Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh streptococcus suis type 2 ở lợn (tt)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LÊ QUỐC VIỆT NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE Ở LỢN Ngành: Mã số: Bệnh lý học chữa bệnh vật ni 9.64.01.02 TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019 Cơng trình hồn thành tại: HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn: PGS.TS ĐINH THỊ BÍCH LÂN PGS.TS BÙI TRẦN ANH ĐÀO Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Quang Tuyên Trường Đại học Nông lâm, Đại học Thái Nguyên Phản biện 2: TS Trần Thị Lan Hương Hội Thú y Phản biện 3: PGS.TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ Học viện Nông nghiệp Việt Nam Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Học viện họp tại: Học viện Nông nghiệp Việt Nam Vào hồi giờ, ngày tháng năm 2019 Có thể tìm hiểu luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Trung tâm Thông tin - Thư viện Lương Định Của, Học viện Nông nghiệp Việt Nam PHẦN MỞ ĐẦU 1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Một bệnh lây nhiễm từ thịt heo gây nguy hiểm cho người bệnh liên cầu khuẩn lợn Đây bệnh truyền nhiễm loại liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S suis) gây Bệnh xảy hầu hết lồi động vật máu nóng, lợn người chủ yếu Dựa vào đặc điểm polysaccharid lớp vỏ bọc vi khuẩn, người ta xác định vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết Trong đó, S suis type thường gây bệnh người động vật (Smith et al., 1999) Vi khuẩn gây hai bệnh cảnh viêm màng não nhiễm khuẩn huyết, nặng gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm mạc Nếu không phát bệnh sớm điều trị kịp thời người bệnh tử vong Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh để lại di chứng nặng nề bị ù tai, giảm thính lực, điếc hồn tồn… (Vecht et al., 1992) Các phương pháp chẩn đoán bệnh liên cầu khuẩn lợn gây thường dùng phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn môi trường chuyên dụng, phương pháp PCR Trong năm gần đây, giới phát triển loại KIT chẩn đốn nhanh dựa phương pháp sắc kí miễn dịch có độ đặc hiệu, độ xác cao, khơng cần phòng thí nghiệm, khơng cần thiết bị kỹ thuật viên có trình độ cao, giúp phát bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu thiệt hại cho người bệnh Tuy nhiên Việt Nam chưa có tác giả nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh liên cầu khuẩn type người động vật Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh liên cầu khuẩn type mang tính cấp thiết có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn KIT chẩn đoán nhanh đáp ứng tốt nhu cầu phát bệnh sớm kiểm sốt tình trạng mang mầm bệnh gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu chăn nuôi 1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chế tạo KIT phục vụ cơng tác chẩn đốn nhanh vi khuẩn S suis type lợn 1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: lợn lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus suis type phân lập từ mẫu dịch mũi lợn Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017 Địa điểm nghiên cứu: + Các lò giết mổ lợn địa bàn Thừa Thiên Huế; + Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nơng nghiệp Việt Nam; + Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học Vắc xin, Viện Cơng nghệ Sinh học, Đại học Huế 1.4 NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI