KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PROTEIN

PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN 1. Khái Niệm 1.1 Protein 1.1.1 Protein là gì? Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho sự sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật chất của sự sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “thứ nhất”. Về định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau, nhưng tự chung lại, đều thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ nhiều vai trò nòng cốt trong cơ thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu cầu của các bào quan và mô trong cơ thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein được chứa trong tất cả các phần của cơ thể của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương . 1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại học Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit amin. Hiên nay đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau. Mỗi phân tử protein bao gồm rất nhiều các axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo ra hàng trăm, hàng nghìn các phân tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu hết các protein là các phân tử lớn có thể chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các ngành và các chuỗi”. Trình tự axit amin xác định cấu trúc không gian 3 chiều của protein và chức năng chuyên biệt của chúng. Có 5 loại cấu trúc không gian, ứng với 5 chức năng của Protein như sau:

1 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CẤU TRÚC PROTEIN PHẦN 1: CÁC KHÁI NIỆM CƠ BẢN 1. Khái Niệm 1.1 Protein 1.1.1 Protein là gì? Tất cả các tế bào sống đều chứa Protein, điều đó có nghĩa là protein là chất cần cho sự sống. Vì người ta cho rằng Protein là thành phần quan trọng nhất trong các vật chất của sự sống, cho nên trong tiếng anh, protein bắt nguồn từ chữ Hy Lạp có nghĩa là “thứ nhất”. Về định nghĩa chính xác Protein là gì, có nhiều cách nói khác nhau, nhưng tự chung lại, đều thống nhất cho rằng: Protein là hợp chất cao phân tử giữ nhiều vai trò nòng cốt trong cơ thể. Hầu hết chúng làm việc trong tế bào đáp ứng yêu cầu của các bào quan và mô trong cơ thể về cấu trúc, chức năng và điều hòa. Protein được chứa trong tất cả các phần của cơ thể của bạn, làn da, cơ bắp, tóc, máu, bộ phận cơ thể, đôi mắt, ngay cả móng tay và xương . 1.1.2 Cấu trúc – chức năng của Protein Theo công trình nghiên cứu :” What is protein” của Georgia C. Lauritzen thuộc đại học Utah State: “Protein được cấu tạo từ các đơn vị nhỏ hơn được gọi là các axit amin. Hiên nay đã phát hiện ra hơn 20 loại axit amin khác nhau. Mỗi phân tử protein bao gồm rất nhiều các axit amin, được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên, từ đó tạo ra hàng trăm, hàng nghìn các phân tử protein có cấu trúc khác nhau. Hầu hết các protein là các phân tử lớn có thể chứa hàng trăm axit amin được sắp xếp trong các ngành và các chuỗi”. Trình tự axit amin xác định cấu trúc không gian 3 chiều của protein và chức năng chuyên biệt của chúng. Có 5 loại cấu trúc không gian, ứng với 5 chức năng của Protein như sau: 1 2 • Kháng thể (antibody) Đây là các protein có khả năng bám vào các phân tử ngoại lai như vi khuẩn, vi rút, sau đó vô hiệu hóa chúng để bảo vệ cơ thể. Trong hình bên là cấu trúc không gian của protein kháng thể: Immunoglobulin G (lg G). • Enzyme Enzyme xúc tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong tế bào. Chúng cũng giúp đỡ hình thành những phân tử mới bằng cách đọc thông tin di truyền lưu trữ trong DNA. Vídụ hình bên: Phenylalanine hydroxylase. 