nghien cuu - dua can introduction

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Mã số: ĐH2016 – TN05-04 Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Thị Hà THÁI NGUYÊN, 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC BÁO CÁO TĨM TẮT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP ĐẠI HỌC Tên đề tài TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME DEACETYL VINDOLINE 4O-ACETYLTRASFERASE (DAT) THAM GIA TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN (Catharanthus roseus (L.) G Don ) Mã số: ĐH2016 – TN05-04 Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Thị Hà Tổ chức chủ trì Chủ nhiệm Bùi Thị Hà THÁI NGUYÊN, 2018 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Thông tin chung: - Tên đề tài: “Tách dòng biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” - Mã số: ĐH2016 – TN05-04 - Chủ nhiệm đề tài: ThS Bùi Thị Hà - Tổ chức chủ trì: Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên - Thời gian thực hiện: Từ tháng 01 năm 2016 đến tháng 12 năm 2017 Mục tiêu: Xác định đặc điểm biểu gen mã hóa deacetylvindoline-4-Oacetyltransferase (CrDAT) phân lập từ dừa cạn Tạo thuốc chuyển gen CrDAT Tính sáng tạo: Kết nghiên cứu đề tài góp phần làm sáng tỏ đặc điểm cấu trúc gen CrDAT phân lập từ dừa cạn màu hoa hồng tím màu hoa trắng thu thập Thái Nguyên Cơ sở khoa học hiệu kỹ thuật tăng cường biểu gen mã hóa enzyme chìa khóa chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid nhằm nâng cao hàm lượng alkaloid dừa cạn Kết nghiên cứu: 1.1 Gen CrDAT phân lập từ dừa cạn tách dịng phân tử xác định trình tự nucleotide Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa cho 439 amino acid 1.2 Vector chuyển gen thư ̣c vâ ̣t pBI121-CrDAT thiết kế chuyển vào hệ gen thuốc dừa cạn chuyển gen biểu protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa 1.3 Mơi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 1,0 mg/l IBA 0,6 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8 thích hợp cho phát sinh chồi sư ̣ sinh trưởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên Môi trường MS bổ sung sucrose 30 g/l; agar 10 g/l; BAP 0,5 mg/l IBA 0,4 mg/l; nước dừa 100 ml/l; pH = 5,8, thích hợp cho phát sinh chồi sinh trưởng chồi từ nách mầm Sản phẩm: 5.1 Sản phẩm khoa học - Số báo đăng Tạp chí quốc tế hệ thống ISI (SCI-E): 01 Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam, Le van Son, Chu Hoang Mau (2018), “Expression of the gene encoding deacetylvindoline 4-o-acetyl transferase (CrDAT) from Catharanthus roseus in transgenic tobacco plant”, Tạp chí Australian Joural of Crop Science, AJCS 12 (07), pp 1139 – 1143 doi: 10.21475/ajcs.18.12.07.PNE1077 - Số báo đăng Tạp chí quốc gia: 02 Bùi Thị Hà, Đỗ Huy Hoàng, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hồng Mậu (2016), “ Nghiên cứu quy trình chuyển gen dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don)”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, 157 (12/1), tr 71-76 Bùi Thị Hà, Đào thị Nhâm, Hoàng Ngọc Anh, Hồ Mạnh Tường, Lê văn Sơn, Nguyễn Thị Tâm, Chu Hoàng Mậu (2017), “Thiết kế cấu trúc nhằm tăng cường biểu gen mã hóa peroxidase dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don) chuyển gen”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 15 (3), tr 489 – 495 5.2 Sản phẩm đào tạo - Là phần số liệu đề tài NCS: Bùi Thị Hà, (2018), Nghiên cứu tăng cường biểu gen mã hóa enzyme DAT tham gia tổng hợp alkaloid dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don), Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên - Đào tạo 02 học viên cao học: Là phần đề tài + Đào Thị Nhâm (2016), Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc gen CrPrx phân lập từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G.Don ), Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên + Đỗ Huy Hoàng (2016), Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don), Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm, Đại học Thái Nguyên Phương thức chuyển giao, địa ứng dụng, tác động lợi ích mang lại kết nghiên cứu - Đề tài sử dụng làm tài liệu tham khảo học tập, giảng dạy phần sinh học - Sản phẩm đề tài sử dụng làm sở ứng dụng nâng cao hàm lượng alkaloid dừa cạn kỹ thuật chuyển gen phục vụ cho y dược học Ngày 13 tháng năm 2019 Tổ chức chủ trì (ký, họ tên, đóng dấu) Chủ nhiệm đề tài (ký, họ tên) Bùi Thị Hà INFORMATION ON RESEARCH RESULTS General information: Project title: CLONING AND EXPRESSION OF DAT GENE INVOLVED IN ALKALOID SYNTHESIS IN PERIWINKLE PLANTS (Catharanthus roseus (L.) G Don Code number: DH2016 - TN05 - 04 Coordinator: MS Bui Thi Ha Implementing institution: Thai Nguyen University of Medicine and pharmacine Duration: from 01-2016 to 12- 2017 Objective(s) Determine the characteristics and express the gene coding for deacetylindoline-4O-acetyltransferase (CrDAT) isolated from the periwinkle Creativeness and innovativeness: The results of the dissertation contribute to the clarification