Đây cơng trình nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S suis type lợn giết mổ địa bàn Thừa Thiên Huế Mẫu vi khuẩn S suis type phân lập phân tích đặc tính sinh học sinh học phân tử KIT chẩn đoán S suis type đề tài nghiên cứu có độ nhạy độ đặc hiệu cao, cho kết tương tự với KIT chẩn đoán S suis type Ju et al (2010) công bố 1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI 1.5.1 Ý nghĩa khoa học Kết nghiên cứu tài liệu tham khảo dùng giảng dạy nghiên cứu bệnh vi khuẩn S suis type gây lợn Trường, Viện nghiên cứu chuyên ngành thú y 1.5.2 Ý nghĩa thực tiễn Đề tài thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S suis type lợn khỏe lò giết mổ lợn địa bàn Thừa Thiên Huế, sở để đánh giá mức độ nguy hiểm nguy lây nhiễm bệnh vi khuẩn liên cầu lợn type gây người động vật Sản phẩm KIT chẩn đốn vi khuẩn S suis type có độ nhạy độ mẫn cảm cao thích hợp cho cơng tác chẩn đoán lâm sản thực địa, từ đoán cán thú y người làm công tác dịch tễ đưa chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh liên cầu lợn type từ lợn sản phẩm lợn PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 2.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis nước giới 2.1.1.1 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis giới S suis phát nhiều nơi giới nơi chăn nuôi lợn như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan Trung Quốc… (Vecht et al., 1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006) Từ năm 1983 đến năm 1995 có 32 số 35 type Streptococcus phân lập Hầu hết chủng phân lập từ lợn bệnh thuộc số type định, từ – Với mục đích phòng chống bệnh liên cầu lợn gây ra, nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập vi khuẩn S suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004), phương pháp chẩn đoán bệnh liên cầu lợn type (Yang et al., 2007; Tan et al., 2008a; Lomthaisong et al., 2010; Mandanici et al., 2010) Nghiên cứu protein kháng nguyên bề mặt nhằm tạo vắc xin (Li et al., 2006; Li et al., 2011) 2.1.1.2 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis nước Theo Nguyễn Vĩnh Phước (1987), Nguyễn Như Thanh cs (2001), vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi tự nhiên, ổ chứa lợn nhà Cả lợn rừng, ngựa, chó, mèo chim mang vi khuẩn liên cầu lợn Hiện có type liên cầu lợn thường gây bệnh lợn, type hay gây dịch bệnh lẻ tẻ đàn lợn tuần tuổi, type gây bệnh nhiều lứa tuổi khác Cả type cư trú amidal Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh cs., 2001) S suis type tồn kéo dài năm amiđan lợn mang mầm bệnh kể điều trị penicilline Ngo Thi Hoa et al (2011) cho biết rằng, miền nam Việt Nam, lợn giết mổ mang vi khuẩn S suis lên đến 41%, 8% S suis type 2.2 MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN LIÊN CẦU LỢN 2.2.1 Đặc điểm hình thái Vi khuẩn S suis có hình cầu, hình trứng, đường kính có đến μm, chúng xếp thành chuỗi chuỗi hạt, có độ dài ngắn khơng nhau, từ hai vi khuẩn tạo thành song cầu khuẩn chuỗi có - 10 vi khuẩn hay dài Vi khuẩn bắt màu dễ dàng với số loại thuốc nhuộm thông thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt màu Gram (+) (Mahon et al., 2000; Tan et al., 2008a) Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S suis Nguồn: Hughes et al (2009) 2.2.2 Đặc tính ni cấy sinh hóa Vi khuẩn S suis có khả lên men loại đường glucoza, lactoza, saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men