2 3 • Thông tin - Messenger protein thông tin, như một số loại hormone, truyền tải tín hiệu để phối hợp các quá trình sinh học giữa các tế bào, mô, cơ quan khác nhau. Ví dụ: hormone tăng trưởng (Growth hormone) • Thành phần cấu trúc Những protein này cung cấp cấu trúc và nuôi dưỡng tế bào. Trong một phạm vi lớn hơn, chúng còn cho phép tế bào di chuyển. Ví dụ: Actin 3 4 • Vận chuyển-dự trữ các protein này bám vào những nguyên tử và phân tử nhỏ bên trong tế bào và lưu thông trong cơ thể. Ví dụ: Ferritin 1.2 Vai trò Protein trong sinh học Như đã nói ở trên, Protein có vai trò cực kỳ quan trọng trong đời sống sinh học nói chung cũng như con người nói riêng. 1.2.1 Vai trò Protein là những đại phân tử được cấu tạo theo nguyên tắc đa phân mà các đơn phân là axit amin. Chúng kết hợp với nhau thành một mạch dài nhờ các liên kết peptide (gọi là chuỗi polypeptide). Các chuỗi này có thể xoắn cuộn hoặc gấp theo nhiều cách để tạo thành các bậc cấu trúc không gian khác nhau của protein. • Protein hình thành, duy trì và thay thế các tế bào trong cơ thể. Protein chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế bào. Thiếu protein dẫn đến suy dinh dưỡng, chậm lớn, suy giảm miễn dịch, ảnh hưởng xấu đến chức năng của các cơ quan trong cơ thể. 4 5 • Protein là tham gia vào thành phần cơ bắp, máu, bạch huyết, hocmôn, men, kháng thể, các tuyến bài tiết và nội tiết. Vì vậy, protein có liên quan đến mọi chức năng sống của cơ thể (tuần hoàn, hô hấp, sinh dục, tiêu hóa, bài tiết hoạt động thần kinh và tinh thần .). • Protein cần thiết cho chuyển hóa bình thường các chất dinh dưỡng khác, đặc biệt là các vitamin và chất khoáng. Khi thiếu protein, nhiều vitamin không phát huy đầy đủ chức năng của chúng mặc dù không thiếu về số lượng. • Protein còn là nguồn năng lượng cho cơ thể, thường cung cấp 10%-15% năng lượng của khẩu phần, 1g protein đốt cháy trong cơ thể cho 4 Kcal (trong khi đó Gluxit là 4 Kcal, Lipit là 9kcal và rượu là 7kcal) • Protein kích thích sự thèm ăn và vì thế nó giữ vai trò chính tiếp nhận các chế độ ăn khác nhau. Thiếu protein gây ra các rối loạn quan trọng trong cơ thể như ngừng lớn hoặc chậm phát triển, mỡ hóa gan, rối loạn hoạt động nhiều tuyến nội tiết (giáp trạng, sinh dục), thay đổi thành phần protein máu, giảm khả năng miễn dịch sinh học của cơ thể và tăng tính cảm thụ của cơ thể với các bệnh nhiễm khuẩn. 1.2.2 Bổ sung protein cho cơ thể Sau khi được nạp vào cơ thể, trong quá trình tiêu hoá thức ăn, protein được phân huỷ tại dạ dày bởi các enzyme. Nó chuyển thành các polypeptides, cung cấp các axit amin cần thiết cho sự sống. Thành phần axit amin của cơ thể người không thay đổi và cơ thể chỉ tiếp thu một lượng các axit amin hằng định vào mục đích xây dựng và tái tạo tổ chức. Có 8 axit amin cơ thể không thể tổng hợp được hoặc chỉ tổng hợp một lượng rất ít. Đó là Lyzin, tryptophan, phenynalaninin, lơ - xin, izolơxin, valin, treonin, metionin. Người ta gọi chúng là các axit amin cần thiết. Các axit amin cần thiết này được lấy thông qua protein của thức ăn từ bên ngoài. Tuy nhiên, trong tự nhiên không có loại protein thức ăn nào có thành phần hoàn toàn giống 5 6 với thành phần axit amin của cơ thể. Do đó để đáp ứng nhu cầu cơ thể cần phối