Đề thi HSGQG 2009 (1)

[IBO2009 - Nhật Bản] PTN. HÓA SINH HỌC (90 phút) Cách sử dụng máy quang phổ (xem Hình ở trang sau) 1. Màn hình của máy quang phổ (Shimadzu UVmini-1240) hiển thị sẵn ở 400nm (Hình 1). Nếu không, hãy giơ tay báo giám thị. Giá trị ABS hiển thị có thể không phải là 0.000 2. Bổ sung nước cất vào cuvet ít nhất tới gờ vát chéo trong cuvet (Hình 2) 3. Đặt cuvet vào trong để đỡ cuvet của máy, mặt trong suốt của cuvet theo chiều trái-phải 4. Đóng nắp (Hình 4). 5. Ấn nút ‘AUTO ZERO’ (Hình 5). Với thao tác này, máy xác định mức độ hấp thụ của cuvet chứa nước là 0. Số liệu này được dùng làm đối chứng cho toàn bộ phần còn lại của thí nghiệm này 6. Lúc này, em đã sẵn sàng đo độ hấp thụ của mẫu 7. Thay nước bằng một dung dịch mẫu, đóng nắp và đọc giá trị ABS. Độ hấp thụ là do sự có mặt của các chất hòa tan trong dung dịch mẫu. 8. Em không cần rửa cuvet sau mỗi lần đo, nếu như em lần lượt đo một dãy các mẫu được pha loãng theo nồng độ tăng dần. Giới thiệu Axít-phosphatase giải phóng các iôn phốtphát từ các phân tử bị phosphoryl hóa trong môi trường axít. Mục đích của thí nghiệm này là xác định hoạt tính đặc hiệu của axít-phosphatase. Em sẽ đo hoạt tính của axít-phosphatase trong dịch chiết thô của khoai tây ở Bài 1 và xác định nồng độ protein trong dịch chiết thô đó ở Bài 2. Hoạt tính đặc hiệu của enzyme là hoạt tính trên đơn vị thời gian và đơn vị khối lượng của protein thu được từ Bài 1 và 2. Hoạt tính đặc hiệu là một chỉ số về độ tinh khiết; hoạt tính tăng khi độ tinh sạch của enzyme tăng lên. Lưu ý 1. Em sẽ phải thao tác với một lượng nhỏ chất độc (như p -nitrophenol và NaOH ). Nếu muốn, em có thể đeo găng và kính bảo hộ. 2. Đối với những câu hỏi phụ thuộc một phần vào kết quả của câu hỏi trước, một phần điểm có thể được chấm nếu công thức tính là đúng, ngay cả khi kết quả sai. Vật liệu và thiết bị Số lượng 1. Máy đo quang phổ 1 2. Micropipette (dung tích 1000µl) 2 3. Micropipette dung tích 200 µl 1 4. Đầu côn (típ) loại 1000µl và 200µl, mỗi loại 2 5. Cuvet nhựa 1 6. Giá mang các ống kiểm tra phù hợp theo các mục từ 6.1. đến 6.7. 1 6.1. Dịch chiết thô chứa axít phosphatase (4 ml trong ống 15 ml bằng nhựa) 1 6.2. 0.5 M đệm Natri axêtát (pH 5.6) (2 ml trong ống 15 ml bằng nhựa) 1 6.3. 5 mM pNPP (8 ml trong ống 15 ml bằng nhựa) 1 6.4. 0.5 M NaOH (8 ml trong ống 15 ml bằng nhựa) 1 6.5. Dung dịch muối NaCl 3% (10 ml trong ống 15 ml) 1 6.6. Các ống thí nghiệm bằng thủy tinh 6 1 Hình 1 Hình 2 Hình 3 Hình 4 Hình5 2 Ống mang cuvet Nắp Gờ vát chéo Ánh sáng Bài 1 (70 điểm) Đo hoạt tính axít-phosphatase Hoạt tính của axít-phosphatase được đo bằng phản ứng chuyển hóa p-nitrophenyl phosphate (p- NPP) thành p-nitrophenol (pNP) và giải phóng phosphate. Sản phẩm pNP hấp thụ ánh sáng cực đại ở bước sóng 400 nm, có hệ số hấp thụ (ε 400nm ) là 19000 M -1 cm -1 tại pH kiềm mạnh. Hốn hợp phản ứng của axít-phosphatase có tính axít nhẹ. Tuy vậy, để định lượng pNP, hỗn hợp enzyme này phải được kiềm hóa. Trong bài 1, em sẽ đo sự thay đổi mức độ hấp thụ của 1ml dịch chiết thô