transgenic lines were higher as compared to control groups Keywords: drought resistance, maize, proline, transgenic, ZmDREB2A Classification number: 4.6 giá tỷ lệ sống, khả hồi phục sau hạn Xác định hàm lượng Chl: hàm lượng Chl xác định theo phương pháp Porra (2006) [8] Mô (10 mg) đưa vào ống eppendorf Bổ sung 20 µl aceton 80%, nghiền chày nhựa, sau thêm aceton 80% để đạt thể tích 1,5 ml Ly tâm 2.000 vòng/phút phút, thu ml dịch Đo quang phổ hấp thụ bước sóng 646 664 nm Hàm lượng Chl tính theo cơng thc: Chl a (àg/mg) = [12,7 ì (A 664) 2,69 × (A 646)] × hệ số pha lỗng Chl b (àg/mg) = [22,9 ì (A 646) 4,68 ì (A 664)] × hệ số pha lỗng Xác định hàm lượng proline: hàm lượng proline xác định phương pháp so màu [9] Mô (50 mg) nghiền nitơ lỏng, bỏ vào ống eppendorf ml Bổ sung 1,5 ml acid sulfosalicylic 3% (w/v), lắc đều, sau ly tâm 7.000 vịng/phút 20 phút Thu 300 µl dịch nổi, bổ sung 600 µl axit sulfosalicylic 3% Thực phản ứng màu cách lấy 200 µl dịch cho vào ống eppendorf, bổ sung 200 µl axit axetic 200 µl dung dịch ninhydrin (0,1 g ninhydrin + 2,4 ml axit axetic + 1,6 ml acid phosphoric 6M), ủ phản ứng 100oC giờ, sau dừng phản ứng Bổ sung 400 µl toluence vào hỗn hợp phản ứng, lắc đều, thu 200 µl dịch Tiếp tục bổ sung 800 µl toluence đo quang phổ bước sóng 520 nm Xây dựng đường chuẩn để tính hàm lượng proline Xác định hàm lượng NSC: hàm lượng NSC xác định theo phương pháp Ohnishi Horie (1999) [10] Mẫu (0,5 g) nghiền nhỏ, cho vào ống falcon 50 ml, thêm 30 ml nước cất đun 100oC 60 phút Sau ống nguội, bổ sung 20 ml Sodium phosphate-phosphoric acid buffer (pH 7,4) Lắc 200 vòng/phút, nhiệt độ 40oC 24h Lọc mẫu giấy lọc làm khô phần cặn thu 135oC 4h Cân lượng mẫu cịn lại tính hàm lượng NSC theo công thức: NSC (%) = (Khối lượng mẫu/Khối lượng mẫu sau sấy)/ Khối lượng mẫu x 100 Phương pháp nghiên cứu Gây hạn nhân tạo giai đoạn con: thí nghiệm gây hạn nhân tạo tiến hành giai đoạn nhà lưới theo phương pháp Camacho Caraballo (1994) [7] Hạt ngô gieo xô chứa giá thể xỉ than đất tưới nước bão hòa Tỉa bỏ không đồng đều, giữ lại cây/xô, bên trái dịng ngơ khơng mang gen ZmDREB2A (dịng nền), bên phải dịng ngơ mang gen ZmDREB2A Tiến hành không tưới nước liên tục 15 ngày có 5-7 nhằm gây hạn, đánh giá biểu điều kiện hạn Sau tưới nước trở lại ngày đánh 61(5) 5.2019 Xử lý số liệu: số liệu xử lý chương trình IRRISTAT 5.0 Microsoft Excel 2013 Kết thảo luận Hình thái khả phục hồi dịng ngơ mang gen ZmDREB2A điều kiện hạn Giai đoạn trước xử lý hạn nhân tạo, dịng ngơ phát triển bình thường (hình 1A 2A) Đến giai đoạn gây hạn, dịng ngơ thí nghiệm có biểu cuộn mức độ khác nhau, sinh trưởng chậm lại so với đối chứng tưới nước đầy đủ (hình 1B 2B) Sau 15 ngày gây hạn, ngô bị hạn xuất chết khô tầng đỉnh 56 Khoa học Nông nghiệp A: chưa xử lý hạn B: xử lý hạn C: sau phục hồi Hình Hình thái dịng ngơ K3 chuyển gen dòng giai đoạn gây hạn Ghi chú: bên trái: dòng chuyển gen; bên phải: dịng nền; cơng thức 1: tưới nước đầy đủ (CT1); công thức 2: gây hạn phục hồi (CT2); K3: dòng nền; K3-CG: dòng K3 mang gen ZmDREB2A A: chưa xử lý hạn B: xử lý hạn Hình Hình thái dịng ngơ K7 chuyển gen dịng giai đoạn gây hạn Kết thúc giai đoạn gây hạn tưới nước trở lại, dịng ngơ K3-CG K7-CG mang gen ZmDREB2A có biểu phục hồi sinh trưởng nhanh dòng nền, thể qua hình thái tỷ lệ sống cao (hình 1C 2C) Tỷ lệ sống K3-CG có gen ZmDREB2A (66,6%) cao gấp 2,5 lần so với dòng K3 (26,6%) Các K7-CG mang gen ZmDREB2A có tỷ lệ sống cao 2,6 lần so với dòng (hình 3) C: sau phục hồi khác biệt mang ý nghĩa thống kê dòng K3 K3-CG dòng K7 K7-CG Ở điều kiện hạn nhân tạo, dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A có chiều dài, khối lượng thân rễ, thể tích rễ cao so với dòng (bảng 2) Trong đó, khả phát triển rễ điều kiện hạn đặc điểm quan trọng giúp thực vật chống chịu stress hạn Do đó, tiêu chí quan trọng chọn giống chịu hạn Ở điều kiện hạn, chiều dài rễ dòng K3CG giảm 11,21% so với khơng gây hạn, cịn dịng (K3) giảm đến 30,69% Tương tự, dịng K7-CG gặp hạn có chiều dài rễ giảm 9,92% so với khơng gây hạn Dịng tương ứng (K7) có tỷ lệ giảm chiều dài rễ lên tới 25,74% Qua kết Bảng Đặc điểm thân rễ tươi dịng ngơ mang gen ZmDREB2A dòng điều kiện hạn nhân tạo Chiều dài thân (cm) Dịng Hình Tỷ lệ sống dịng ngơ K3, K7 - mang gen ZmDREB2A dòng tương ứng sau kết thúc giai đoạn hạn tưới phục hồi Đặc điểm thân rễ dòng ngô mang gen ZmDREB2A điều kiện hạn Trong điều kiện tưới nước đủ, ngô nguồn sinh trưởng, phát triển đồng thân rễ, khơng có 61(5) 5.2019 K3 Tỷ lệ giảm Khơng so với Không Hạn Hạn hạn không hạn hạn (%) 51,7 72,8 K3-CG 53,5 71,5 K7 56,7 77,8 K7-CG 60,2 76,8 CV% 4,2 LSD0,05 57 Chiều dài rễ (cm) 1,99 Khối lượng thân tươi (g) Tỷ lệ giảm so với Không Hạn khơng hạn hạn (%) 0,92 Thể tích rễ (ml) Tỷ lệ giảm so với Không Hạn không hạn hạn (%) Tỷ lệ giảm so với Không Hạn không hạn hạn (%) Tỷ lệ giảm so với không hạn (%) 66,55 0,32 1,94 83,51 1,01 4,52 77,65 3,84 10,76 64,31 