loại đường: sorbit, dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin Tính chất khơng lên men đường innulin đặc tính để phân biệt tính chất độc chủng gây bệnh (Smith et al., 1999) S suis tăng trưởng kỵ khí hiếu khí, tăng trưởng 6,5% dung dịch NaCl S suis khơng chứa men catalaza oxidaza phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-) Vi khuẩn khơng di động Vi khuẩn có kháng ngun giáp mô sinh hai loại men streptokinaza (diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn Minh, 2003) 2.2.3 Sức đề kháng Những nghiên cứu tác giả khẳng định nhóm vi khuẩn khơng hình thành nha bào, đa số hình thành giáp mơ, hình thành giáp mơ xác định chúng sinh sống mô mọc mơi trường ni cấy có chứa huyết thanh(Enright et al., 1987) Vi khuẩn dễ bị diệt chất sát trùng thông thường cồng, phenol, iod, formol, tím genetian (Trịnh Phú Ngọc cs., 1999) Vi khuẩn S suis mẫn cảm với loại thuốc kháng sinh: penicillin, oreomycin, tetracylin, sulfadiazin, optoclin (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987) 2.2.4 Cấu trúc kháng nguyên • Thành phần kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng, định tính độc lực vi khuẩn S suis nằm thành vi khuẩn; • Kháng ngun giáp mơ; • Kháng nguyên bám dính Theo Jacques et al (1990) Vi khuẩn S suis số loại vi khuẩn Gram dương có mang cấu trúc So với loại vi khuẩn khác kháng nguyên bám dính vi khuẩn S suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường kính khoảng nm dài lên đến 250 nm 2.2.5 Khả gây bệnh 2.2.5.1 Nguồn bệnh Liên cầu lợn ln có mặt mơi trường ký sinh bình thường lợn khơng gây bệnh, gây bệnh viêm nhiễm không thành dịch viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi Nơi cư trú liên cầu lợn lợn đường hô hấp đặc biệt mũi, đường tiêu hoá sinh dục Vi khuẩn S suis thường xuyên phân lập vòm họng đường hơ hấp lợn khỏe, tồn họng, xoang mũi (Almeida et al., 2006) 2.2.5.2 Đường lây truyền Bệnh lây truyền qua đường hô hấp lợn khoẻ hít thở khơng khí có mầm bệnh, tiếp xúc lợn ốm lợn khoẻ, lợn ăn phải thức ăn nước uống có mầm bệnh Vi khuẩn xâm nhập qua vết thương, vết trầy xước để gây bệnh Điều cần đặc biệt quan tâm bệnh liên cầu khuẩn lây truyền từ lợn ốm sang người ngược lại Vi khuẩn xâm nhập thể người có tiếp xúc với lợn, thịt lợn nhiễm bệnh chưa nấu chín kỹ Vi khuẩn liên cầu lợn vào người qua vết thương hở da niêm mạc mũi, miệng Hiện chưa có chứng việc bệnh liên cầu khuẩn lây trực tiếp từ người sang người (Tan et al., 2008a) 2.3 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA BỆNH DO VI KHUẨN S SUIS GÂY RA 2.3.1 Triệu chứng bệnh tích vi khuẩn S suis gây lợn Lợn bị liên cầu khuẩn có biểu sau: da lợn có màng đỏ, sần, hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp bị sưng có dịch, màng não não bị tổn thương dạng phù nề, dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác đơng đặc, có mủ, viêm phế quản, viêm phổi, sốt cao 2.3.2 Triệu chứng bệnh tích vi khuẩn S suis gây người Nhiễm Streptococcus suis gây bệnh nặng nguy hiểm đến tính mạng bệnh nhân S suis không tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não, viêm khớp lợn mà gây viêm nội tâm mạc người, số trường hợp tiến triển tối cấp nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc khuẩn gây suy đa phủ tạng tử vong mà khơng kịp điều trị Thời kỳ ủ bệnh kéo dài từ vài đến ngày Người mắc liên cầu lợn chủ yếu chia làm hai thể thể tối