qua thời gian theo đơn vị phút. Dựa trên hệ số ε 400 nm , từ mức độ thay đổi độ hấp thụ có thể tính được nồng độ . Sau đó, em sẽ tính số mole của các phân tử pNP được tạo ra trong quá trình phản ứng bằng cách nhân nồng độ với thể tích mẫu được đo độ hấp thụ. Hai nồng độ enzym được xác định ở Bài 1. Hãy lấy ống nghiệm kí hiệu ‘1× enzyme’ chứa dịch chiết thô của axít-phosphatase. Sau đó, lấy ống 15 ml chứa dung dịch NaCl 3% và dùng pipet hút bỏ 1ml, do vậy ống này còn lại 9 ml dung dịch NaCl 3%. Dùng pipetman hút 1 ml dung dịch từ ống ‘1x enzyme’ rồi cho sang ống chứa 9 ml dung dịch NaCl, nồng độ enzyme trong ống này bây giờ là ‘0,1× enzyme’. Đánh dấu lại ống này là ‘0.1 x’. Sau đó, lấy 6 ống nghiệm rỗng, đánh dấu mỗi ống tương ứng với một nồng độ enzyme và thời gian phản ứng như dưới đây: 0.1x, 20 min (min = phút) 1x, 20 min 0.1x, 10 min 1x, 10 min 0.1x, 1 min 1x, 1 min 3 Hệ số hấp thụ là gì? A = độ hấp thụ ε = hệ số hấp thụ ( / M/ cm) C = nồng độ (M = số mole / lít) L = chiều dài ánh sáng truyền qua mẫu I 0 = cường độ ánh sáng tới I = cường độ của ánh sáng truyền qua Độ hấp thụ (A) là một thuộc tính hóa lý của dung dịch, thể hiện mức độ hấp thụ ánh sáng của một chất tan ở một bước sóng nhất định. Độ hấp thụ tỉ lệ thuận với nồng độ (C) và chiều dài ánh sáng truyền qua mẫu (L). Hằng số trong phương trình là một giá trị đặc trưng cho chất tan và được gọi là hệ số hấp thụ (ε). Vì vậy, mối quan hệ này được viết thành công thức là A= ε.C (M=mol/lít).L (cm). Trong thí nghiệm này, từ độ hấp thụ, có thể tính được nồng độ, do ε được biết trước với L = 1 cm. Đơn vị của ε là M -1 cm -1 , vì độ hấp thụ là một số tuyệt đối không có đơn vị. Câu 1.1. (10 điểm). Đầu tiên, lập kế hoạch thí nghiệm để tiến hành tất cả các phản ứng bằng cách ghi dấu (○) cho thời điểm bắt đầu và dấu (●) cho thời điểm kết thúc của mỗi phản ứng trong bảng ở phiếu trả lời, sao cho em có ít nhất 1 phút để bắt đầu các phản ứng khác nhau. Trong bảng của phiếu trả lời, đã có sẵn một ví dụ miêu tả thời điểm bắt đầu và kết thúc đối với phản ứng ‘0.1×, 20 min’. Câu 1.2. (15+10 điểm). Hãy thực hiện các phản ứng enzyme theo quy trình mô tả dưới đây và theo kế hoạch bố trí thí nghiệm mà em đã làm ở câu 1. Mỗi lần thao tác, sử dụng một đầu côn mới. Trộn hỗn hợp mẫu bằng cách búng vào ống nghiệm chứa mẫu sau mỗi lần bổ sung chất mới. Sau khi thực hiện tất cả các phản ứng, đo A 400 của các mẫu. Viết số liệu thu được vào bảng trong phiếu trả lời và vẽ đồ thị từ các số liệu thu được. Lưu ý, vì nước được dùng làm đối chứng, nên đường thẳng không đi qua điểm 0 (không) trên trục Y. Quy trình đo hoạt tính của axít-phosphatase 1) Trộn 0,12 ml dung dịch đệm Natri axêtat (pH 5.6) và 0.24 ml dung dịch pNPP 5 mM vào một ống nghiệm. Bắt đầu phản ứng bằng cách bổ sung 0.24 ml một trong các dung dịch enzyme. 