0,84 1,94 3,06 11,97 74,44 0,34 1,96 4,16 10,96 62,04 0,89 1,96 2,8 2,2 56,70 1,91 4,53 82,65 1,13 4,64 54,59 2,09 4,65 0,9 57,84 75,65 55,05 28,98 16,08 23,20 30,69 3,97 11,87 25,17 20,60 23,20 11,21 27,12 19,50 26,26 25,74 21,61 23,60 26,20 9,92 5,7 Khối lượng rễ tươi (g) 0,168 0,02 0,013 Khoa học Nông nghiệp bảng cho thấy, tất tiêu đánh giá (chiều dài thân lá, chiều dài rễ, khối lượng rễ tươi, thể tích rễ tươi) dịng có tỷ lệ gây hạn khơng gây hạn cao dòng chuyển gen tương ứng, điều chứng tỏ dịng chuyển gen có khả sinh trưởng phát triển dòng điều kiện hạn Đánh giá đặc điểm hình thái hai dịng ngơ mang gen ZmDREB2A cho thấy, dịng K7-CG có khả sinh trưởng, phát triển chịu hạn cao dòng K3-CG Ở điều kiện hạn, dòng K7-CG có chiều dài rễ lớn dịng ngơ thí nghiệm (23,6 cm), cao 14,5% so với dịng K3-CG Bên cạnh đó, chiều dài thân dòng K7-CG (60,2 cm) lớn 12,5% so với chiều dài thân dòng K3-CG (53,5 cm) Khả tích lũy sinh khối chuyển gen ZmDREB2A cao so với không chuyển gen, thể qua khối lượng thân rễ khô (bảng 3) Ở điều kiện hạn nhân tạo, dòng K3-CG K7-CG có tổng sinh khối khơ cao so với dịng tương ứng 2,48 2,2 lần Các dịng ngơ K3, K7 có tỷ lệ giảm mạnh khối lượng thân khô (87,15-89,5%), rễ khô (83,33-76,27%), dòng chuyển gen tương ứng tỷ lệ thấp rõ rệt Bảng Khối lượng thân, rễ khô, tổng sinh khối khơ dịng ngơ mang gen ZmDREB2A dòng điều kiện hạn nhân tạo Khối lượng thân khô (g) Khối lượng rễ khô (g) Tổng sinh khối khô (g) Hạn Không hạn Tỷ lệ giảm so với không hạn (%) Hạn Không hạn Tỷ lệ giảm so với không hạn (%) Hạn Không hạn Tỷ lệ giảm so với không hạn (%) K3 0,59 5,62 89,50 0,09 0,54 83,33 0,68 6,16 88,96 K3-CG 1,53 5,63 72,82 0,16 0,55 70,91 1,69 6,18 72,65 K7 0,74 5,76 87,15 0,14 0,59 76,27 0,88 6,35 86,14 K7-CG 1,72 5,77 70,19 0,22 0,6 63,33 1,94 6,37 69,54 CV% 0,8 4,7 LSD0,05 0,019 0,012 0,028 Dòng Đánh giá số tiêu sinh hóa dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A điều kiện hạn nhân tạo Hàm lượng Chl dịng ngơ điều kiện hạn giảm mạnh so với điều kiện bình thường (hình 4) Khi tưới đủ nước, hàm lượng Chl a khơng có khác biệt mang ý nghĩa thống kê chuyển gen ZmDREB2A không chuyển gen Hàm lượng Chl a dịng ngơ nằm khoảng 27-30 μg/mg điều kiện bình thường Trường hợp gặp stress hạn, hàm lượng Chl a dòng K3, K3-CG đạt 11,6 14,4 μg/mg, tương ứng với mức giảm 58 48% so với điều kiện khơng hạn Dịng K7, K7-CG có hàm lượng Chl a 14,6 18,3 μg/mg, tương ứng giảm 51 40% so với điều kiện tưới đầy đủ 61(5) 5.2019 Hình Hàm lượng Chl a b dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A dịng Với vai trị nhóm sắc tố phụ, hàm lượng Chl b thấp so với Chl a Hàm lượng Chl b dòng chuyển gen dòng tương đương tưới đầy đủ Dưới điều kiện hạn, hàm lượng Chl b mẫu K3 K3-CG giảm xuống 2,1 2,6 μg/mg, K7 K7-CG 2,78 3,09 μg/mg Tác động hạn làm giảm mạnh hàm lượng Chl khơng ngơ mà cịn nhiều loài khác [11, 12] Tuy nhiên, chuyển gen ZmDREB2A (K3-CG, K7-CG) trì hàm lượng Chl a b cao so với không chuyển gen khoảng 10% Một chế liên quan đến khả chịu hạn trồng tích lũy chất hịa tan proline Proline axit amin giúp điều hòa áp suất thẩm thấu tế bào, tăng cường tích lũy thực vật gặp điều kiện bất thuận hạn [13] Hàm lượng proline tự dịng ngơ đạt mức μg/mg điều kiện bình thường tăng mạnh điều kiện hạn (hình 5) Dưới tác động hạn, hàm lượng proline tự dịng ngơ K3, K3-CG tăng 2,5 lần lần so với điều kiện bình thường, đạt mức 0,49 0,81 μg/mg Dịng K7 K7-CG gặp hạn có hàm lượng proline 0,71 0,92 μg/mg, tương ứng gấp 3,55 4,5 lần so với điều kiện không hạn Sự gia tăng hàm lượng proline tự đáp ứng với điều kiện hạn xảy chuyển gen khơng chuyển gen So sánh dịng thí nghiệm, dòng chuyển gen ZmDREB2A tổng hợp lượng proline tự nhiều so với dòng 58 Khoa học Nơng nghiệp hình thái sinh hóa liên quan đến khả chịu hạn dòng chuyển gen (K3-CG, K7-CG) biểu tốt dòng (K3, K7) Do đó, nguồn vật liệu tiềm cho công tác chọn tạo giống ngô chịu hạn Đề nghị tiếp tục đánh giá khả chịu hạn dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A giai đoạn sinh trưởng khác (trước sau trỗ) TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình Hàm lượng proline dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A dòng Kết tương đồng với nghiên cứu giới hạn ngô Jain cs (2010) [14] sử dụng sorbitol để gây hạn nhân tạo in vitro, cho thấy tương quan tuyến tính nồng độ sorbitol mơi trường hàm lượng proline ngô Nghiên cứu Efeoğlu cs (2009) [15] giống ngô Doge, Luce, Vero cho thấy, hàm lượng proline tăng lên đáng kể gây hạn nhân tạo cách không tưới nước 12 ngày [1] E.A Bray, J Bailey-Serres, E Weretilnyk (2000), Responses to abiotic stresses, in Biochemistry and molecular biology of plants, American Society of Plant Biologists [2] C Lata, M Prasad (2011), “Role of DREBs in regulation of abiotic stress responses in plants”, Journal of Experimental Botany, 62(14), pp.47314748 [3] F Qin, et al (2007), “Regulation and functional analysis of ZmDREB2A