of the structural characteristics of CrDAT genes isolated from the purple and white flowered periwinkle plants collected in Thai Nguyen The scientific basis and effectiveness of the techniques enhancing the expressiom of the genes coding for the key enzymes in the chain of alkaloid synthesis have improved the alkaloid content in periwinkle plants Research results: 4.1 Study and collect data on CrDAT gene; design pairs of PCR primers cloning CrDAT genes; amplify, split and identify CrDAT sequencing 4.2 Design a plant transgenic vector containing the CrDAT gene and evaluate the activity of the transgenic vector on tobacco plants 4.3 Study the regeneration system and develop a procedure for gene transformation via Agrobacterium tumafaciens in periwinkle plants Products: 5.1 Science Bui Thi Ha, Nguyen Thi Ngoc Lan, Nguyen Thi Tam, Le van Son, Chu Hoang Mau (2018), “Expression of the gene encoding deacetylvindoline 4-o-acetyl transferase (CrDAT) from Catharanthus roseus in transgenic tobacco plant”, Australian Joural of Crop Science, AJCS 12 (07), pp 1139 – 1143 doi: 10.21475/ajcs.18.12.07.PNE1077 4 Bui Thi Ha, Đo Huy Hoang, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2016), “The transgenic process performed in periwinkle”, (2016), Journal of Science and Technology TNU, 157 (12/1), pp 71-76 Bui Thi Ha, Dao Thi Nham, Hoang Ngoc Anh, Ho Manh Tuong, Le Van Son, Nguyen Thi Tam, Chu Hoang Mau (2017), “Designing structure to overexpress gene encodes peroxidase in transgenic perwinkle plants (Catharanthus roseus (L.) G Don)”, (2017), Journal of Biotechnology, 15(3), pp 489 - 495 5.2 Educase - Is part of the data of the PhD: Bui Thi Ha (2018), The study on the overexpression of DAT gene involved in alkaloid synthesis in periwinkle plants (Catharanthus roseus (L.) G Don, Doctoral dissertation of Biology, College of Education, Thai Nguyen University - Graduate training 02 masters: + Dao Thi Nham (2016), Designing gene transgenic vector peroxidase isolated in perwinkle plants (Catharanthus roseus (L.) G Don), Master dissertation of Biology, College of Education, Thai Nguyen University + Do Huy Hoang (2016), The transgenic process performed in periwinkle (Catharanthus roseus (L.) G Don), Master dissertation of Biology, College of Education, Thai Nguyen University Transfer alternatives, application institutions, impacts and benefits of research results - The topic can be used as a reference in learning, teached biology - The product of the topic is used as a basis for application overexpess alkaloid in periwinkle by genetic engineering for medicine 5 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Hiện nay, loài người giới phải đối mặt với nhiều bệnh nguy hiểm: ung thư, AIDS, tiểu đường, thối hóa khớp, viêm gan B, C Ung thư bệnh gây tử vong hàng đầu toàn giới Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tỉ lệ người mắc ung thư năm 2012 14 triệu người, đến năm 2015 có 90 triệu người mắc ung thư hàng năm có triệu người chết ung thư Bệnh ung thư gia tăng trẻ em Tại Mỹ, năm 2016 có 10 nghìn trẻ mắc ung thư từ sơ sinh đến 14 tuổi có khoảng nghìn trẻ chết bệnh Vì vậy, việc tìm kiếm phát triển thuốc chữa bệnh ung thư vấn đề cấp bách Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don) loại dược liệu quý Cây dừa cạn có khả sản xuất indole alkaloid có dược tính quan trọng ứng dụng sản xuất loại thuốc chống ung thư, đặc biệt ung thư máu Ngồi ra, dừa cạn cịn dẫn điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp số bệnh ung thư khác Trong dân gian, dừa cạn sử dụng trị cao huyết áp, bệnh tiểu đường, điều hịa kinh nguyệt, chữa tiêu hóa chữa lị, lợi tiểu mạnh, chữa bệnh tiểu đỏ ít, tẩy giun, chữa sốt cao Trong tất alkaloid thực vật, terpenoid indole alkaloid (TIA) nhóm quan trọng chứa 3000 loại hợp chất có cấu trúc đa dạng tìm thấy họ thực vật Trong đó, lồi có nguồn gốc từ họ mã tiền (Loganiaceae), họ trúc đào (Apocynaceae) họ cà phê (Rubiaceae) chứa hàm lượng alkaloid cao Dừa cạn có chứa loại alkaloid vinblastine vincristine sử dụng rộng rãi điều trị bệnh ung thư Vinblastine vincristine chất ức chế mạnh phân chia tế bào ngăn cản tăng số lượng tế bào Ngoài ra, số TIA khác ajmalicine serpentine sử dụng để điều trị rối loạn tuần hoàn Quá trình chuyển hóa tổng hợp TIA dừa cạn trình phức tạp, trải qua nhiều phản ứng với tham gia nhiều enzyme, chất điều hòa chất vận chuyển Hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn hoang dại thấp Vì vậy, định hướng nghiên cứu nhằm tăng hàm lượng alkaloid dừa cạn quan tâm với việc sử dụng kỹ thuật đại, xác định tăng cường biểu enzyme chìa khóa khâu nghiên cứu quan trọng Deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) enzyme chìa khóa chuỗi chuyển hóa tổng hợp alkaloid dừa cạn Biểu mạnh gen mã hóa enzyme DAT làm tăng sản phẩm chuyển hóa thứ cấp hàm lượng vinblastine vincristine dừa cạn nâng cao Xuất phát từ lý chúng tơi thực đề tài: “Tách dịng biểu gen mã hóa enzyme deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase (DAT) tham gia tổng hợp alkaloid từ dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G Don)” Mục tiêu đề tài Phân lập tách dòng gen DAT từ dừa cạn thu thập Thái Nguyên Thiết kế vector chuyển gen mang gen DAT biểu thành công enzyme tái tổ hợp DAT thuốc Nội dung nghiên cứu Nô ̣i dung 1: Thu thâ ̣p các mẫu dừa ca ̣n ta ̣i Thái Nguyên, phân lâ ̣p cDNA DAT từ giố ng dừa ca ̣n hoa hồ ng tim ́ và giố ng dừa ca ̣n hoa trắ ng - Thu thâ ̣p mẫu dừa ca ̣n hoa hồ ng tim ́ và hoa trắ ng ta ̣i mô ̣t số điạ phương Thái Nguyên; - Nghiên cứu thông tin về gen DAT , thiế t kế că ̣p mồ i nhân gen DAT Tách chiế t RNA tổ ng số , ta ̣o cDNA và khuế ch đa ̣i cDNA DAT từ hai mẫu dừa ca ̣n hoa hồ ng tim ́ và hoa trắ ng; - Nghiên cứu dòng hóa cDNA DAT và xác đinh ̣ triǹ h tự gen DAT So sánh triǹ h tự cDNA DAT giữa giố ng dừa ca ̣n hoa hồ ng tim ́ và hoa trắ ng Nô ̣i dung 2: Thiế t kế vector chuyể n gen mang gen CrDAT phân lâ ̣p từ dừa ca ̣n - Ta ̣o cấ u trúc vector chứa promoter biể u hiê ̣n lá, thân, rễ thực vâ ̣t, gen CrDAT và mô ̣t số cấ u trúc khác - Tạo vi khuẩn Agrobacterium mang vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen CrDAT Nô ̣i dung 3: Nghiên cứu biể u hiê ̣n protein tái tổ hợp rDAT thuố c lá - Lây nhiễm Agrobacterium mang vector tái tổ hợp chứa cấu trúc gen CrDAT vào mô thuố c lá; - Tái sinh thuố c lá chuyể n gen; - Phân tić h các dòng thuố c lá chuyể n gen bằ ng PCR, lai Western blot Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đề tài tham khảo tài liệu tiếng việt 59 tài liệu tiếng anh để tổng kết nội dung liên quan đến đề tài Dừa cạn nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại terpenoid indole alkaloid (TIA) tách chiết từ ba giống, roseus có cánh hoa màu hồng tím, albus có cánh hoa màu trắng vàng ocellatus có cánh hoa màu trắng đỏ Trong dừa cạn hoa màu hồng tím có hàm lượng vincristine vinblastine cao Trong dừa cạn có khoảng 130 loại alkaloid, vinblastine vincristine hai hợp chất quan trọng Alkaloid có nhân indol tìm thấy tất phận cây, nhiều rễ Alkaloid tồn phần có dừa cạn với hàm lượng 0,37% - 1,15%, thân 0,40%, rễ 0,7% - 2,4%, rễ phụ 0,9% - 3,7%, hoa 0,14% 0,84%, vỏ 1,14%, hạt 0,18% Trong loại alkaloid chiết từ dừa cạn, người ta đặc biệt ý 20 nhóm alkaloid có hoạt tính chống ung thư bao gồm vincristine vinblastine DAT enzyme chìa khóa xúc tác cho phản ứng cuối chuỗi tổng hợp vindoline từ deacetylvindoline dừa cạn Trong nghiên cứu Benoit cs (1998), hoạt động enzyme DAT xác định quan khác dừa cạn Enzyme DAT hoạt động cao non, giảm xuống 76% già, thân 5%, hoa khoảng 11% rễ không đáng kể Mối quan hệ hoạt động enzyme tích lũy protein DAT xác định kết phân tích Western blot 7 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Hạt giống dừa cạn màu hoa hồng tím (TN1) màu hoa trắng (TN2) thu thập tỉnh Thái Nguyên Giống thuốc Nicotinana tabacum K326 có nguồn gốc từ Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Phịng tế bào Thực vật, Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp Các chủng vi khuẩn E Coli (DH5α), chủng A tumefaciens CV58 Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam cung cấp 2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Hóa chất Hóa chất tinh khiết sử dụng phân tích sinh học phân tử có nguồn gốc từ hãng Fermentas, Bio-Neer, Invitrogen, Trizol Reagents, kít Maxima® First Strand cDNA Synthesis, kít GenJET PCR Purification, kít Plasmid Extraction, taq-polymerase, buffer PCR, EDTA, Tris, agarose, enzyme giới hạn BamHI, NotI, NcoI, HindIII, T4 ligase, kháng sinh kanamycine, rifamycine, cefotaxime, carbenicillin số hóa chất khác có nguồn gốc từ hãng Fermentas, Invitrogen, Sigma, Amersham số hãng khác Thiết bị Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, Mỹ), máy điện di Powerpac 300 (BioRad, Mỹ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, Mỹ), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech, Thuỵ Điển), máy Vortex (Mimishaker, IKA, Đức), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, Mỹ), máy ly tâm, máy xung điện Gen Plulser,… số thiết bị khác phục vụ cho nghiên cứu 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Các phương pháp sinh học phân tử Phân lập gen CrDAT phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu thiết kế DAT-NcoIF/DAT-NotI-R RNA tổng số tách chiết Trizol Reagent Kit cDNA tổng hợp theo quy trình nhà sản xuất Tách dịng giải trình tự gen qua bước: i) Tinh sản phẩm PCR, ii) Ghép nối đoạn gen vào vector tách dòng pBT; iii) Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α; iv) Chọn dòng khuẩn lạc colony PCR; v) Tách chiết plasmid cắt kiểm tra BamHI; vi) Xác định phân tích trình tự nucleotide Kết nghiên cứu trình tự gen, amino acid xử lý phần mềm BioEdit, 2.3.2 Phương pháp thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen CrDAT Vector chuyển gen mang gen CrDAT thiết kế theo hai bước (1) Thiết kế cấu trúc độc lập mang gen chuyển CrDAT; (2) Gắn cấu