2) Sau khi các phản ứng ở các ống kí hiệu tương ứng đã trải qua 1, 10 và 20 phút, hãy dừng phản ứng lại bằng cách bổ sung 0.6 ml dung dịch NaOH 0.5 M. NaOH sẽ dừng phản ứng và chuyển hóa pNP thành dạng có màu vàng (hấp thụ bước sóng A 400 ) 3) Sau khi tất cả các phản ứng đã hoàn thành, đo các mẫu ở A 400 Thành phần phép thử axít-phosphatase của khoai tây Đệm Natri axêtat 0.5 M (pH 5.6) 0.12 ml pNPP 5mM 0.24 ml Enzyme 0.24 ml NaOH 0.5 M 0.6 ml Tổng 1.2 ml Câu 1.3. (15 điểm). Nồng độ nào của enzyme cho ra đồ thị thẳng (tuyến tính) hơn khi biểu diễn mối tương quan giữa thời gian và chỉ số A 400 ? Hãy khoanh tròn vào phương án đúng trong pbiếu trả lời. Xác định độ dốc của đường thẳng tuyến tính từ đồ thị tương ứng với nồng độ enzyme này? Câu 1.4. (5 điểm). Dùng độ dốc thu được từ câu 1.3., hãy tính hoạt tính ở dạng mức thay đổi giá trị A 400 (∆A) tính cho mỗi phút và mỗi ml của dung dịch enzyme 1x. Viết cách tính và đơn vị chính xác vào phiếu trả lời. Câu 1.5. (5 điểm). Từ giá trị thay đổi độ hấp thụ thu được từ câu 1.4, hãy tính mức thay đổi nồng độ với giá trị ε 400 giả định của pNP là 19000 M -1 cm -1 . Viết cách tính và đơn vị tính cho mỗi phút và mỗi ml của dung dịch enzyme 1x vào phiếu trả lời. Câu 1.6. (5 điểm). Từ sự thay đổi nồng độ thu được từ câu Q.15, hãy tính mức thay đổi số mole của pNP. Viết cách tính và kết quả thu được theo đơn vị số mol.min -1 .ml -1 của dung dịch enzyme 1x vào phiếu trả lời. Câu 1.7. (5 điểm) Hãy tính hoạt tính tổng số (số mol.min -1 ) trong 4 ml của dung dịch enzyme 1x được cung cấp từ đầu. 4 BÀI 2 (30 điểm) Xác định protein Nồng độ protein được xác định bằng cách dùng một protein chuẩn như albumin huyết thanh bò (BSA). Trong Bài 2, em sẽ xác định nồng độ của dung dịch enzyme 1x dựa trên BSA chuẩn bằng phương pháp Bradford. Phương pháp Bradford lợi dụng cường độ hấp thụ tăng lên của Commassie Brilliant Blue ở bước sóng 595 nm mỗi khi chất này liên kết với protein. Bằng cách pha loãng dung dịch mẹ BSA (0,4 mg protein/ml) với dung dịch NaCl 3%, một dãy nồng độ pha loãng 1/2 (0,4; 0,2, 0,1, và 0,05 mg protein/ml) được tạo ra. Dãy pha loãng của BSA và dung dịch enzyme 1x (lấy từ Bài 1) được xử lý như nhau với thuốc nhuộm. Mật độ quang (OD) ở bước sóng 595 nm (OD 595 ) của các mẫu này được đo và thu được như bảng dưới đây (lưu ý: làm theo số liệu ở bảng tiếng Việt, số liệu ở bảng tiếng Anh sai). Mẫu [BSA] (mg.ml -1 ) OD 595 0 0,000 0,05 0,470 0,1 0,543 0,2 0,661 0,4 0,921 Dung dịch enzyme 0,1x 0,180 Câu 2.1. (10 điểm). Vẽ đồ thị tuyến tính giữa các giá trị OD 595 tương ứng với mỗi nồng độ của BSA vào phiếu trả lời và kẻ đường thẳng tuyến tính. Câu 2.2. (10 điểm). Ước tính nồng độ protein trong dung dịch enzyme 0,1x từ đường tuyến tính thu được và suy ra nồng độ protein trong dung dịch enzyme 1x Câu 2.3. (10 điểm). Tính hoạt tính đặc hiệu của dung dịch enzyme 1x (hoạt tính tính theo số mole cho mỗi mg protein và mỗi phút). Viết cách tính và đơn vị mol.min -1 .mg -1 vào phiếu trả lời. ------------ HẾT ------------- 5 . [IBO2009 - Nhật Bản] PTN. HÓA SINH HỌC (90 phút) Cách sử dụng máy quang phổ (xem. như em lần lượt đo một dãy các mẫu được pha loãng theo nồng độ tăng dần. Giới thi u Axít-phosphatase giải phóng các iôn phốtphát từ các phân tử bị phosphoryl