in response to drought and heat stresses in Zea mays L.”, The Plant Journal, 50(1), pp.54-69 [4] M Kasuga, et al (2004), “A combination of the Arabidopsis DREB1A gene and stress-inducible rd29A promoter improved drought- and low-temperature stress tolerance in tobacco by gene transfer”, Plant and Cell Physiology, 45(3), pp.346-350 [5] S.J Oh, et al (2005), “Arabidopsis CBF3/DREB1A and ABF3 in transgenic rice increased tolerance to abiotic stress without stunting growth”, Plant Physiology, 138(1), pp.341-351 [6] Y.G Shen, et al (2003), “An EREBP/AP2-type protein in Triticum aestivum was a DRE-binding transcription factor induced by cold, dehydration and ABA stress”, Theoretical and Applied Genetics, 106(5), pp.923-930 Hình Hàm lượng NSC dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A dòng Bên cạnh proline, hàm lượng dạng NSC thường gia tăng thực vật gặp stress hạn, với vai trò điều hòa áp suất thẩm thấu Ở điều kiện tưới nước đầy đủ, hàm lượng NSC dòng chuyển gen ZmDREB2A dòng tương đương Khi gặp hạn, dịng K3-CG có hàm lượng NSC đạt 6,76 μg/mg, cao 28% so với dòng K3 (5,27 μg/mg) Hàm lượng NSC điều kiện hạn dòng K7CG 7,55 μg/mg, cao 35% so với dịng K7 (5,6 μg/ mg) (hình 6) Như vậy, gặp stress hạn, dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A (K3-CG, K7-CG) có hàm lượng Chl, proline NSC cao dòng (K3, K7) Giữa hai dòng chuyển gen, số dòng K7-CG cao so với dịng K3CG Kết phân tích sinh hóa phù hợp với đánh giá đặc điểm hình thái dịng ngơ tham gia thí nghiệm Kết luận Nghiên cứu đánh giá khả chịu hạn dịng ngơ K3-CG, K7-CG mang gen ZmDREB2A dòng tương ứng (K3, K7) giai đoạn Kết cho thấy, dịng ngơ chuyển gen ZmDREB2A có tỷ lệ sống cao khoảng 2,5 lần so với dòng Các đặc điểm 61(5) 5.2019 [7] R.G Camacho, D.F Caraballo (1994), “Evaluation of morphological characteristics in Venezuelan maize (Zea mays L.) genotypes under drought stress”, Scientia Agricola, 51(3), pp.453-458 [8] R.J Porra (2006), “Spectrometric assays for plant, algal and bacterial chlorophyll”, Advances in Photosynthesis and Respiration, 25, pp.95-107 [9] L Bates, R Waldren, I Teare (1973), “Rapid determination of free proline for water-stress studies”, Plant and Soil, 39(1), pp.205-207 [10] M Ohnishi, T Horie (1999), “A proxy analysis on nonstructural carbohydrate in rice [Oryza sativa] plant by using the gravimetric method”, Japanese Journal of Crop Science (Japan) [11] A Mafakheri, et al (2010), “Effect of drought stress on yield, proline and chlorophyll contents in three chickpea cultivars”, Australian Journal of Crop Science, 4(8), pp.580-585 [12] P Manivannan, et al (2007), “Growth, biochemical modifications and proline metabolism in Helianthus annuus L as induced by drought stress”, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 59(2), pp.141-149 [13] M.M.F Mansour (2000), “Nitrogen containing compounds and adaptation of plants to salinity stress”, Biologia Plantarum, 43(4), pp.491500 [14] M Jain, S Tiwary, R Gadre (2010), “Sorbitol-induced changes in various growth and biochemical parameters in maizel”, Plant Soil Enviroment, 56, pp.263-267 [15] B Efeoğlu, et al (2009), “Physiological responses of three maize cultivars to drought stress and recovery”, South African Journal of Botany, 75(1), pp.34-42 59 Khoa học Nông nghiệp Đặc điểm di truyền trình tự lồi lan Hài hồng Paphiopedilum delenatii đặc hữu Việt Nam Vũ Thị Huyền Trang1, 2, Trần Anh Khoa1, Vũ Quốc Luận3, Lê Thị Lý2, Phạm Công Hoạt4, Trần Hoàng Dũng1* Trường Đại học Nguyễn Tất Thành Trường Đại học quốc tế, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Viện Sinh học Tây Nguyên Bộ Khoa học Công nghệ Ngày nhận 19/12/2018; ngày chuyển phản biện 24/12/2018; ngày nhận phản biện 25/1/2019; ngày chấp nhận đăng 12/2/2019 Tóm tắt: Lan Hài loài lan đẹp quý nên bị khai thác mức mua bán trái phép Việt Nam Trong đó, Lan Hài hồng lồi lan Hài đặc hữu Việt Nam gặp tình trạng tương tự Việc ứng dụng mã vạch ADN để nhận diện loài lan Hài thương mại, giúp hạn chế mua bán trái phép định danh sai điều cần thiết Nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu đặc điểm di truyền trình tự số vùng ADN thị loài lan Hài hồng, cung cấp trình tự ADN giúp nhận diện xác bảo tồn loài lan quý Nghiên cứu thu mẫu lan Hài hồng đặc hữu giải trình tự, phân tích đặc điểm di truyền cho vùng trình tự gồm rpoB, rpoC1, trnH-psbA, ITS, matK trnL, cho thấy tính thống mặt di truyền lồi Từ khóa: ITS, lan Hài hồng, matK, rpoB, rpoC1, trnH-psbA, trnL Chỉ số phân loại: 4.6 Mở đầu Lan Hài giới Việt Nam lồi thực vật cảnh u thích Với vẻ đẹp tự nhiên nét đặc biệt nên lan Hài bị săn lùng buôn bán nhiều, dẫn đến nguy đe dọa tuyệt chủng Việt Nam nước có số lượng lồi lan Hài đứng hàng đầu giới Nhưng theo thống kê IUCN cho thấy, với 24 loài lan Hài Việt Nam có đến 23 lồi nằm danh sách đe dọa tuyệt chủng Tình trạng thu hái bn lậu khơng thể kiểm sốt dẫn đến việc ngày nhiều loài lan