hợp các loại protein thức ăn để có thành phần axit amin cân đối nhất. Giá trị dinh dưỡng một loại protein cao khi thành phần axit amin cần thiết trong đó cân đối và ngược lại. Hầu hết thức ăn có nguồn gốc động vật và thực vất chứa đầy đủ và cân đối các thành phần của các axit amin cần thiết . Tuy nhiên, không có một loại thức ăn nào có đủ tất cả mà cần phải sử dụng một chế độ hỗn hợp nhiều loại thức ăn. Thực phẩm nguồn gốc động vật (thịt, cá, trứng, sữa) là nguồn protein quý, nhiều về số lượng, và cân đối hơn về thành phần và đậm độ axit amin cần thiết cao. Hàm lượng các axit amin cần thiết trong thực phẩm nguồn gốc thực vật (đậu tương, gạo, mì, ngô, các loại đậu khác .) không cao (trừ đậu nành); nhưng cơ thể vẫn phải bổ sung cân đối đấy đủ các loại này. Vì vậy, biết phối hợp các nguồn protein thức ăn hợp lý sẽ tạo nên giá trị dinh dưỡng cao của khẩu phần. Ví dụ gạo, ngô, mì nghèo lizin còn đậu tương, lạc, vừng hàm lượng lyzin cao, khi phối hợp gạo hoặc mì hoặc ngô với đậu tương, vừng , lạc sẽ tạo nên protein khẩu phần có giá trị dinh dưỡng cao hơn các protein đơn lẻ 2. Phân tích cấu trúc Protein 2.1 Phân tích cấu trúc Protein là gì? Như đã trình bày, mỗi một loại protein với chức năng khác nhau sẽ có một thành phần và trình tự axit amin khác nhau, cũng như cấu trúc không gian khác nhau. Chính vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra những thông tin này là vô cùng cần thiết trong sinh học. Từ các thông tin đó, chúng ta có thể biết được chính xác protein nào, có chức năng gì, để từ tìm cách tổng hợp nhân tạo protein, hay bố sung protein cần hoặc loại bỏ các protein có hại. Phân tích cấu trúc Protein chính là nhằm mục đích này. 6 7 Hiện nay, trên thế giới, công tác nghiên cứu về phân tích cấu trúc protein đang rất được đẩy mạnh. Hàng loạt các công trình nghiên cứu, các bài báo khoa học được công bố cho phép con người có cái nhìn sâu và rộng hơn về thế giới sinh học phân tử protein. Và chúng cũng được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực: y tế, nông nghiệp,… 2.2 Các phương pháp phân tích Protein, tuy được gọi là một “đại” phân tử của thế giới vi mô, tuy nhiên mắt thường của chúng ta sẽ không thể nhìn thấy chúng được. Chính vì vậy, để nghiên cứu những đối tượng này, cần sử dung những phương pháp đặc hiệu với sự trợ giúp của các phương tiện khoa học kỹ thuật hiện đại, đó cũng chính là lý do việc phân tích cấu trúc protein chỉ thực sự khởi sắc trong vài năm trở lại đây, theo sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật. Hiện nay, có nhiều phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu protein, sau đây xin giới thiệu sơ lược 2 phương pháp hữu hiệu nhất 2.2.1 Tinh thể học tia X (X-ray crystallography) William Henry Bragg (1862-1942) là người đi tiên phong trong việc phát triển phương pháp X-ray. Bragg có vô số hứng thú nghiên cứu, nhưng công trình mang lại tên tuổi cho ông là một nhà khoa học hàng đầu là tiến bộ mang tính lịch sử của ông trong tinh thể học tia X. Làm việc với người con trai, William Lawrence Bragg, ông đã phát triển một phương pháp bắn phá các tinh thể với tia X năng lượng cao phát ra bởi những ống chân không được cấu trúc đặc biệt. Khi tia X đi qua đơn tinh thể, chúng bị nhiễu xạ theo một điều kiện do cha con Bragg khám phá ra và do đó suy luận định lượng ra đường đi của chúng. Hình ảnh tia X nhiễu xạ có thể được chụp trên kính ảnh, vì tia X làm phơi sáng các hạt bạc bromide khi chúng va vào. Bằng cách khảo sát hình ảnh tia X nhiễu xạ bởi những tinh thể khác nhau, Bragg và con trai của ông đã có thể thiết lập một số mối liên hệ toán học cơ bản giữa một cấu trúc tinh thể nguyên tử và hình ảnh nhiễu xạ của nó. Với thành tựu này, , William Henry Bragg và William Lawrence Bragg được tặng Giải Nobel Vật lí năm 1915. 