cấp: nhiễm trùng huyết, sốt cao, nhanh chóng xuất tử ban (xuất huyết hoại tử da); thể viêm màng não: sốt cao, đau đầu, nơn (Arends and Zanen, 1988) 2.4 CHẨN ĐỐN Chẩn đoán phương pháp nhuộm Gram, phát cầu khuẩn Gram dương xếp thành chuỗi đứng đôi Sau chẩn đốn xác định vi khuẩn, cần tiến hành thử nghiệm PCR (TCVN 8400-2:2010), ELISA 2.4.1 Chẩn đoán phương pháp PCR Phương pháp PCR Silva et al (2006) sử dụng với cặp mồi CPS2 đặc hiệu cho việc xác định đoạn gene có kích thước 498 bp để xác định vi khuẩn Streptococcus suistype mẫu bệnh phẩm 2.4.2 Chẩn đoán phương pháp ELISA Hiện nay, thị trường giới có số cơng ty cung KIT ELISA chẩn đốn bệnh S suis type Wuhan Unibiotest Co.,Ltd; Công ty antibodies-online 2.5 ĐIỀU TRỊ 2.5.1 Điều trị thuốc kháng sinh Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh đem lại kết tốt Khi dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm, có hiệu tốt vật chưa có biểu triệu chứng lâm sàng nặng Nếu điều trị muộn hiệu khơng có hiệu (Phạm Sĩ Lăng cs., 2002; Hoàng Văn Năm, 2009) 2.5.2 Điều trị bệnh huyết Ngoài việc dùng kháng sinh hóa dược để điều trị bệnh Streptococcus suis gây ra, việc dùng huyết đặc hiệu để điều trị nhà khoa học giới đề cập đến từ lâu nhiều nước dùng huyết đặc hiệu điều trị bệnh S suis gây có hiệu tốt (Khương Bích Ngọc, 1996) 2.6 GIỚI THIỆU VỀ HẠT NANO VÀNG VÀ KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH 2.6.1 Tổng quan hạt nano vàng Khi vàng khối thông thường chế tạo kích thước nhỏ mức nano mét,chúng gọi cấu trúc nano vàng 2.6.2 Kỹ thuật sắc ký miễn dịch 2.6.2.1 Giới thiệu Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA)) dựa nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà hai thành phần gắn cộng hợp (conjugate) để phát thành phần kia, sau nhờ phức hợp chuyển dịch tác dụng mao dẫn màng, để tóm bắt kháng thể (hoặc kháng nguyên) bố trí sẵn vạch phát Đây công nghệ mở rộng từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex lần phát triển vào năm 1956 Singer and Plotz (1956) 2.6.2.2 Cấu tạo KIT chẩn đoán nhanh Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm mẫu (sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) đệm hút (adsorbent pad) Màng NC phun loại kháng thể khác tạo thành đường song song đường kiểm tra (vạch T) đường đối chứng (vạch C) (hình 2.2) Hình 2.2 Cấu trúc que thử nhanh Nguồn: O’Farrell (2008) 2.6.2.3 Nguyên tắc hoạt động đánh giá kết Mẫu bệnh phẩm xử lý dung môi phù hợp nhỏ vào đệm mẫu (sample pad) Toàn huyễn dịch chuyển dịch theo mao dẫn xuyên qua cộng hợp, đến vạch T vạch C phía đệm hút (Hình 2.3), có trường hợp xảy ra: a) Nếu mẫu kiểm tra có kháng ngun xuất màu vạch T vạch C b) Nếu mẫu kiểm tra khơng có kháng ngun xuất màu vạch C Hình 2.3 Cơ chế hoạt động KIT chẩn đoán nhanh Nguồn: Lee et al (2013) PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Chuột nhắt trắng swiss albino (SA) 10 tuần tuổi, có khối lượng 30-32g/con ni chuồng nhựa có lớp trấu hấp khử trùng, nhiệt độ phòng ni trì 25oC Chuột cho uống nước vô trùng ăn thức ăn tổng hợp AniFood (Viện Vắc xin Sinh phẩm y tế) Các chất bổ trợ khác dùng sản xuất vắc xin: Freund's adjuvant (Sigma Aldrich), Montanide ISA 201 VG (Seppic, Pháp), Montanide ISA 50V2 (Seppic, Pháp) Các hóa chất vật dụng chế tạo Kit chẩn đoán nhanh: Gold colloid 40nm (DCN, Mỹ), Đệm mẫu đệm hút (whatman, Anh), sợi thủy tinh (whatman, Anh), màng nitrocellulose (whatman, Anh) Vật liệu, dụng cụ, máy móc phòng thí nghiệm: Tăm bơng vơ trùng lấy mẫu, ống falcon 15 ml, máy ly tâm Eppendorf (Centrifuge 5415D), máy PCR (PTC100) MJ Research Inc (Mỹ), máy soi gel Dolphin- Doc (Wealtech, USA), tủ ấm CO2, tủ cấy vô trùng, Máy ELISA tự động BIO-RAD Coda Automated EIA, Bộ tinh kháng thể IgG Econo-Pac protein A Kit (Bio-Rad, Mỹ) máy phun Biodot XYZ3060D0003, máy Strip Guillotine Cutter ZQ4000 Môi trường, hóa chất thí nghiệm Mơi trường ni cấy, phân lập vi khuẩn: Brain heart infusion (BHI, Eiken chemical), thạch máu, môi trường bile esculin agar, môi trường Todd Hewitt Broth (THB), thuốc thử Kovac (Biomerieux, Pháp), môi trường Kligler iron agar (KIA – Biomerieux, Pháp), dung dịch 3% H2O2, mơi trường kiểm tra tính di động vi khuẩn (Pepton: 10g, cao thịt: 3g, NaCl: 5g, agar: 4g, genlatin: 80g, nước cất: 1000ml) 3.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1 Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type + Xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type lợn giết mổ; + Phân lập xác định đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn S suis type 2; + Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S suis type 3.2.2 Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type + Xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên; + Xác định liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm; + Xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột nhắt trắng thí nghiệm; + Chế tạo, tách chiết định lượng kháng thể IgG kháng S suis type 3.2.3 Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype + Xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng; + Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type thích hợp để phản ứng với dung dịch gold colloid; + Chế tạo kháng thể cộng hợp 3.2.4 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type + Xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng NC; + Xác định độ nhạy KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S suis type 2; + Xác định độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh vi khuẩn S suis type 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phương pháp sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 3.3.1.1 Phương pháp xác định tình hình nhiễm Streptococcus suis type lợn giết mổ Mẫu dịch mũi lợn lò mổ (Bạch Yến, Bãi Dâu Xuân Phú) thu thập cách lấy tăm bơng vơ trùng ngốy sâu vào mũi cho mẫu vào ml môi trường BHI, nuôi tủ ấm CO2 5% 37oC 16 tiến hành tách ADN a Chuẩn bị dung dịch lysis mẫu - Dung dịch 1: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 100 mM KCl, 2,5 mM MgCl2; - Dung dịch 2: 10 mM Tris HCl (pH 8.3), 2,5 mM MgCl2, 1% Tween 20, 1% Triton X-100, 0,01% Nonidet P-10 (Marois et al., 2004) b Tiến hành tách ADN Ly tâm ống ni 6000 vòng/phút phút để thu cặn, sau giết vi khuẩn cách cho ống fancol 15 chứa dịch vi khuẩn vào 100oC ủ 10 phút Mẫu hút cho vào ống eppendorf để tiến hành tách ADN c Trình tự primers Primer CPS2F: 5’-TTTGTCGGGAGGGTTACTTC-3’; Primer CPS2R: 5’-TTTGGAAGCGATTCATCTCC-3’ Với cặp mồi thiết kế trên, đoạn ADN cần nhân lên có độ dài khoảng 498 bp (Silva et al., 2006) d Thành phần phản ứng chu trình nhiệt cho PCR ADN mẫu sau tinh dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gene Phản ứng PCR thực với 30 chu kỳ nhiệt độ bắt mồi 58oC 3.3.1.2 Phương pháp phân lập, xác định đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn S suis type a Phương pháp phân lập vi khuẩn S suis type Dịch nuôi mẫu xác định dương tính với S suis type phương pháp PCR cấy ria môi trường thạch máu cừu 5%, nuôi 16 tủ ấm CO2 5% 37oC Sau nuôi, chọn ngẫu nhiên vài khuẩn lạc tròn lồi, khơ, màu xám, nhỏ đặc trưng Streptococcus spp để kiểm tra phản ứng catalase thử nghiệm bile esculin phản ứng sinh hóa khác Bảo quản mẫu vi khuẩn để phục vụ thí nghiệm b Phương pháp PCR xác định đặc tính sinh học phân tử + Trình tự primers 6PGD Primers 6PGD thiết kế dựa vào trình tự ADN ngân hàng gene (gb/CP000407) (Tan et al., 2008b) + Phương pháp xác định hiệu giá kháng thể Hiệu giá kháng thể kháng S suis type xác định phương pháp ELISA gián tiếp Mẫu kháng thể pha loãng dẫn theo cấp số Hiệu giá kháng thể xác định độ pha độ pha loãng cao mẫu mà xuất phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể c Phương pháp kiểm tra độ tinh kháng thể Độ tinh kháng thể sau lọc kiểm tra điện di polyacrylamide gel 15% có SDS 80 V Sau đó, gel nhuộm với dung dịch Coomassie Blue R250 Phân tích kết điện di dựa theo xuất kích thước băng protein nhuộm so thang protein chuẩn (marker) d Phương pháp ELISA gián tiếp Phủ đĩa với kháng nguyên vi khuẩn S suis bất hoạt pha loãng với dung dịch carbonate-bicarbonate buffer (Sigma) với nồng độ 2,5x107 vi khuẩn/ml Cơ chất sử dụng OPD Đọc kết máy đọc ELISA bước sóng 492 nm theo đề nghị nhà sản xuất chất OPD Mẫu dương tính giá trị OD> giá trị giới hạn (Cut off) Giá trị giới hạn = trung bình OD nhóm đối chứng + (3x Sai số chuẩn nhóm đối chứng) (Classen et al., 1987) 3.3.3 Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 3.3.3.1 Xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt nano vàng pH dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano xác định cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid (pH từ 6.5 - 8.5) với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S suis type (C= 500 µg/ml), lắc nhẹ 30 phút, sau thêm 250 µl dung dịch NaCl 10% Ủ 10 phút quan sát pH thích hợp để gắn pH mà hỗn hợp dung dịch giữ màu hồng tươi Màu hồng tươi phát bước sóng 520 nm (Paek et al., 2000) 3.3.3.2 Xác định nồng độ kháng thể kháng Streptococcus suis type thích hợp để phản ứng với dung dịch colloidal gold Nồng độ kháng thể kháng S suis tối ưu để gắn với hạt vàng nano vàng dung dịch đươc xác định cách trộn 250 µl dung dịch gold colloid với 25 µl dung dịch kháng thể kháng S suis type (0, 100, 200, 300, 400, 500, 600 µg/ml) lắc nhẹ 30 phút, sau thêm 250 µl dung dịch NaCl 10% Ủ 10 phút quan sát ống có nồng độ thấp không bị đổi từ màu hồng sang màu xanh (đo bước sóng 520 nm) Nồng độ protein ống nồng độ protein tối thiểu cần để gắn với gold colloid 3.3.3.3 Phương pháp chế tạo kháng thể cộng hợp Kháng thể cộng hợp chế tạo cách ủ kháng thể kháng S suis 2, với gold colloid (DCN, 40 nm, Mỹ) với tỷ lệ (1:10, vol/vol) nhiệt độ phòng 30 phút Sau thêm 10% albumin huyết bò (BSA) để cố định phân tử gắn kết Ly tâm 12.000 vòng 30 phút 40C, bỏ dịch Phần cặn rửa hỗn hợp 10mM Tris-HCl (pH 8.2) chứa 1% BSA, 5% sucrose Sau ly tâm bỏ dịch nổi, kháng thể cộng hợp pha loãng 100 µl hỗn hợp rửa (Chaudhuri and Raychaudhuri, 2001) Cuối kháng thể 11 cộng hợp cho lên giấy thủy tinh sợi (glass fiber), phơi khô nhiệt độ phòng qua đêm 3.3.4 Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 