Hài bị tận diệt Việc nhận diện kiểm soát kịp thời giúp hạn chế việc thu hái buôn bán trái phép, làm giảm nguy tuyệt chủng Phương pháp nhận diện lồi kỹ thuật phân tử nói hữu hiệu Bằng việc sử dụng lượng mẫu nhỏ từ phận rễ, thân, lá, phương pháp nhận diện phân tử cho ta kết với độ xác cao, giúp nhanh chóng xác việc nhận dạng lồi lan Hài để kịp thời ngăn chặn nạn buôn bán trái phép góp phần bảo tồn lồi Năm 2009, Yao cs nghiên cứu trình tự mã vạch để phân định lồi lan Hồng thảo (Dendrobium) nhờ trình tự mã hóa ADN vùng gen lục lạp trnH - pspA 17 loài Dendrobium Kết cho thấy, vùng gene trnH-pspA sử dụng mã vạch để phân biệt Dendrobium với loài khác [1] Năm 2012, Parveen cs nghiên cứu xây dựng hệ thống ADN barcode cho loài lan Hài Ấn Độ có nguy tuyệt chủng dựa vào vùng gen rpoB, rpoC1, rbcL, matK ITS Kết nghiên cứu cho thấy, matK vùng phân định loài tốt (đạt 100%), vùng trình tự gen matK cịn xác định xác bố mẹ giống lai lồi, cịn vùng ITS phân định lồi 50% [2] Năm 2012, Guo cs nghiên cứu tiến hóa phân bố địa lý sinh vật lan Hài Kết cho thấy giải tốt nhánh đơn ngành (Monophyletic branch) cho tất lồi nghiên cứu dựa vào trình tự phân tích hệ gen lục lạp: matK, rbcL, ycf1, ycf2, rpoC1, rpoC2 hệ gene nhân: ACO, LFY [3] Năm 2013, Kim cs nghiên cứu việc xác định phân tử loài lan Hài (Cypripedilum, Orchidaceae) Hàn Quốc có nguy bị tuyệt chủng liên quan đến đơn vị phân loại (taxa) Trong nghiên cứu này, tác giả sử dụng vùng hệ gen lục lạp rpoC2 vùng gen atpH-aptF để tạo hệ thống nhận dạng phân tử số loài chi Cypripedilum [4] Năm 2015, Ying cs xây dựng thành công phát sinh loài nhận diện loài lan châu Á trình tự gồm vùng nhân (nrITS, low-copy Xdh) vùng lục lạp (matK, psbA-trnH, trnL-F, trnS-trnG) [5] Trong nước, năm 2009, Phan Kế Long cs nhận diện số loài lan Hài đặc hữu Việt Nam nghiên cứu mối liên hệ với loài lan giới dựa vùng ITS để bảo tồn bền vững lồi lan có nguy tuyệt chủng Kết phân tích cho thấy, vùng ITS-rDNA loài lan Hài Việt Nam dao động 659- Tác giả liên hệ: Email: tranhoangdung1975@gmail.com * 61(5) 5.2019 60 Khoa học Nông nghiệp Genetic characteristics of the endemic orchid species Paphiopedilum delenatii in Vietnam Thi Huyen Trang Vu1, 2, Anh Khoa Tran1, Quoc Luan Vu3, Thi Ly Le2, Cong Hoat Pham4, Hoang Dung Tran1* Nguyen Tat Thanh University International University, Vietnam National University Ho Chi Minh city Tay Nguyen Institute of Biology Ministry of Science and Technology Received 19 December 2018; accepted 12 February 2019 Abstract: Paphiopedilum delenatii is known as an endemic orchid species of Vietnam The other species of Paphiopedilum genus are all valuable but in overexploitation This study aimed to find out more about this species’s genetic characteristics from some of sequence regions of its genome Three samples of Paphiopedilum delenatii from the wild nature were collected for this study The nucleotide characteristics of six regions rpoB, rpoC1, trnH-psbA, ITS, matK, and trnL were sequenced and analysed, and the results exhibited the genetic uniformity of the species dụng vùng trình tự rpoB, rpoC1, trnH-psbA, ITS, matK trnL để phân tích đặc điểm trình tự nhận diện lồi lan Hài hồng đặc hữu Việt Nam số loài lan Hài Việt Nam lân cận khác Vật liệu phương pháp nghiên cứu Thu thập, xử lý bảo quản mẫu Mẫu tươi thu Viện Sinh học Tây Nguyên, đưa phòng thí nghiệm, tiến hành rửa bụi bẩn bám nước Sau tiếp tục rửa lại mẫu nước cất khử ion Dùng bơng gịn thấm cồn 700 lau hai bề mặt Loại bỏ mẫu bị hư hại, dập, nhũn, bệnh, đốm đen, khô héo hay dị dạng Để khô mẫu, sau giữ túi zip ghi ký hiệu đánh dấu mẫu bảo quản -200C Mẫu định danh hình thái chuyên gia hình thái dựa vào có hoa Khuếch đại vùng trình tự nhận diện lan Hài hồng Một số vùng trình tự sử dụng cặp mồi nghiên cứu trước để khuếch đại Một số vùng trình tự tiến hành thiết kế cặp mồi nhằm đạt hiệu khuếch đại cao vùng có độ biến thiên di truyền cao, phù hợp với mục đích nhận diện trình tự Đối với cặp mồi thiết kế mới, tiến hành thử nghiệm số đối tượng lan Hài áp dụng rộng rãi cho nghiên cứu [9] (bảng 1) Bảng Các mồi sử dụng nghiên cứu Keywords: ITS, matK, Paphiopedilum delenatii, rpoB, rpoC1, trnH-psbA, trnL Tên vùng trình tự Tên mồi dự kiến Trình tự mồi Classification number: 4.6 ITS (900 bp) IT1-LH-F AGTCGTAACAAGGTTTC IT2-LH-R GTAAGTTTCTTCTCCTCC matK (1.200 bp) F56-mo R1326mo trnL-F CCTATCCATCTGGAAATCTTAG trnL-R CGGTATTGACATGTAAAATGGGACT rpoB (600 bp) 2F ATGCAACGTCAAGCAGTTCC 4R GATCCCAGCATCACAATTCC rpoC1 (600 bp) 1.1F GTGGATACACTTCTTGATAATGG 1.3R TGAGAAAACATAAGTAAAGGGC trnH-psbA (900 bp) psbA3’f CGCGCATGGTGGTTCACAATCC trnHf GTTATGCATGAACGTAATGCTC 700 bp Hai mẫu Paphiopedilum villosum lấy từ hai riêng biệt hồn tồn khơng có khác Chiều dài ITS mẫu Việt Nam giống với trình tự cơng bố Genbank [6] Năm 2010, Nguyễn Thị Mỹ Duyên cs nghiên cứu phả hệ giống, loài lan (Orchidaceae) dựa phân tích vùng trình tự ITS, kết cho thấy loài lan Hài