trúc chứa gen CrDAT vào vector chuyển gen thực vật pBI121 (Hình 2.2) 8 Nco I Not I Nco I CrDAT Not I 2SP, antiABA 35S pBT – CrDAT cmyc KDEL polyA p R T R A7 /3 Hind III Hind III Hind III HindIII 35S CrDAT cmyc KDEL polyA RB nptII nptII GUS LB pBI121 pRTRA7/3-CrDAT RB MSC 35S CrDAT cmyc KDEL polyA LB pBI121-CrDAT Hình 2.2 Sơ đồ thiết kế vector chuyển gen pBI121-CrDAT 2.3.3 Chuyển cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc lá: Phương pháp chuyển cấu trúc chứa gen CrDAT vào thuốc môi trường tái sinh in vitro thực theo Topping (1998) 2.3.4 Phương pháp phân tích chuyển gen Xác định có mặt hợp gen chuyển CrDAT vào hệ gen tế bào chủ thuốc dừa cạn chuyển gen PCR Sothern blot Các chuyển gen dương tính với kết lai Southern sử dụng cho phân tích biểu protein tái tổ hợp CrDAT Western blot Định lượng protein tái tổ hợp rCrDAT tiến hành theo phương pháp Sun cs (2006) Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 ĐẶC ĐIỂM CỦA GEN CrDAT PHÂN LẬP TỪ CÂY DỪA CẠN 3.1.1 Kết tách dòng xác định trình tự nucleotide gen CrDAT 3.1.1.1 Kết khuế ch đa ̣i và tách dòng cDNA Dựa thơng tin trình tự gen DAT dừa cạn công bố Ngân hàng gen mang mã số AF053307, cặp mồi PCR DAT-NcoI-F/DATR-NotI-R (có trình tự nucleotide thể bảng 2.1) thiết kế để nhân gen CrDAT từ mRNA, dự kiế n kích thước cDNA khuếch đại 1320 bp RNA tổng số được tách chiế t từ dừa cạn hoa hồng tím (TN1), dừa cạn hoa trắng (TN2) và cDNA được tổ ng hợp từ RNA tổng số bằ ng phản ứng phiên mã ngược Phản ứng PCR khuếch đại cDNA gen CrDAT với cặp mồi thiết kế DAT-NcoIF/DAT-NotI-R Kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% với thang DNA kb thể hình 3.1 9 1,3 kb  M 1,3 kb   1,0 kb A 10 11 12 M  1,0 kb B Hiǹ h 3.1 Kết điê ̣n di kiể m tra sản phẩ m PCR nhân gen CrDAT A: Sản phẩ m PCR nhân gen CrDAT (cDNA) từ hai mẫu dừa ca ̣n TN1 và TN2 M: thang DNA kb; 1,2: gen CrDAT (cDNA) khuế ch đa ̣i từ mẫu TN1; 3,4: gen CrDAT (cDNA) khuế ch đa ̣i từ mẫu TN2) B: Sản phẩ m colony-PCR từ 12 dòng khuẩ n la ̣c 1-6: đoa ̣n gen CrDAT (cDNA) khuế ch đa ̣i từ khuẩ n la ̣c của mẫu TN2; 7-12: đoa ̣n gen CrDAT (cDNA) khuế ch đa ̣i từ khuẩ n la ̣c của mẫu TN1 Kết thu hình 3.1A cho thấy, mẫu dừa cạn TN1 và TN2 cho sản phẩm PCR với băng DNA với kích thước ước tiń h khoảng 1,3 kb Các băng sáng, rõ nét khơng có sản phẩm phụ Kích thước phù hợp theo tính tốn lý thuyết tương ứng với kích thước đoạn mã hoá của gen CrDAT dừa cạn mang mã số AF053307 Ngân hàng gen Tuy nhiên, để khẳng định xác sản phẩm PCR thu gen CrDAT dừa cạn đa ̃ tiến hành tách dịng, xác định trình tự nucleotide so sánh với trình tự gen DAT dừa cạn mang ma ̃ số AF053307 Ngân hàng gen quốc tế Sau tinh sạch, sản phẩm PCR gắn trực tiếp vào vector tách dòng pBT, tạo vector tái tổ hợp pBT-CrDAT biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Tiến hành chọn dòng khuẩn lạc màu trắng chọn ngẫu nhiên 12 dòng khuẩn lạc trắng cho phản ứng colony-PCR với cặp mồi đặc hiệu DAT-NcoI-F/DAT-NotI-R Kết điện di kiểm tra sản phẩ m colony-PCR hình 3.1B cho thấy, băng DNA có kić h thước khoảng 1,3 kb xuấ t hiê ̣n ở tất điện di 7, 8, 9, 10, 11, 12 dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen CrDAT từ mẫu TN1; băng DNA xuấ t hiê ̣n ở điện di số 1, 2, 4, dòng khuẩn lạc chứa đoạn gen CrDAT từ mẫu TN2; Kích thước của đoa ̣n DNA tương ứng kić h thước của gen DAT dừa cạn theo tính tốn lý thuyết Các khuẩn lạc màu trắng dương tính với phản ứng với colony-PCR sử dụng tách chiết plasmid plasmid tái tổ hợp đem giải trình tự nucleotide 3.1.1.2 Xác định trình tự gen CrDAT Kết giải trình tự nucleotide đoạn cDNA phân lâ ̣p từ hai mẫu dừa cạn TN1 và TN2 đề u cho kić h thước 1320 bp (Hình 3.2) Phân tích BLAST NCBI cho thấy trình tự nucleotide đoạn cDNA phân lập từ hai mẫu dừa cạn TN1 TN2 đoạn gen DAT câu dừa cạn Trình tự gen CrDAT của hai mẫu dừa ca ̣n TN1, TN2 thu so với trình tự gen DAT mang ma ̃ số AF053307 Ngân hàng gen NCBI cho thấy, đoa ̣n ma ̃ hóa của gen CrDAT có độ tương đồng cao Gen CrDAT phân lâ ̣p từ hai mẫu dừa ca ̣n TN1 và TN2 có đô ̣ tương đồ ng so với triǹ h tự gen DAT mang ma ̃ số AF053307 là 99,5% và 99% Như vâ ̣y có thể kế t luâ ̣n rằ ng, gen CrDAT phân lâ ̣p từ mẫu dừa ca ̣n TN1 và TN2 đa ̃ được tách dòng thành công Triǹ h tự nucleoitde của gen CrDAT phân lâ ̣p từ hai mẫu dừa 10 ca ̣n TN1, TN2 đa ̃ được đăng ký Ngân hàng Gen quốc tế với ma ̃ sớ LN809930 và LN809931 3.1.2 So sánh trình tự nucleotite gen CrDAT Trình tự nucleotide của mẫu dừa ca ̣n TN1 có sự sai khác so với trình tự mang mã số AF053307 vị trí nucleotide (1281, 1282, 1283, 1284, 1286, 1287) Gen CrDAT của mẫu dừa ca ̣n TN2 có sự sai khác so với trình tự mang mã số AF053307 vị trí nucleotide (482, 493, 500, 503, 505, 519, 566) Trình tự nucleotide của gen CrDAT ở hai mẫu dừa ca ̣n TN1 và TN2 khác ở 13 nucleotide (Bảng 3.1) Tiế p tu ̣c phân tić h, so sánh triǹ h tự amino acid suy diễn từ triǹ h tự nucleotite của hai mẫu dừa ca ̣n TN1, TN2 với protein mang ma ̃ số AAC99311 Ngân hàng