3.3.4.1 Phương pháp xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp phủ lên màng nitrocellulose Nồng độ kháng thể chuột kháng S suis type (kháng thể bắt) thích hợp xác định cách phun lên màng nitrocellulose (NC) đường kiểm tra với nồng độ khác (1,5; 1,75; 2,0 mg/ml), đồng thời phun Anti-Mouse IgG antibody produced in goat (Sigma-Aldrich, µg/cm) lên màng NC đường đối chứng máy Biodot XYZ3060D0003 3.3.4.2 Phương pháp xác định độ nhạy độ đặc hiệu KIT chẩn đốn nhanh a Thí nghiệm xác định lượng vi khuần tối thiểu cho kết dương tính với KIT chẩn đốn nhanh Tiến hành cho vào đệm mẫu KIT 100 µl dung dịch chứa vi khuẩn S suis type với lượng khác Lượng vi khuẩn tối thiểu KIT chẩn đốn phát xác định mức vi khuẩn tối thiểu mà KIT xuất băng quan sát (Ju et al., 2010) b Thí nghiệm xác định phản ứng chéo KIT chẩn đoán nhanh Phản ứng chéo KIT xác định cách cho vào đệm mẫu KIT chẩn đốn 100 µl dung dịch chứa 5x107 loại vi khuẩn khác E coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Viện Công nghệ sinh học-Đại học Huế) số chủng vi khuẩn S suis type (Bùi Thị Hiền cs., 2016) Quan sát xuất băng màu KIT 5-10 phút c Thí nghiệm xác định độ nhạy độ đặc hiệu KIT chẩn đoán nhanh Độ nhạy độ đặc hiệu KIT xác định so sánh với kết phương pháp PCR việc xác định mẫu dương tính âm tính Bảng 3.2 Xác định độ nhạy độ đặc hiệu KIT chẩn đốn nhanh Kit phát nhanh Dương tính Âm tính PCR Dương tính a b Âm tính c d Ghi chú: a: Kết dương tính xác định KIT PCR b: Kết dương tính xác định PCR âm tính xác định KIT c: Kết âm tính xác định PCR dương tính xác định KIT d: Kết âm tính xác định PCR KIT 3.3.5 Phương pháp phân tích số liệu Số liệu thu thập thí nghiệm xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên; thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch cho chuột tính tốn phần mềm Excel 2003 Sai khác có ý nghĩa (với α=0,05) xác định T-test; Độ đặc hiệu độ nhạy KIT xác định phần mềm MedCalc 15.4 dựa theo kết chuẩn xác định phương pháp PCR 12 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG NGUYÊN STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 4.1.1 Tình hình nhiễm Streptococcus suis type lợn giết mổ Với kết PCR, nhận thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type lợn phân lập lò mổ Bạch Yến 13,33%, lò mổ Bãi Dâu 7,50% lò mổ Xuân Phú 6,67% Như vậy, tính tổng tỷ lệ nhiễm S suis type địa bàn Thừa Thiên Huế 9,00 4.1.2 Phân lập xác định đặc tính sinh học phân tử vi khuẩn S suis type 4.1.2.1 Phân lập vi khuẩn S suis type Từ mẫu dương tính với S suis type 2, chọn mẫu tiến hành ria cấy để phân lập vi khuẩn môi trường thạch máu cừu Chọn khuẩn lạc đơn có hình dạng đặc trưng vi khuẩn liên cầu lợn Chủng vi khuẩn phân lập đặt tên TTHSS2 Kết nhuộm gram cho thấy vi khuẩn có hình giống trực khuẩn, liên kết với tạo thành chuỗi, tiêu thấy vi khuẩn có độ dài khác bắt màu gram (+) Làn 1: Marker 1kb (Bioline), đến 10: mẫu dương tính, 11: chứng âm Hình 4.1 Kết PCR kiểm tra mẫu dương tính với S suis type Để chế tạo KIT chẩn đoán nhanh, việc phân lập chọn chủng vi khuẩn thích hợp, có đủ đặc tính sinh hóa đặc tính sinh học đặc trưng vi khuẩn S suis type quan trọng Kết thực phản ứng sinh hóa vi khuẩn liên cầu lợn thu sau: 13 Bảng 4.1 Kết sinh hóa vi khuẩn S suis TT Chỉ tiêu Gram Bile esculin Catalase Lên men đường glucose Lên men đường lactose Indol Di động Kết + + + + - Sau xác định hình thái vi