Paphiopedilum delenatii, P concolor, P paishii, P hirsutissimum, P primulium có quan hệ họ hàng xa phân tích kiểu gen, hình thái chúng xếp nhóm [7] Khuất Hữu Trung cs sử dụng trình tự vùng ITS (gồm ITS1, 5.8 S, ITS2) để phân biệt 16 loài thứ loài chi Paphiopedilum Việt Nam Nghiên cứu kết luận rằng, vùng có độ biến thiên cao vùng ITS hữu ích cho việc phân tích phát sinh lồi [8] Như có nhiều vùng trình tự sử dụng đối tượng khác hoa lan Trong nghiên cứu này, sử 61(5) 5.2019 trnL (700 bp) GTTCTAGCACAAGAAAGTCG GGTAGAGCTACGACTTGATT Trích dẫn [10] [9] [11] Giải hiệu chỉnh trình tự Sau PCR, sản phẩm cho kết tốt bảng soi đặc hiệu gửi giải trình tự Cơng ty FirstBase Singapore Kết nhận file trình tự vùng khuếch đại hai chiều xuôi ngược Sau thu kết trình tự thơ, phần mềm Finch TV giúp đọc trình tự theo tín hiệu huỳnh quang để kiểm tra tín hiệu sản phẩm 61 (600 bp) 4R GATCCCAGCATCACAATTCC rpoC1 (600 bp) 1.1F GTGGATACACTTCTTGATAATGG 1.3R TGAGAAAACATAAGTAAAGGGC Del [11] Del 46 Del 47 Hình Kết tách ADN tổng số mẫu lan Hài hồng Chú thích: vệt màu sáng đậm dài rõ thể nồng độ ADN cao, ADN sau tách đứt gãy thành kích thước khác nên thể thành vệt trải dài từ xuống sau điện di psbA3’f CGCGCATGGTGGTTCACAATCC trnH-psbA (900 bp) học Nơng trnHf nghiệpGTTATGCATGAACGTAATGCTC Khoa Giải hiệu chỉnh trình tự quảquả điệntách di cho thấy, vùng HìnhKết Kết ADN tổngcác số sản trênphẩm mẫuPCR lan Hài hồng.trình tự rpoB, rpoC1, Sau PCR, sản phẩm cho kết tốt bảng soi đặc hiệu ITS, trnLmàu (hình 4) khuếch cơng vớiADN chiều ChúmatK, thích: vệt sáng3,đậm dài rõ thể đại nồngthành độ ADN cao, sau dài sản táchphẩm đứt gửi giải trình tự Cơng ty FirstBase Singapore Kết nhận file trình tự gãy thành kíchtương thước kháccậy nên thể900, thành vệt700 trải dài Kết từ sau vớihiệu dựcáckiến, lànhau 600, 600, 1.300 bp giải trình Trình tự ADN thường giải trình tự chiều mồi xuôi vàđúng chỉnh độ ứng tin dựa vào phần mềm Seaview, cácxuống trình tự tự khicho điệntín di hiệu tốt chiều xuôi chiều ngược Sau gióng cột hiệu vùng khuếch đại hai chiều xuôi ngược Sau thu kết trình cắt bỏ bớt hai đầu nhiễu, ghép chiều xuôi chiều ngược mồi ngược Việc giải theo hai chiều giúp hạn chế tối đa việc đọc sai tự thô, phần Finch TV giải giúp đọc tự theonên tín hiệu để kiểm tra thành di cho thấy, cácSeaview, sản phẩmcác PCR 5tựvùng trình tự rpoB, độKết tinmột cậy điện dựa vào mềm trình cắt tự bỏ bớt 500, hairpoC1, đầu trình tự phần thống nhất, chiều dài vùng trình cịn base Domềm trình tự theotrình chiều mộthuỳnh trongquang hai trình tựchỉnh ITS, matK, trnL (hình 3, 4) khuếch đại thành công với chiều dài sản phẩm tín cần hiệu đổi sản phẩm nhiễu, ghép chiều xi chiều ngược thành trình tự thống nhất, chiều dài 500, 750, 1.500 550 bp vùng tương ứng Kết đầu lại phần mềm Finch TV trước tiến hành việc so với dự kiến, tương ứng 600, 600, 900, 1.300 700 bp Kết giải trình tự vùngtrình trình tự 500,so500, 750,với 1.500 vàtrình 550 bp ởlan cácHài vùnghồng tương ứng Kếttừquả tựcịn sánh cácvà Trình ADN thường được giải trình chiều mồimềm xi Seaview, mồi ngược Việc sánh Cáctự trình tự chiều đưatựvào phần chọn cho tín hiệu tốt chiều xi chiềutựngược Sau sắptham gióngkhảo cột hiệu trình tự so sánh với trình tự lan Hài hồng tham khảo từ GenBank để phân tích GenBank để phân tích đặc diểm đa hình trình tự độ tin cậy dựa vào phần mềm Seaview, trình tự cắt bỏ bớt hai đầu cụ Align để gióng cộtviệc thẳng hàng động Cácgiảivịtheo trí chỉnh giảicơng theo hai chiều giúp hạn chế tối đa đọc sai base.tựDo trình[12] tự đặc diểm đa hình trình tự sắpnên gióng cột chưa phù sẽđầu điềuphần chỉnh cơng chiều hai trình tự hợp cần đổi lại mềmthủ Finch TV sau trướcđó tiếnnhiễu, ghép chiều xi chiều ngược thành trình tự thống nhất, chiều dài vùng trình tự cịn 500, 500, 750, 1.500 550 bp vùng tương ứng Kết Del Del Del Del Del Del Del Del Del hành việc so sánh Các trình tự chiều đưa vào phần mềm Seaview, chọn công 47 tích 46 47 46 trình tự so sánh với2 46 trình47tự lan Hài hồng tham khảo từ GenBank để phân Phân tích tính đặc trưng trình tự cụ Align để gióng cột thẳng hàng tự động [12] Các vị trí gióng cột chưa phùđặc 1.000 diểmbpđa hình trình tự 1.100 bp Phương phápthủsocơng sánh đa hình trình tự sử dụng chức 500 bp hợp điều chỉnh sau Del600Del Del Del Del bp Del Del600Del bp Del 46 47 47 46 47 46 variable sites (các điểm biến dị) phần mềm Mega 7.0 để xác rpoC1 trnH-psbA rpoB 1.000 bp Phân tích tính đặc trưng trình tự định vị trí đột biến Ghi nhận thủ cơng vị trí đoạn 1.100 bp 500 bp bp rpoC1 trnH-psbA 600 bp mẫu lan Hài hồng Hình Hình Kết quảKết khuếch vùng600 rpoB, Phương pháp sánh đa(insertion), hình trình tựmất sử dụng variable sites (các (deletion), chènso đoạn hoặcchức chèn nucleotide đại khuếch đại vùng rpoB, rpoC1 trnH-psbAtrnH-psbA mẫu rpoC1 rpoB Chú thích: sản hồng phẩm PCR khuếch đại thành công thể thành băng sáng gọn rõ nét điểm biến dị) phần Indel) mềm Mega 7.0 để xác định vị trí đột biến Ghi nhận thủ (mononucleotide lan Hài sau diquả xem ánh sáng huỳnh quang Sản phẩm PCR di sáng thang Hình 3.