Gen (protein suy diễn từ gen CrDAT mang ma ̃ số AF053307), kế t quả được thể hiê ̣n ở hiǹ h 3.3 Kết so sánh triǹ h tự amino acid suy diễn của protein DAT ở hai mẫu dừa ca ̣n TN1, TN2 và protein DAT mang ma ̃ số AAC99311 Ngân hàng Gen (protein suy diễn từ gen CrDAT mang ma ̃ số AF053307) (Hiǹ h 3.3) cho thấ y protein DAT gồ m 439 amino acid có đô ̣ tương đồ ng cao So với protein mang ma ̃ số AAC99311 Ngân hàng gen thì triǹ h tự amino acid suy diễn của mẫu TN1 có đô ̣ tương đồ ng 99,3 %, của mẫu TN2 có đô ̣ tương đồ ng 99,4 % Triǹ h tự amino acid suy diễn của hai mẫu TN1 và TN2 tương đồ ng là 97,7 % Tuy nhiên, các triǹ h tự amnio acid của protein DAT cuñ g có sự khác ở 10 vi ̣ trí amino acid (Bảng 3.2) Deacetylvindoline 4-O-acetyltransferase enzyme thành viên ho ̣ transferase có chức xúc tác ở khâu cuối sinh tổng hợp vindoline Motif HXXXD có thể phần vi ̣ trí hoạt động của enzyme này Vùng transferase của DAT có 427 amino acid, từ amino acid thứ đế n 434 Cây dừa ca ̣n gồ m ba giống khác nhau, giố ng dừa ca ̣n hoa hồng tim ́ , dừa ca ̣n hoa trắ ng và dừa ca ̣n hoa trắng đỏ Marfori và Alejar (1993), đa ̃ phân tić h sự thay đổ i hàm lượng alkaloid mô se ̣o có nguồ n gố c từ lá, rễ và hoa của mẫu dừa ca ̣n hoa hồ ng tim ́ và mẫu hoa trắ ng đưa nhận xét rằ ng, hàm lượng alkaloid phu ̣ thuô ̣c vào nguồ n gố c mô se ̣o từ lá, rễ hay hoa và hàm lượng alkaloid ở mô se ̣o có nguồ n gố c từ rễ của mẫu dừa ca ̣n hoa hồ ng tim ́ cao ở mẫu hoa trắ ng Protein DAT của mẫu dừa ca ̣n TN1 và TN2 khác ở 10 amino acid vùng transferase, sự khác này có liên quan gì đế n tổ ng hợp alkaloid và sự khác về hàm lượng alkaloid giữa mẫu hoa hồ ng tim ́ và mẫu hoa trắ ng là vấ n đề cầ n tiế p tu ̣c nghiên cứu để làm sáng tỏ 3.2 THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN CrDAT 3.2.1 Tạo vector mang cấu trúc chứa gen đích CrDAT Thu nhận gen CrDAT từ vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT Gen CrDAT dừa cạn màu hoa hồng tím tách dòng vector pBT (pBT-CrDAT) cắt cặp enzyme giới hạn NcoI/ NotI Kết tạo hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 1,3 kb 2,7 kb Trong phân đoạn DNA 1,3 kb gen CrDAT cần thu nhận Hình 3.4 thể sản phẩm DNA tinh có kích thước khoảng 1,3 kb tương ứng với kích thước gen CrDAT sau cắt vector pBT tái tổ hợp cặp enzyme giới hạn NcoI/ NotI Đoa ̣n DNA dùng để phát triển vector chuyển gen bước Tạo vector tái tổ hợp chứa cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL 11 Vector trung gian pRTRA7/3 dùng để cung cấp thành phần cần thiết cho việc biểu kiểm tra hoạt động gen đích CrDAT tế bào thực vật như: CaMV35S promotor mạnh phân lập từ virus gây khảm súp lơ, khởi động phiên mã gen chuyển tất tế bào mô thể thực vật Vector pRTRA 7/3 cịn cung cấp trình tự chuỗi peptit kháng ngun cmyc để dễ dàng xác định có mặt sản phẩm protein đích dùng kháng thể tương ứng Western blot ELISA Sau cắt mở vòng vector pRTRA7/3 sử dụng cặp enzyme giới hạn NcoI/NotI thu hai phân đoạn DNA với kích thước tính tốn khoảng 0,9 kb (là đoạn 2SP antiABA) 3,3 kb (kích thước vector pRTRA7/3), phân đoạn 3,3 kb pRTRA7/3 mở vòng Nco I M M 2 CrDAT CrDAT   1,5 kb  1,0 kb  pBT – CrDAT BA A Hình 3.4 Kết cắt vector tách dòng tái tổ hợp pBT-CrDAT với cặp enzyme giới hạn NcoI NotI A: Sơ đồ mơ tả cắt vector tách dịng tái tổ hợp pBT-CrDAT tạo gen CrDAT; B: Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt pBT-CrDAT; M: DNA kb; 1: pBT-CrDAT cắt; 2: pBT-CrDAT chưa cắt Kết điện di kiểm tra sản phẩm cắt hình 3.5 tính tốn Phân đoạn có kích thước 3,3 kb tinh để thu nhận cấu trúc mở vòng pRTRA7/3 (Hình 3.5) Nco I 35S Not I 2SP, antiABA cmyc KDEL polyA 2SP, antiABA p R T R A7 /3 A M M M 2 M M  1,5 kb  1,0 kb 1,0 kb  A BB M  3,3 kb 3,0 kb  1,5 kb  1,0 kb  M Not I  3,3 kb 3,0 kb   0,9 kb C Hình 3.5 Kết cắt mở vòng vector pRTRA7/3 A Sơ đồ cắt vector pRTRA7/3 cặp enzyme NotI/NcoI B: Kết cắt pRTRA7/3; M: DNA kb; 1: pRTRA7/3 chưa cắt; B 12 2: pRTRA7/3 cắt) C- Sản phẩm tinh vector pRTRA7/3: M- Thang DNA 1kb; 1Vector pRTRA7/3 tinh Tiến hành phản ứng gắn gen CrDAT vào vector pRTRA7/3 mở vòng nhờ DNA T4 ligase tạo cấu trúc tái tổ hợp pRTRA7/3 – CrDAT chứa cấu trúc 35S-CrDAT-cmycKDEL (Hình 3.6A) Vector pRTRA7/3 – CrDAT biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5α chọn dòng bằ ng phản ứng colony – PCR với cặp mồi đặc hiệu CrDATNcoI/CrDAT-NotI Kết điện di kiểm tra cho thấy, dòng khuẩn lạc xuất băng DNA đặc hiệu khoảng 1,3 kb tương ứng với kích thước gen CrDAT (Hình 3.6B) Như dòng vi khuẩn chọn lọc mang plasmid tái tổ hợp chứa gen CrDAT Plasmid tái tổ hợp pRTRA7/3-DAT sử dụng để thu nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmycKDEL phục vụ thiết kế vector chuyển gen thực vật cmyc 35S KDEL polyA M CrDAT Hind III pRTRA7/3 Hind III 1,5 kb 35S CrDAT cmyc KDEL  polyA 1,0 kb pRTRA7/3-CrDAT A B Hình 3.6 Kết tạo vector tái tổ hợp pRTRA7/3-CrDAT A: Sơ đồ tạo vector pRTRA7/3-CrDAT B: Kết điện di kiểm tra sản phẩm clony-PCR dòng khuẩn lạc chứa