7 8 2.2.1.1 Sơ lược phương pháp Cách thông thường để xác định hình dáng một vật là nhìn trực tiếp vào nó. Với các vật rất nhỏ, như các phân tử, để xác định cấu trúc liên kết giữa các nguyên tử tạo nên phân tử đó, ta cần dùng kính hiển vi để phóng đại chúng lên hàng ngàn tỉ lần. Với khả năng hiện có, kính hiển vị điện tử (electron microscopes) cũng chỉ có thể phóng đại lên cỡ vài tỉ lần. Lí do là do giới hạn nhiễu xạ (diffraction limit): để có thể nhìn thấy một vật hoặc phân biệt được 2 vật điểm thì kích thước tối thiểu của vật hoặc khoảng cách tối thiểu giữa hai vật điểm lớn hơn 1/2 lần bước sóng đang sử dụng. Bước sóng của ánh sáng nhìn được vào khoảng vài trăm nanometers còn các nguyên tử thì có khoảng cách chỉ ở đơn vị hay bước sóng cần thiết để nhìn thấy các nguyên tử là bước sóng của tia X. Nhưng ta không thể tạo ra kính hiển vi tia X. Vì thế đòi hỏi ta phải dùng các kĩ thuật mang tính gián tiếp khác. Tia X khi chiếu vào tinh thể sẽ tương tác với các electron hóa tri (valence electron) của các nguyên tử thành phần được phân bố trong không gian. Các electron này sẽ tán xạ (scatter) tia X ra các hướng, tùy vào sự sắp xếp trong không gian của nguyên tử. [Cái này cũng giống như dùng một đèn pin lớn chiếu vào một cây đèn chùm (chandelier) mà ta không được phép nhìn thấy. Dù không biết cây đèn chùm hình dáng thể nào, nhưng dựa vào bóng phản chiếu (các pattern) ta cũng có thể dự đoán sự sắp xếp của các mảnh thủy tinh trên cây đèn chùm] Một màn hình sẽ ở phía sau để lưu lại ví trí tán xạ và cường độ của tia X bị tán xạ. Sau khi có các dữ liệu này rồi, người ta sẽ dùng các công thức tính toán phức tạp để xác định vị trí các electron bao quanh các nguyên tử và từ đó suy ra vị trí các nguyên tử. Các mẫu nhiễu xạ thu được sẽ có mối quan hệ với vật phát tán các sóng chiếu tới nó thông qua một phép toán biển đổi gọi là biến đổi Fourier (Fourier transform). Nếu mật độ các electron (electron density) bao quanh mỗi nguyên tử là một hàm toán học, thì mẫu nhiễu xạ tia X thu được tương ứng là biến đối Fourier của hàm đó. Với tính chất có thể biến đổi ngược của phép biến đổi Fourier, ta có thể dùng máy tính để xây dựng lại hình ảnh mật độ electron dựa vào ảnh mẫu nhiễu xạ. PDB (Protein Data Bank) lưu trữ cấu trúc protein 8 9 và các phân tử sinh học khác miễn phí sử dụng. Để hiển thị cấu trúc 3D của chúng, ta dùng phần mềm RasMol hay Pymol. Tuy nhiên, một khó khăn gặp phải là nhiễu xạ tia X từ một phân tử thì sẽ cho cường độ thu được trên ảnh rất yếu và khó phân biệt với nhiễu. Do đó, người ta sử dụng tinh thể. Tinh thể sắp xếp một lượng lớn các phân tử theo một trật tự và hướng giống nhau, nhờ thế các sóng nhiễu xạ sẽ cộng hưởng pha (ở một số hướng) làm tăng cường độ hiển thị lên máy đo. Hiển nhiên, ở một số hướng khác, các nhiễu xạ này cũng triệt từ nhau. Đó là lí do mà mẫu nhiễu xạ chỉ là mảng các điểm. Vì thế, việc tạo ra một tinh thể tốt đóng vai trò cực kì quan trọng để thu được hình ảnh có giá trị. Đó là khởi nguồn của kĩ thuật tinh thể học tia X. 2.2.1.2 