điên Kết đại vùng rpoB, trnH-psbA 3được mẫu lan Hài hồng Chú thích: sảnkhuếch phẩm PCR khuếch đạirpoC1 thành công thể thành mộtđiện băng gọn cơng vị trí đoạn (deletion), chèn đoạn (insertion), chèn ADN biếtsau kích thước chiều dài đoạn khuếch đại rõthích: nét điênPCR di vàkhuếch xem ánh sáng huỳnh quang phẩm Chúđể sản phẩm đại thành công thể Sản thành mộtPCR băngđược sángđiện gọn di rõ nét Kết quả(mononucleotide thảo luận Indel) nucleotide thang để biết kích thước chiềuSản dàiphẩm đoạn PCR khuếch đại.điện di thang sau điên diADN xem ánh sáng huỳnhcủa quang 1.500 bp Del 47 Delkhuếch Del 46đại Del Del 46 Del 47 Del 47 dài đoạn Del 46 chiều ADN để biết kích Del thước 1.000 bpbp 1.500 Del 1.300 Del bp 46 Del 47 Del Del 46 Del 47 Del Del 46 Del 47 900 bp luận thu mẫu Kết quảKết thảo Chúng tôimẫu thu mẫu lan Hài gồm mẫu Hài hồng Kết thu 1.000 bp 1.300 bp nguyên thể đánh mã số Del 2, Del 46 Del 47 (hình 1) Các 700 bp 900 bp Chúng thu mẫu lan Hài gồm mẫu Hài hồng nguyên thể matK trnL ITS mẫu thu Viện Sinh học Tây Nguyên định danh 700 bp đánh mã số Del 2, Del 46 Del 47 (hình 1) Các mẫu thu Viện Sinh học Tây matK trnL ITS hình thái Hình Kết khuếch đại vùng ITS, matK trnL mẫu lan Hài hồng Nguyên định danh hình thái Del Hình Kết khuếch đại vùng ITS, matK trnL mẫu lan Hài hồng Del 46 Hình Kết khuếch đại vùng ITS, matK trnL mẫu lan Hài hồng Chú thích: sản phẩm PCR khuếch đại thành công thể thành băng sáng gọn rõ nét sau điên di xem ánh sáng huỳnh quang Sản phẩm PCR điện di thang ADN để biết kích thước chiều dài đoạn khuếch đại Del 47 Hình Lá mẫu Hài hồng thu nghiên cứu Hình Lá mẫu Hài hồng thu nghiên cứu Riêng vùng trnH-psbA cuối khuếch đại thành công mẫu phải lặp lại phản ứng PCR nhiều lần Kết khuếch đại giải trình tự mẫu lan Hài hồng giải trình tự đoạn dài khoảng 200 bp chiều F, 600 ADN tổng số mẫu lan Hài hồng Del 2, Del 46 Del 47 bp chiều R, tín hiệu xấu khơng thể sử dụng để phân tích Kết giải trình tự đại mẫu lan Hài hồng (hình 2)khuếch sửđại dụng để khuếch vùng trình tự gồm vùng Kết giải thích vùng trnH-psbA vùng nằm ITS nhân, rpoB, trnL ADNtrong tổng số 3các mẫuvùng lan Hài hồngrpoC1, Del 2, trnH-psbA, Del 46 DelmatK, 47 (hình 2) sử hai gen (intergenic spacer - IGS) nên tính biến thiên dụng để khuếch đại vùng trìnhkhuếch tự gồmđại vùng ITSđiện nhân, tra cáctrên vùng rpoB, lục lạp Các6 sản phẩm di kiểm vùng cao khơng ổn định, dẫn đến trình tự mồi phổ quát rpoC1,gel trnH-psbA, matK, trnL lục lạp Các sản phẩm khuếch đại điện di agarose 1% khơng trùng khớp hồn tồn với trình tự mẫu, kiểm tra gel agarose 1% phản ứng khuếch đại có tỷ lệ thành cơng thấp Đồng thời, Del Del 46 Del 47 phản ứng PCR thực cặp mồi theo hai chiều xuôi ngược, đặc điểm phản ứng giải trình tự Sanger thực theo chiều, dẫn đến kết giải trình tự khơng phải đặc hiệu kết khuếch đại mà peak tín hiệu bị nhiễu khơng đọc tín hiệu Kết hồn tồn phù hợp với số công bố trước [13, 14] Như vậy, vùng trnH-psbA khơng phù hợp để làm trình tự nhận diện cho Hình Kết tách ADN tổng số mẫu lan Hài hồng loài lan Hài hồng Chú thích: vệt màu sáng đậm dài rõ thể nồng độ ADN cao, ADN sau tách đứt Hình Kếtthước tách ADN mẫu gãy thành các2.kích khác nhautổng nênsố thể thànhlan vệtHài trảihồng dài từ xuống sau So sánh tính đa hình trình tự lan Hài hồng Việt Nam Chú thích: vệt màu sáng đậm dài rõ thể nồng độ ADN cao, ADN sau tách điện di nghiên cứu trình tự lan Hài hồng Genbank đứt gãy thành kích thước khác nên thể thành vệt trải dài từ xuống điện di di cho thấy, sản phẩm PCR vùng trình tự rpoB, rpoC1, Kết sau quảkhiđiện ITS, matK, trnL (hình 3, 4) khuếch đại thành công với chiều dài sản phẩmChiều dài gióng cột vùng rpoB, rpoC1, ITS, Kết quảtương điện ứng di cho thấy,600, các900, sản 1.300 phẩmvàPCR Kết vùngquả trình matK với dự kiến, 600, 700 ởbp giải trình tự trnL tương ứng 485, 306, 700, 750 521 bp Khi tựtín rpoB, matK, (hìnhngược 3, 4) khuếch cho hiệurpoC1, tốt cảITS, chiều xuôi trnL chiều Sau gióngđại cột vàphân hiệu tích đa hình nucleotide, mẫu Việt Nam giống với chỉnh độ tin cậy phần cácvới trình đượctương cắt bỏứng bớt hainhau đầu hoàn toàn theo vùng trình tự rpoB, rpoC1, thành cơngdựa vớivào chiều dàimềm sản Seaview, phẩm dựtựkiến, nhiễu, ghép chiều chiều ngược mộtquả trình thốngtựnhất, matK trnL Từ rút trình tự nucleotide chung 600, 600,xi 900,và1.300 700 thành bp Kết giảitựtrình chiều cho dàiITS, vùng trình tự cịn 500, 500, 750, 1.500 550 bp vùng tương ứng Kết tín hiệu tốt chiều xuôi chiều ngược Sau gióng cột cho lồi Hài hồng Việt Nam vùng nghiên cứu sau: trình tự so sánh với trình tự lan Hài hồng tham khảo từ GenBank để phân tích đặc diểm đa hình trình tự 1.000 bp 500 bp Del 46 Del 600 bp rpoB Del 47 Del 61(5) 5.2019 Del 46 600 bp rpoC1 Del 47 Del Del 46 Del 47 62 1.100 bp trnH-psbA Khoa học Nông nghiệp rpoB: A C T G G G T TA G A A G G C