pRTRA7/3-CrDAT M: thang DNA 1kb; 1-6: Các dòng khuẩn lạc Thu nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA, cắt mở vòng pBI121 tạo vector chuyển gen pBI121-CrDAT Sau tạo cấu trúc gen CrDAT đầy đủ thành phần cần thiết cho biểu kiểm tra hoạt động gen vector trung gian pRTRA7/3-CrDAT Sử dụng enzyme giới hạn HindIII xử lý vector pRTRA7/3-CrDAT để thu nhận cấu trúc 35S-CrDAT-cmycKDEL-polyA 3.2.2 Tạo vector chuyển gen chọn dòng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-CrDAT Sử dụng enzyme giới hạn HindIII mở vòng vector chuyển gen pBI121 Gắn cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDEL-polyA vào vector chuyển gen pBI121 DNA T4 ligase tạo vector chuyển gen mang cấu trúc chứa gen chuyển CrDAT (pBI121-CrDAT) (Hình 3.7A) Sản phẩm tái tổ hợp pBI121-CrDAT biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Vi khuẩn sau biến nạp nuôi môi trường LB đặc bổ sung kháng sinh chọn lọc Km (mg/l) 13 35S Hind III Hind III Hind III CrDAT cmyc KDEL polyA RB nptII MCS pBI121 pRTRA7/3-CrDAT M RB nptII 35S LB GUS CrDAT cmyc KDEL polyA pBI121-CrDAT LB  1,5 kb  1,0 kb  A B Hình 3.7 Kết tạo vector chuyển gen pBI121- CrDAT A- Sơ đồ tạo cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT LB: bờ trái T-DNA; RB: bờ phải T-DNA; nptII: gen kháng Km; 35S: promoter CaMV35S B- Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR dòng khuẩn lạc E.coli DH5 M: thang DNA kb; 1-8: kết điện di sản phẩm colony-PCR từ dòng khuẩn lạc Nco I Kết điện di kiểm tra sản phẩm colony - PCR hình 3.7B cho thấy dịng khuẩn lạc (làn điện di số 1,5) âm tính, khơng xuất băng đặc hiệu, chứa plasmid pBI121 tự đóng vịng, kháng Km khơng mang cấu trúc gen CrDAT Các dịng dương tính với colony - PCR (làn điện di số 2, 3, 4, 6, 7, 8) xuất băng đặc hiệu khoảng 1,3 kb, chứa plasmid tái tổ hợp mang cấu trúc gen CrDAT Những dịng khuẩn lạc dương tính ni LB lỏng bổ sung kháng sinh chọn lọc Km để nhân dòng vector tái tổ Not I Nco I Not I hợp CrDAT Chọn dòng A tumefaciens tổ hợp 2SP, antiABA tái cmyc KDELmang polyA vector chuyển gen pBI121-CrDAT 35S Plasmid tái tổ hợp pBI121-35S-CrDAT-cmyc-KDEL được tách chiế t, kiể m tra và p R T R A7Cấu /3 biế n na ̣p vào A tumefaciens trúc vector chuyển gen pBI121 – CrDAT bao gồm thành phần thể hình 3.8A Các dòng A tumefaciens tái tở hợp chứa HindpBI121-35S-DAT-cmyc III vector chuyể n gen được Hind kiểIIIm tra bằ ng colony - PCR và kết HindIII phân tích ngẫu nhiên 10 dịng khuẩn lạc thu dịng dương tính với colony-PCR (Hình 3.8B) Các dịng A.tumefaciens tái tổ hợp chứa vector chuyển gen pBI121-CrDAT CrDAT cmyc KDEL polyA RB nptII LB MSC GUS lưu giữ sử du ̣ng cho các thí nghiê ̣m chuyển gen tiế p theo pBT – CrDAT Hind III 35S pBI121 pRTRA7/3-CrDAT M 10 1,5 kb RB nptII 35S CrDAT cmyc KDEL polyA LB  1,0 kb pBI121-CrDAT A B 14 Hình 3.8 Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT kết điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR A: Cấu trúc vector chuyển gen pBI121-CrDAT LB: bờ trái TDNA; RB: bờ phải T-DNA; nptII: gen kháng kanamycine; 35S: promoter CaMV35S B: Kế t quả kiể m tra sản phẩ m colony-PCR các dòng A tumefaciens chứa vector chuyể n gen pBI121-CrDAT 3.3 Phân tích biểu gen CrDAT thuốc chuyển gen 3.3.1 Biến nạp cấu trúc chứa gen CrDAT tạo thuốc chuyển gen nhờ A.tumefacinens Các mảnh thuốc giống K326 có kích thước khoảng 1cm2 sử dụng làm vật liệu nhận gen Thí nghiệm chuyển gen CrDAT vào thuốc trình bày hình 3.9 A D B E C G Hình 3.9 Hình ảnh mơ tả q trình biến nạp, chọn lọc tái sinh tạo thuốc chuyển gen A: Mảnh sau rửa khuẩn cấy môi trường chọn lọc; B, C: Tái sinh đa chồi; D: Kéo dài chồi; E: Tạo rễ; G: Ra bầ u ở điề u kiê ̣n nhà lưới Sau ngâm mảnh dung dịch chứa khuẩn A tumefaciens CV58 tái tổ hợp mang cấu trúc chứa gen CrDAT 30 phút, thấm khô mảnh nuôi tiếp môi trường MS Sau ba ngày đồng nuôi cấy tối môi trường MS, rửa khuẩn kháng sinh cefotaxim chuyển sang mơi trường MS có bổ sung kháng sinh cefotaxim, Km BAP mg/l (Hình 3.9A) Sau 2-3 tuần từ các mảnh lá xuất chồi nhỏ (Hình 3.9B,C) Các chồi nhỏ tách từ mảnh cấy lên môi trường MS bổ sung kháng sinh (Hình 3.9D), chồi cấy chuyển sang môi trường MS rễ (Hình 3.9E) Các thuốc sau rễ mơi trường có kháng sinh chọn lọc chuyển trực tiếp bầu chứa giá thể nhà lưới (Hình 3.9G) Kết biến nạp gen tái sinh thuốc chuyển gen trình bày bảng 3.3 15 Bảng 3.3 Kết biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào thuốc Đối chứng và thí nghiê ̣m Tổng số mảnh Số mảnh sống sót sau tuần Số mảnh cảm ứng tạo chồi Số Số Số rễ bầu trồng môi trường nhà lưới chọn lọc * ĐC0 30 0 0 * ĐC1 30 30 40 25 15 15 Lần 82 79 68 55 34 22 Thí Lần 90 86 74 61 44 25 nghiê ̣m Lần 77 70 63 52 35 18 Tổng 249 235 205 186 113 65 Ghi chú: ĐC0*: mẫu thuốc không chuyển gen cấy môi trường tái sinh có bổ sung kháng sinh; ĐC1*: mẫu th́ c lá không chuyển gen cấy môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh Bảng 3.3 cho thấy, sau lần biến nạp cấu trúc mang gen CrDAT vào mảnh thuốc Kết có 235/ 249 mảnh