Một số phương pháp đưa ADN tái tổ hợp vào tế bào chủ Hóa biến nạp Hiện tượng biến nạp chìa khóa giúp ta hiểu biết sở phân tử gen, công cụ để thực thao tác tạo tính di truyền vật sống Theo Mandel Higa cho thấy rằng, E Coli trở nên dễ bị biến nạp DNA ngoại lai tế bào vi khuẩn xử lí mơi trường có CaCl2 trước sốc nhiệt 42°C Hóa biến nạp phương pháp sử dụng chất hóa học, tạo điều kiện để đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ Quá trình thực theo hai buớc sau: Xử lí tế bào chủ dung dịch CaCl2 nhiệt độ thấp nhằm để thay đổi màng tế bào ủ vector tái tổ hợp với tế bào chủ xử lí Hiệu suất phương pháp hóa biến nạp vào khoảng 105 đến 106 tế bào biến nạp 1mg DNA tái tổ hợp Qua kết thực nghiệm, người ta thấy rằng, tế bào phát triển pha sớm đến pha dễ biến nạp Những nghiên cứu sau cho thấy việc xử lí tế bào ion kim loại hóa trị hai Ca+2 , Mn+2 Ba+2 cho khả biến nạp lớn Ngồi ra, hiệu suất biến nạp phụ thuộc vào kích thước plasmid, plasmid nhỏ hiệu suất biến nạp cao 2 Điện biến nạp Nguyên tắc: Sử dụng dòng điện cao cục theo xung để tạo lỗ nhỏ màng sinh học tế bào, tạo điều kiện cho tế bào hấp thụ DNA tái tổ hợp dễ dàng Hiệu suất: Từ 109 đến 1010 tế bào biến nạp cho 1mg DNA tái tổ hợp, nhiên, lượng tế bào biến nạp bị chết nhiều có lên tới 70% Hiệu suất phương pháp phụ thuộc vào yếu tố sau: - Độ mạnh điện trường tác động khác loại tế bào khác nhau, - Độ dài số thời gian (thời gian ngắt xung - ms) Theo nhiều nghiên cứu, hầu hết loại tế bào sinh vật, hiệu biến nạp cao số thời gian đạt khoảng 6ms - Nồng độ tế bào chủ - Nồng độ DNA tái tổ hợp - Giai đoạn phát triển tế bào (tế bào già non khơng thích hợp), - Mơi trường dung dịch đệm, - Cấu trúc màng tế bào 3 Biến nạp tế bào trần (protoplast) Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ xử lí polyetylen glycol (PEG) Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40% Đây phương pháp chuyển gen có hiệu cao tế bào thực vật Bằng phương pháp này, người ta nhận mang gen biến nạp ổn định di truyền qua nhiều hệ (Potrykus cộng 1995) Ưu điểm: Tần số biến nạp đồng thời gen thị gen cần biến nạp cao Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast loại Đặc biệt loại có giá trị kinh tế cao lúa, ngơ, đại mạch Nhược điểm: Việc tái sinh protoplast khó khăn số lồi Phương pháp bắn gen Nguyên tắc: Người ta sử dụng hạt kim loại nặng bao bọc DNA bắn trực tiếp vào tế bào Ưu điểm: Phương pháp biến nạp cho tất loại tế bào thực vật Thao tác dễ dàng, bắn lần nhiều tế bào Nhược điểm: Hiệu suất biến nạp thấp, thường xuyên nhận biến nạp khảm (cây có tế bào biến nạp tế bào không biến nạp) Một số thành tựu đạt phương pháp bắn gen: Năm 1988, Mc Cabe cộng nhận đậu tương biến nạp phương pháp bắn gen Năm 1990, Promm, Gordon, Kamm cộng nhận ngô biến nạp nhiều phòng thí nghiệm Những năm gần có hàng loạt công bố biến nạp thành công lúa Năm 1996, Zthang cộng biến nạp đu đủ, mía bơng Điều khẳng định tính ưu việt phương pháp Phương pháp vi tiêm Phương pháp vi tiêm phương pháp sử dụng vi kim kính hiển vi để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào định Đây trình lai ghép cho tế bào bậc cao tế bào hợp tử Tùy thuộc trường hợp cụ thể, người ta chọn phương pháp cho việc đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào có hiệu cao Ưu điểm: Có thể tối ưu lượng DNA tái tổ hợp đưa vào tế bào định đưa DNA vào loại tế bào Đưa xác chí vào tận nhân tế bào quan sát Các tế bào có cấu trúc nhỏ hạt phấn, tế bào tiền phơi tiến hành cách xác Có thể biến nạp cho giống Nhược điểm: Một phát tiêm tế bào thao tác cần phải khéo léo tỉ mỉ 6 Tải nạp Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, có q trình chuyển gen tái tổ hợp gen vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage) Thực nghiệm chứng minh tải nạp E Coli qua phage λ, phage P1 Bacillus subtilis qua phage SP10 So với phương pháp trên, tải nạp cho hiệu suất cao Như vậy, đến có nhiều phương pháp hóa học, hóa lý, học sinh học để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ Tùy đối tượng yêu cầu cụ thể, phương pháp hay phương pháp khác có hiệu sử dụng nhiều ... Tải nạp Tải nạp tượng chuyển vật liệu di truyền qua vector virus từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận, có trình chuyển gen tái tổ hợp gen vi khuẩn nhờ thực khuẩn thể (Bacteriophage) Thực nghiệm... gen thị gen cần biến nạp cao Có thể chuyển gen vào tế bào protoplast loại Đặc biệt loại có giá trị kinh tế cao lúa, ngô, đại mạch Nhược điểm: Việc tái sinh protoplast khó khăn số loài Phương pháp... trần (protoplast) Là phương pháp chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ xử lí polyetylen glycol (PEG) Để tạo tế bào trần, người ta ủ tế bào với PEG nồng độ 30% đến 40% Đây phương pháp chuyển gen