C A A A C G G C T C TA G AT T C G G G TAT T T C A G C TATA G C C G A A C A C A A G G G A A A A AT C AT T TATA C T G ATA C T C A C A A G AT C G T T T T C T C A A G TA AT G G G G ATA C T C TA A G C AT T C C AT TA G T TAT G TAT C A A C G T T C C A A C A A G A A TA C T T G TAT G C AT C A A A A A A C T C A G G T T C G G C G G G G TA A ATATAT TA A A A A G G G A C A A AT TA TA G C G G G C G G T G C G G C C A C A G C T G G T G G A G A A C T C G C T T TA G G A A A A A AT G TAT TA G TA G C T TATAT G C C AT G G G A A G G T TA C A AT T T T G A A G A C G C A G T A C T A AT T A G T G A A C G T C T G G T T T AT G A A G AT A T T TATA C T T C T T T T C A C AT C C G G A A ATAT G A A AT T C A G A C T C AT G TA A C A A G C C A A G G T C C T G A A A G A AT A A C T A A A G A G AT T C C G C AT T T A G A G G C T C AT T T A CTCCGAAATTTAGACAGAAATGGAATTGT rpoC1: C G G G T C G AT TAT T C G G G A C G T T C T G T C AT T G T C G T G G G T C C T T T G C T T T C AT TA C AT C A AT G T G G AT TA C C T C G A G A A ATA G C A ATA G A G C T C T T C C A A A C AT T T G TA AT T C G T G G T C TA AT C A G A C A A C AT G T T G C T T C TA A C A C A G G G AT T G C T A A A A G C A A A AT TA G G G A A A A A G AT T C C AT T G TA T G G G A A ATA C T T C A A G A A G T TAT G C G G G G A C AT C C TATAT T G T T G A ATA G A G C A C C TA C C C T C C ATA G AT TA G G C ATA C A G G C G T T C C A A C C C AT T T TA G T G GAAGGGCGCGCTATT ITS: C C T C C T T G G G A G C T T T C T T G C C G G C G AT C TA A CCCTTGCCCGGCGCAGTTTTGCGCCAAGTCAC AT G A C A C ATA A AT G G T G A A G G G C A C G G C C C T T T G T G A AT T C A A G G A G G T G A A G G G C AT G T G G C C T T G A G C C TA C A C T C C C T C C C C C T C T C A A AT TAT T T T T T G A A C A A C T C T C A G C A A C G G ATAT C T C G G C T C T T G C AT C G AT G A A G A A C G C A G C G A A AT G C G A TA A G T G G T G T G A AT T G C A G A AT C C C G T G A A C C AT C G A G T C T T T G A A C G C A A G T T G C G C C C A A G G C C AT C A G G C C A A G G G C A C G C C T G C C T G G G C AT T G C G A G T C ATAT C T C T C C C T TA A C G A G G C T G T C C A G G C ATA C T G T T C A G C C G G T G C G G G T G T G A G T T T G G C C C C T T G T T C T T T G G T G C T G G G G G T C TA A G A G C T G C A G G G G C T T T T G AT G G T C C TA A AT T C G G C A A G A G G T G G A C G C A A C G C G C TA C A A C A A A A C T G T T G T G C G A AT G C C C C G G G T T G T C G TAT TA G AT G G G C C A G C ATA AT C TA A A C A C C C T T G T G A A C C C C A T T G G A G G C C C AT C A A C C C AT G AT C A G T T G AT G G C CATTTGGTT T T T T TA C AT T T G A AT TAT G T G T C A G AT C TA C TA ATA C C T C AT C C C ATA C AT C T G G A A AT C T T G G T T C A A G TA C T T C A AT G C T G G AT C A A G G AT G T T C C T T C T T T G C AT T TAT T G C G AT T T C T T T T C C A C G A ATAT C ATA AT T T G A ATA G T C T C AT TA C T T C A A A A G A AT T C AT T TA C G C C T T T T C A A A A A G A A A G A A A A G AT T C C T T T G G T T C C TATATA AT T C T TAT G TATAT G A AT G C G A ATAT T TAT T C C T G T T TAT T C G TA A A C A G T C T T C T TAT T TA C G AT C A A C AT C C T C T G G A G T C T T T C T T G A G C G A A C A C AT T T C TAT G TA A A A ATA G A G C AT C T TATA G TA G T G T G T T G TA AT T C T T T T C A G A A G AT C C TAT G C T T T C T C A A G G ATA C T T T C AT G C AT TAT G T T C G ATAT C A A G G A A A G G C A AT T C T G G C T T C A A A G G G A A C T C T TAT T C T G AT G A ATA A AT G G A A AT T T C AT C T T G T G C AT T T T T G G C A AT C T TAT T T T C A C T T T T G G G C T C A A C C G TATA G G AT T C ATATA A A G C A AT TAT C C A A C T AT T C C T T C T C T T T T C T G G G G T AT T T T T C A A G T G TACTAGAAAATCGTTTGGTAGTAAGAAAT trnL: G AT T G G AT T G A G C C T T G G TAT G G A A A C C T T G C TA A G T G G TA A C T T C C A A AT T C A G A G A A A C C C T G G A A C TA A A A AT G G G C A AT C C T G A G C C A A AT C T T T AT A A A A A AT G G A A A AT G A G A AT A A A A A G G G AT A G G T G C A G A G A C T C A AT G G A A G C T G T T C TA A C G A AT G A A AT T G A C TA C G T TA C G T TA G TA G C A A A A AT C C T T C TAT C A A AT G ATA G A A AT G A C A G TA A A G G A TA A G C T TATATA C C TA ATA C ATA C T G A C ATA G G A A A G AT T A AT T A C A A C C C T C T AT T T C G AT AT T T A G AT T C T T T C TATAT TA AT TA G A AT G ATA G A G AT C A A AT A AT C AT T C TA A A G AT C A G A A A AT C TAT G A A A A A A G G A A G A AT TAT T C T TA AT C C AT T C C C AT T T T C C A AT T G A A G T T T A A AT T G G A AT C G A AT T C T A AT AT T C A T T G AT C A A AT G AT T C AT T C C A G A G T T T C AT A G AT C C T T T G A A A AT TA AT C G G A C G A G A ATA A A G AGAGAGTCCCATTTT Khi so sánh với trình tự GenBank trình tự vùng rpoB, rpoC1, ITS trnL mẫu Việt Nam tương đồng với trình tự giới với độ tương đồng 100% (hình 5-8) matK: G A G T C AT T C T G G A A AT T C C AT T C T C G T C G C A AT TA ATAT C T T C T T C T G A AT C T T C T G A A G A A A A A A A A ATA C TA A A ATAT C ATA AT T TA