lá số ng sót sau tuần, phát sinh 205 chồ i và thu 186 in vitro sống sót mơi trường MS có bổ sung kháng sinh Số bầ u đấ t là 113 và có 65 trờ ng ta ̣i nhà lưới có biể u xanh tốt, mập mạp Trong đó, ở ĐC0* 30 mảnh lá không có mẫu nào số ng sót; còn ở ĐC1* thuốc không chuyển gen cấy lên môi trường tái sinh không bổ sung kháng sinh thu được 30 số ng, số bầ u đấ t là 15 và đem trồ ng ở nhà lưới 3.3.2 Phân tích có mặt hợp gen chuyển CrDAT hệ gen thuốc Xác định có mặt gen chuyển CrDAT hệ gen thuốc PCR Các dòng thuốc chuyển gen T0 sau trồng nhà lưới tuần tiến hành thu để thực phản ứng PCR kiểm tra có mặt gen chuyển CrDAT Thu 19 thuốc chuyển gen hệ T0 có sinh trưởng phát triển bình thường (ký hiệu từ T0-1 đến T0-19) đem tách chiết DNA tổng số tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu CrDATF-Xba/CrDATR-Sac Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose 1% thể hình 3.10  10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 M wt  1,5 kb  1,0 kb Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm PCR xác định có mặt gen CrDAT thuốc chuyển gen đối chứng Từ đến 19: dòng thuốc chuyển gen; M: thang DNA kb; wt: thuốc khơng chuyển gen 16 Hình 3.10 cho thấ y, 19 dòng thuốc chuyển gen có 12 dịng thuốc chuyển gen dương tính với phản ứng PCR dịng T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T08, T0-12, T0-13, T0-15, T0-16, T0-17, T0-19 (các dòng điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19); dòng T0-3, T07, T0-9, T0-10, T0-11, T0-14, T0-18 (các dòng điện di số 3, 7, 9, 10, 11, 14, 18) không xuất băng DNA Băng điện di sản phẩm PCR thu có kích thước khoảng 1,3 kb phù hợp với kić h thước của gen chuyển CrDAT Như bước đầu nhận xét rằng, cấu trúc mang gen chuyển CrDAT chuyển vào thuốc giố ng K326 tạo dòng thuốc chuyển gen T0 Xác định hợp gen chuyển CrDAT vào hệ gen thuốc Southern blot Để khẳng định gen chuyển CrDAT hợp vào hệ gen thuốc lá, DNA thuốc chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15) cho kết PCR dương tính lựa chọn ngẫu nhiên để sử dụng phân tích Southern blot Sử dụng emzyme giới hạn SacI cắt DNA tổng số dòng thuốc chuyển gen kết phân tích Southern blot thể hình 3.11 12 13 15 (+) M WT 20 10 7,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,5 Hình 3.11 Kết phân tích Southern blot dịng thuốc chuyển gen CrDAT M: Marker 1kbplus, (+) Plasmid pBI121- CrDAT cắt SacI, 1-15: chuyển gen T0 (1: T0-1 ; : T0-2 ; : T0-4 ; : T0-5 ; : T0-6 ; : T0-8 ; 12 : T0-12 ; 13 : T0-13; 15 : T0-15), WT: đối chứng không chuyển gen Hình 3.11 cho thấy, tất dịng thuốc chuyển gen cho kết lai Southern (T01, T0-2, T0-4, T0-5, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, T0-15), hai dịng T0-5 T0-15 cho băng DNA (2 copy), bảy dịng cịn lại có băng DNA kích thước khác Bảy dịng thuốc chuyển gen (T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13) cho kết lai Southern có copy sử dụng phân tích Western blot 3.3.3 Phân tích biểu protein CrDAT tái tổ hợp thuốc chuyển gen Protein tổng số dòng thuốc chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T012, T0-13 xuất băng DNA từ kết lai Southern phân tích điện di SDSPAGE chuyển phân đoạn protein lên màng nitrocellulose thực phản ứng lai Western Protein CrDAT tái tổ hợp mẫu protein chiết từ thuốc chuyển gen phát nhờ phản ứng màu chất TMB (3,3′; 5,5′Tetramethylbenzidine) Kết phân tích biểu protein tái tổ hợp CrDAT dòng thuốc chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13 có phản ứng dương tính với lai Southern Western blot thể hình 3.12 17 KDa M (+) T0-1 T0-2 T0-4 T0-6 T0-8 T0-12 T0-13 WT 130 100 70 55 51,0 kDa 40 35 Hình 3.12 Kết phân tích Western blot dòng thuốc chuyển gen CrDAT M: thang protein chuẩn ; (+) đối chứng dương ; T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13: chuyển gen; WT: đối chứng khơng chuyển gen Hình 3.12 cho thấy, màng lai nitrocellulose xuất băng màu vị trí kích thước khoảng 51 kDa dòng thuốc chuyển gen T0-1, T0-2, T0-4, T0-6, T0-8, T0-12, T0-13, cịn thuốc khơng chuyển gen (WT) không xuất băng protein Kết cho thấy, dịng thuốc chuyển gen có protein tái tổ hợp mang đuôi c-myc nên xảy phản ứng tạo màu enzyme kháng thể với chất Làn chạy điện di protein thuốc khơng chuyển gen khơng có protein gắn c-myc nên không xảy phản ứng tạo màu Như thấy gen CrDAT biểu protein tái tổ hợp CrDAT tổng hợp dòng thuốc Nicotinana tabacum K326 Kết phân tích PCR, Southern blot Western blot dịng thuốc chuyển gen CrDAT hệ T0 chứng minh gen chuyển CrDAT hợp vào hệ gen thuốc chuyển gen gen chuyển CrDAT hoạt động phiên mã dịch mã cho kết biểu protein tái tổ hợp CrDAT 3.4 Thảo luận kết thiết kế đánh giá hoạt động vector chuyển gen pBI121CrDAT Vector pBI121-CrDAT thiết kế chứa cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc-KDELpolyA, gen nptII kháng Km số thành phần khác Tập hợp thành phần cấu trúc nằm bờ trái (Left Border-LB) bờ phải (Righ Border-RB) vector thiết kế bảo đảm cho gen đích hoạt động dễ dàng sàng lọc thể tái tổ hợp gọi cấu