khuẩn xác định số tiêu sinh hóa, khuẩn lạc Streptococus suis tách ADN để làm khuôn cho phương pháp PCR xác định S suis type với cặp mồi đặc hiệu 4.1.2.2 Xác định đặc tính sinh học phân tử chủng vi khuẩn TTHSS2 Kết điện di cho thấy sản phẩm PCR S suis type có kích thước khoảng 1428 bp (hình 4.2), tương ứng với chiều dài lý thuyết đoạn ADN gen 6PGDvới cặp mồi 6PGD.F 6PGD.R Làn 1: marker 1kb (biobasic), 3: mẫu Hình 4.2 Kết PCR nhân đoạn gen 6PGD 4.1.2.3 Kết giải trình tự gene vi khuẩn chủng TTHSS2 Phân tích trình tự nucleoctit gene 6GPD thuộc chủng S suis type phân lập Thừa Thiên Huế nhận thấy có sai khác 14 vị trí nucleoctit so với gene 6GPD chủng S suis type Tan et al (2008b) phân lập Trung Quốc công bố ngân hàng gene (bảng 4.2) Sự sai khác đặc tính sinh học, thích nghi chủng S suis type quốc gia khác Bảng 4.2 Sự sai khác gene 6PGD vi khuẩn S Suis type phân lập với gene 6PGD vi khuẩn S Suis type ngân hàng gene Vị trí 486 574 632 1034 1039 Sai khác A-— C-T T-— C-G A-G Vị trí 1074 1093 1095 1112 1115 Sai khác C-T C-G G-T — -G C-— 14 Vị trí 1119 1123 1132 1134 Sai khác C–G T–C A-G C-T 4.1.3 Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S suis type Trong nghiên cứu này, chủng vi khuẩn TTHSS2 nuôi môi trường THB vòng giờ, tiến hànhly tâm thu cặnvi khuẩn Cặn vi khuẩn tái huyền phù với nước cất vô trùng cấy trãi lên đĩa thạch máu để đếm số khuẩn lạc Phần vi khuẩn lại bất hoạt 1% formaldehyde 37oC ngày Kết vi khuẩn TTHSS2 sau xử lý dung dịch formaldehyde 1% không mọc môi trường thạch máu Như vậy, chế tạo thành công kháng nguyên thô vi khuẩn chủng TTHSS2 để phục vụ cho trình chế tạo kháng thể kháng vi khuẩn liên cầu lợn type 4.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG S SUIS TYPE 4.2.1 Kết xác định tính sinh miễn dịch kháng nguyên Nghiên cứu cho thấy giá trị OD492 nhóm tiêm kháng nguyên cao nhiều lần so với giá trị tới hạn (Cut off = 0,180) (bảng 4.3), mẫu huyết nhóm đối chứng có giá trị OD492 thấp Bảng 4.3 Hiệu giá kháng thể chuột sau tiêm vắc xin Nhóm tiêm kháng ngun Nhóm đối chứng Chuột thí nghiệm Giá trị OD 2,321 2,333 2,256 2,455 2,232 0,135 0,159 0,143 0,122 10 0,132 Giá trị Cut off : 0,180 Mean±SD 2,391±0,087 0,138 ± 0,014 Trong q trình nghiên cứu, chuột nhóm thí nghiệm theo dõi an tồn, khơng có biểu bất thường Do khẳng định tính an toàn khả sinh đáp ứng miễn dịch cao kháng nguyên S suis type nghiên cứu 4.2.2 Kết xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả đáp ứng miễn dịch chuột SA Kết thí nghiệm kiểm tra tính sinh miễn dịch tính an tồn kháng ngun TTHSS2 cho thấy chất lượng kháng nguyên tốt, không gây bệnh, an tồn cho động thí nghiệm nên sử dụng cho thí nghiệm chế tạo kháng thể kháng TTHSS2 Kết trình bày bảng 4.4 cho thấy thấy hàm lượng kháng kháng thể nhóm cao nhiều so với hàm lượng kháng thể nhóm Giá trị 15 OD492 trung bình qua 49 ngày theo dõi nhóm tiêm kháng nguyên với hàm lượng 2x108 CFU/ chuột 2,113; nhóm 2,111 nhóm 1,890 Bảng 4.4 Ảnh hưởng liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch chuột SA Ngày lấy mẫu Nhóm 21 28 CFU/chuột 35 42 49 Trung bình Giá trịOD492 2x108 0,190 1,570 2,628 2,518 2,621 2,629 2,633 2,113a 1,5x108 0,192 1,552 2,634 2,514 2,622 2,630 2,632 2,111a 1x108 0,187 1,435 2,314 2,139 2,321 2,357 2,375 1,890b a, b: chữ khác cột biểu thị khác có ý nghĩa (Ptα/2) Tuy nhiên, khơng có sai khác hàm lượng kháng thể nhóm nhóm (|t|