C G AT C TA T T C AT T C A ATAT T T C C C T T T T TA G A G G A C A A A 61(5) 5.2019 Hình So sánh trình tự vùng rpoB mẫu Hài hồng nghiên cứu với trình tự GenBank cho kết tương đồng identity 100% 63 Khoa học Nông nghiệp Kết luận Các trình tự mẫu lan Hài hồng Việt Nam nghiên cứu giống đa hình nucleotide vùng trình tự rpoB, rpoC1, ITS, matK trnL Điều cho thấy tính thống mặt di truyền lồi Đồng thời, trình tự lồi Việt Nam tương đồng cao với trình tự lồi giới Vùng trnH-psbA vùng khó khuếch đại giải trình tự nên cần xem xét việc sử dụng vùng nhận diện loài lan Hài Hình So sánh trình tự vùng rpoC1 mẫu Hài hồng nghiên cứu với trình tự GenBank cho kết tương đồng identity 100% LỜI CẢM ƠN Nghiên cứu tài trợ Quỹ Phát triển khoa học công nghệ NTTU thông qua đề tài mã số 2017.01.53 Các tác giả xin chân thành cảm ơn TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] H Yao, et al (2009), “Identification of Dendrobium species by a candidate DNA barcode sequence: the chloroplast psbA-trnH intergenic region”, Planta Med., 75, pp.667-669 [2] I Parveen, et al (2012), “DNA barcoding of endangered Indian Paphiopedilum species”, Mol Ecol Resour., 12, pp.82-90 Hình So sánh trình tự vùng ITS mẫu Hài hồng nghiên cứu với trình tự GenBank cho kết tương đồng identity 100% [3] Y.Y Guo, et al (2012), “Evolution and biogeography of the slipper orchids: Eocene vicariance of the conduplicate genera in the Old and New World Tropics”, PLoS One, 7, e38788 [4] H.M Kim, et al (2013), “DNA barcoding of Orchidaceae in Korea”, Mol Ecol Resour., 14, pp.499-507 [5] T.Y Ying, et al (2015), “Phylogeny and classification of the East Asian Amitostigma alliance (Orchidaceae: Orchideae) based on six DNA markers”, BMC Evolutionary Biology, 15, p.96 [6] Phan Kế Long, Nguyễn Giang Sơn, Đặng Tất Thế (2009), “Mối quan hệ di truyền số loài lan Hài thuộc chi Paphiopedilum Việt Nam”, Tuyển tập báo cáo Hội nghị sinh thái tài nguyên sinh vật lần thứ Hình So sánh trình tự vùng trnL mẫu Hài hồng nghiên cứu với trình tự GenBank cho kết tương đồng identity 100% Riêng vùng matK, số trình tự GenBank P delenatii có trình tự có nucleotide biến dị so với Việt Nam, hai trình tự P delenatii AY368379 P delenatii JQ182193.1 khác biệt số vị trí nucleotide (hình 9), độ tương đồng đạt 99,60-99,87% Đây hai trình tự thu thập từ GenBank nên mang tính chất tham khảo, khác biệt đa hình di truyền địa lý lai giống tự nhiên, vấn đề định danh cá thể Del Del 46 Del 47 P.delenatii EU490699.1 P.delenatii JQ660905.1 P.delenatii JQ929368.1 P.delenatii AY368379.1 P.delenatii JQ182193.1 36 A A A A A G A 79 A A A A A C A 83 242 328 332 404 413 551 588 674 741 T G G C T A A C G G T G G C T A A C G G T G G C T A A C G G T G G C T A A C G G T G G C T A A A G G G G C T A A C G G T G G C T A A C G G G T A A C G G C A A Hình Các vị trí đa hình trình tự vùng matK mẫu lan Hài hồng Chú thích: vị trí mang dấu gạch ngang (-) nucleotide đầu trình tự chưa xác định Các mẫu mang mã số accession number mẫu tham khảo từ GenBank Hình so sánh thể vị trí nucleotide khác biệt 61(5) 5.2019 [7] Nguyễn Thị Mỹ Duyên, Trương Trọng Ngôn, Trần Nhân Dũng (2010), “Quan hệ giống, loài hoa lan (Orchidaceae) dựa đặc điểm hình thái”, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, 5, pp.165-175 [8] K.H Trung, T.D Khanh, L.H Ham, T.D Duong, N.K Truong (2013), “Molecular phylogeny of the endangered Vietnamese paphiopedilum species based on the internal transcribed spacer of the nuclear ribosomal DNA”, Advanced Studies in Biology, 5(7), pp.337-346 [9] Đặng Văn Khải, Nguyễn Thị Nhã, Vũ Thị Huyền Trang (2017), “Lựa chọn, thiết kế, thử nghiệm ứng dụng số mồi nhằm khuếch đại vùng trình tự tiềm để nhận diện lồi lan Hài (Paphiopedilum) Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, tr.113-118 [10] C.C Tsai (2003), Molecular Phylogeny, Biogeography, and Evolutionary Trends of the genus Phalaenopsis (Orchidaceae) [11] CBOL (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proc Natl Acad Sci USA, 106, pp.12794-12797 [12] M Gouy, S Guindon, O Gascuel (2010), “SeaView version 4: a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building”, Mol Biol Evol., 27, pp.221-224 [13] W Dong, et al (2015), “Ycf1, the most promising plastid DNA barcode of land plants”, Scientific Reports, 5, p.8348 [14] G Gigot, et al (2007), “Finding a suitable DNA barrcode for Mesoamerican orchids”, Lankesteriana, 7, pp.200-203 64 ... phẩm Phịng thí nghiệm thực vật chuyển hóa sinh học, Bộ môn Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh SeO2 sản phẩm tinh khiết (Merck, Đức),... Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Trung tâm Nghiên cứu Triển khai Công nghệ Bức xạ Ngày nhận 2/1 /2019; ngày chuyển phản biện 24/1 /2019; ngày nhận phản biện 13/3 /2019; ... Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Ngày nhận 8/3 /2019; ngày chuyển phản biện 11/3 /2019; ngày nhận phản biện 8/4 /2019; ngày chấp