trúc gen chuyển hoàn chỉnh (cassettle) Promoter 35S, promoter mạnh phân lập từ virus gây bệnh khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus - CaMV) CaMV35S promoter mạnh khởi động phiên mã cho gen tất loại mô bào thực vật giai đoạn sinh trưởng phát triển Trong nghiên cứu này, thiết kế vector chuyển gen pBI121, promoter CaMV35S sử dụng hướng đến việc khởi động phiên mã gen chuyển CrDAT nhằm tăng cường sinh tổng hợp vindoline dừa cạn Một số nghiên cứu gần chuyển gen thực vật sử dụng promoter CaMV35S cấu trúc vector chuyển gen thu kết biểu gen chuyển khả quan thông qua phân tích Western blot ELISA Promoter CaMV35S vector chuyển gen pCB301-GmEXP1 tăng cường biểu gen chuyển GmEXP1 thuốc chuyển gen xác nhận kết phân tích Real-time RT-PCR Western blot (Lo cs, 2015) Sự biểu mạnh gen mã hóa nhân tố phiên mã GmDREB2 vector pBI121-GmDREB2 chứa 18 promoter CaMV35S minh chứng kết biểu protein tái tổ hợp GmDREB2 tác động tăng cường tổng hợp proline chuyển gen điều kiện gây hạn nhân tạo (Tan cs, 2015) Theo hướng tạo chuyển gen kháng virus theo chế RNAi, Lo Thi Mai Thu cs (2016) sử dụng promoter CaMV35S vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi [pK7GW-CPi (SMV-BYMV)] Kết phân tích thuốc chuyển gen Real-time RT-PCR chứng minh điều khiển phiên mã CaMV35S cấu trúc RNAi Kế thừa kết nghiên cứu trước, vector chuyển gen pBI121-CrDAT chứa promoter CaMV35S thiết kế mục đích biểu mạnh gen CrDAT phân lập từ dừa cạn chứng minh thí nghiệm chuyển gen thuốc dừa cạn Cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc chứa đoạn peptide cmyc sử dụng làm kháng nguyên cho phản ứng Western blot để phát protein tái tổ hợp chuyển gen Một số cặp kháng nguyên thiết kế để sử dụng cho mục đích chọn biến đổi gen, đuôi cmyc coi lựa chọn có hiệu kinh tế cho nhiều nghiên cứu Trong kết nghiên cứu chúng tôi, biểu protein tái tổ hợp phát thuốc mô hình nhờ cấu trúc cmyc lai Western blot hiệu sử dụng vector PBI121-CrDAT thử nghiệm đánh giá mơ hình tảng cho việc sử dụng vector chuyển gen chứa gen CrDAT để biến nạp vào dừa cạn Khi kiểm tra hoạt động gen CrDAT thuốc chuyển gen Kết nghiên cứu Magnotta cs (2006,2007), cho thấy hoạt động CrDAT thuốc chuyển gen 10 lần so với enzyme tìm thấy chiết xuất dừa cạn Một nghiên cứu theo hướng sử dụng promoter DAT để đánh giá hoạt động gen CrDAT với việc sử dụng promotor DAT khác (pDAT 812, pDAT 2.3, pDAT 2.3/DAT pCAMBIA1305.1) thông qua lây nhiễm A tumefaciens LB4404 vào thuốc để kiểm tra hiệu hoạt động gen CrDAT làm sở lựa chọn promoter điều khiển gen CrDAT biểu mạnh, kết cho thấy vùng promotor DAT xác định có cảm ứng với ánh sáng Nhận xét chứng minh thực nghiệm biểu gen CrDAT liên quan đến cảm ứng ánh sáng promoter Nghiên cứu Magnotta cs (2007) chứng minh gen CrDAT biểu hệ thống rễ điều khiển promotor 35S Nghiên cứu chúng tôi, promoter 35S sử dụng điều khiển hoạt động gen CrDAT thuốc K326 cho kết biểu protein tái tổ hợp CrDAT với kích khước khoảng 51,5 kDa kiểm tra Western blot Từ kết cung cấp thông tin rõ ràng hoạt động gen CrDAT liên quan đến nhân tố phiên mã trans yếu tố cis promoter vai trò biểu protein CrDAT mô tế bào cụ thể thực vật Tuy nhiên, yếu tố cis nhân tố trans có vai trị cụ thể với biểu gen CrDAT thực vật chuyển gen cần tiếp phân tích làm sáng tỏ Cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc chuyển thành công vào mô thuốc N tabacum K326 nhờ A tumefaciens, tạo thuốc chuyển gen Sự có mặt hợp gen chuyển CrDAT vào hệ gen thuốc chuyển gen kiểm tra PCR Southern blot Protein tái tổ hợp CrDAT có trọng lượng phân tử khoảng 51 kDa biểu dòng thuốc chuyển gen Kết biến nạp đánh giá hoạt động cấu trúc 35S-CrDAT-cmyc thuốc chuyển gen sở cho viê ̣c điều khiển biểu mạnh gen CrDAT dừa cạn, ta ̣o dòng dừa cạn chuyể n gen có hàm lượng vincristine vinblastine cải thiện 19 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận 1.1 Gen CrDAT phân lập từ dừa cạn tách dòng phân tử xác định trình tự nucleotide Gen CrDAT (cDNA) có kích thước 1320 bp, mã hóa cho 439 amino acid 1.2 Vector chuyển gen thực vâ ̣t pBI121-CrDAT thiết kế chuyển vào hệ gen thuốc dừa cạn chuyển gen biểu protein tái tổ hợp CrDAT có kích thước khoảng 51 kDa Đề nghị Tiế p tu ̣c chuyển gen DAT vào dừa cạn phân tích dừa cạn chuyển gen nhằm tạo hệ T2,T3 có hàm lượng alkaloid cao  ... dịng T 0-1 , T 0-2 , T 0-4 , T 0-5 , T 0-6 , T08, T 0-1 2, T 0-1 3, T 0-1 5, T 0-1 6, T 0-1 7, T 0-1 9 (các dòng điện di số 1, 2, 4, 5, 6, 8, 12, 13, 15, 16, 17, 19); dòng T 0-3 , T07, T 0-9 , T 0-1 0, T 0-1 1, T 0-1 4, T 0-1 8... (T01, T 0-2 , T 0-4 , T 0-5 , T 0-6 , T 0-8 , T 0-1 2, T 0-1 3, T 0-1 5), hai dịng T 0-5 T 0-1 5 cho băng DNA (2 copy), bảy dịng cịn lại có băng DNA kích thước khác Bảy dịng thuốc chuyển gen (T 0-1 , T 0-2 , T 0-4 , T 0-6 ,... thuốc chuyển gen T 0-1 , T 0-2 , T 0-4 , T 0-6 , T 0-8 , T 0-1 2, T 0-1 3 có phản ứng dương tính với lai Southern Western blot thể hình 3.12 17 KDa M (+) T 0-1 T 0-2 T 0-4 T 0-6 T 0-8 T 0-1 2 T 0-1 3 WT 130 100 70