Ưu – nhược điểm phương pháp Trước khi có phương pháp tinh thể học tia X: Việc tìm hiểu tinh thể là dựa vào đặc tính hình học của tinh thể. Để biết được cấu trúc 3D, người ta đo các góc của bề mặt tinh thể so với các trục tham chiếu tưởng tượng (crystallographic axes) và từ đó cho ra hình ảnh hình học có tính đối xứng của tinh thể. Hình ảnh 3D này được chiếu lên mặt phẳng dùng phép chiếu lập thể (stereographic projection) để chiếu mặt cầu lên mặt phẳng. Phép chiếu này bảo toàn góc nhưng không bảo toàn diện tích. Phương pháp tinh thể học tia X thì dựa vào máy đo góc (goniometer): Việc xác định trật tự của các nguyên tử dựa vào sự phân tích các mẫu nhiễu xạ (diffraction patterns) thu được sau khi chiếu tia X vào tinh thể các chất/phân tử cần phân tích ở dạng rắn tinh thể. Ngoài tia X, người ta còn dùng electron (electron diffraction) hoặc neutron (neutron diffraction) cho một số mục đích đặc biệt. Tinh thể học tia X (X-ray crystallography) được ứng dụng nhiều trong sinh học để xác định cấu trúc của các đại phân tử như protein, DNA hay RNA. Và các phân tử này phải được chuyển về dạng tinh thể. Lí do sử dụng tia X là vì ta không thể nhìn thấy chi tiết một vật nhỏ hơn nửa bước sóng đang sử dụng. Mà kích thước nguyên tử quá nhỏ, nên phải dùng tia X vì có bước sóng đủ ngắn để thấy được chi tiết nguyên tử. Tuy nhiên, năng lượng sóng thì tỉ lệ 9 10 nghịch với bước sóng, nghĩa là bước sóng càng ngắn thì năng lượng càng cao, càng dễ phá hỏng mẫu phân tử sinh học. Đó là lí do mà phải chuyển về dạng tinh thể để giảm sự phá hoại của tia X. Tuy nhiên việc phá hoại của tia X là vẫn không thể tránh khỏi, kết quả thu được cần được xem xét kỹ. 2.2.2 Cộng hưởng từ hạt nhân ( NMR ) Phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân được tìm ra và phát triển qua nhiều giai đoạn, đặc biệt nhờ các đóng góp của Richard R. Ernst. Năm 1966, khi làm việc chung với một đồng nghiệp người Mỹ, Ernst đã phát hiện ra rằng độ nhạy của kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân (cho đến nay chỉ giới hạn trong việc phân tích số ít hạt nhân) có thể được tăng lên đáng kể bằng cách thay thế các sóng vô tuyến quét chậm thường được dùng trong quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân thời đó bằng các xung ngắn cường độ cao. Khám phá của ông đã cho phép phân tích nhiều loại hạt nhân hơn và các số vật liệu nhỏ hơn. Đóng góp quan trọng thứ nhì của ông vào lãnh vực "phổ học cộng hưởng từ hạt nhân" là một kỹ thuật cho phép một độ phân giải cao, nghiên cứu "hai chiều" các phân tử lớn hơn so với trước đây mà quang phổ cộng hưởng từ hạt nhân đã đạt được. Với các cải tiến của Ernst, các nhà khoa học đã có thể xác định cấu trúc 3 chiều của các hợp chất hữu cơ và vô cơ và các đại phân tử sinh học như các protein; để nghiên cứu sự tương tác giữa các phân tử sinh học và các chất khác như các ion kim loại, nước, và thuốc; để xác định các loại hóa chất, và để nghiên cứu tỷ lệ của các phản ứng hóa học. Ông được trao Giải Nobel Hóa học cho công trình đóng góp của ông vào việc phát triển phổ học cộng hưởng từ hạt nhân biến đổi Fourier và sau đó việc phát triển kỹ thuật “cộng hưởng từ hạt nhân” đa chiều. Các ứng dụng nền tảng của cộng hưởng từ hạt nhân cả trong hóa học (phổ học cộng hưởng từ hạt nhân) và y học. (chụp cộng hưởng từ). 2.2.2.1 Phương pháp thực hiện Phương pháp cộng hưởng từ hạt nhân sẽ được trình bày chi tiết ở phần 2. 10