KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN

NGUYÊN TẮC VÀ MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN TS.BS Hoàng Anh Vũ Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 03 năm 2011 NỘI DUNG – MỤC TIÊU Nội dung: Các kỹ thuật khảo sát nhiễm sắc thể Các kỹ thuật khảo sát nucleic acid Các kỹ thuật khảo sát protein Mục tiêu: Nhận diện kỹ thuật tương ứng mức độ phân tử Nêu chế phân tử cách phát bất thường Liệt kê ứng dụng PCR giải trình tự DNA CHẨN ĐỐN PHÂN TỬ Cơ thể người Cơ quan/hệ thống Chẩn đốn hình ảnh Mô Giải phẫu bệnh Tế bào Giải phẫu bệnh Các phân tử sinh học (nucleic acid, protein) Sinh học phân tử CÁC KỸ THUẬT TƯƠNG ỨNG MỨC PHÂN TỬ Nhiễm sắc thể Nhiễm sắc thể đồ FISH Deoxyribonucleic acid (DNA) (+ Histone) Southern blot (DNA) Northern blot (RNA) PCR Ribonucleic acid (RNA) DNA sequencing Protein Hóa mơ miễn dịch Western blot NHIỄM SẮC THỂ ĐỒ (KARYOTYPE)  Bản đồ nhiễm sắc thể cá thể  Nam bình thường: 46,XY  Nữ bình thường: 46,XX NST ĐỒ: QUY TRÌNH KỸ THUẬT Cytokines (tủy: – ngày, máu: -3, ối: -7) Cấy tế bào Thu hoạch Thu hoạch tế bào 0.075 M KCl Cố định (Acid acetic: methanol) Chuẩn bị slide Nhuộm băng Phân tích • G-banding • Q-banding • (R, C, T, NOR) 20- 30 metaphase BẤT THƯỜNG SỐ LƯỢNG NST: HỘI CHỨNG DOWN BẤT THƯỜNG CẤU TRÚC NST: BỆNH BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY (CML) t(9:22): chuyển vị nhiễm sắc thể 22 HẠN CHẾ CỦA NST ĐỜ  Chỉ khảo sát ni cấy bệnh phẩm thành công: không phù hợp cho khảo sát bất thường mô đặc  Không phát bất thường nhỏ (độ phân giải thấp)  Tốn nhiều thời gian nhân lực FISH (fluorescence in situ hybridization)  Lai chỗ gắn huỳnh quang: lai phân tử thực tế bào mà không cần tách chiết nucleic acid khỏi tế bào  Cung cấp thơng tin xác vị trí phân bố đoạn DNA quan tâm NST nhờ mẫu dò chuyên biệt (probe) 10 ASO-PCR (Allele Specific Oligonucleotide): CHẨN ĐỐN ĐỢT BIẾN ĐIỂM 41 ĐỢT BIẾN ĐIỂM JAK2 V617F TRONG RỐI LOẠN TĂNG SINH TỦY GTC R2 F AAG -TTC R1 Wild-type (Val) Đột biến (Phe) Băng wild-type (F-R1) Băng đột biến (F-R2) 100-bp ladder Mẫu bệnh nhân Chứng âm Chứng dương 42 BẠCH CẦU MẠN DÒNG TỦY: ĐỘT BIẾN KHÁNG IMATINIB Ph(+): t(9;22) Gen tổ hợp BCR/ABL Protein p210BCR/ABL Imatinib (Glivec) Chuỗi bình thường Đột biến CAG TAC GGG GAG GTG TAC 252 253 254 255 256 257 Gln Tyr Gly Glu Val Tyr AAG Lys Nilotinib 43 (Lynch TJ, N Engl J Med 2004)  Protein EGFR tăng biểu 40-80% NSCLC (Non-small Cell Lung Cancer)  Gefitinib ức chế đặc hiệu EGFR  Chỉ 10% bệnh nhân NSCLC có đáp ứng với gefitinib 44 ĐỘT BIẾN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI 45 ĐỘT BIẾN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI • Carcinơm tuyến > carcinơm gai-tuyến • Nữ > nam • Khơng hút th́c > hút th́c • Theo chủng tộc: Âu, Mỹ: – 5% Nhật: 32% Hàn Quốc: 36.4% Đài Loan: 55% Thái Lan: 57.4% (Fukui T, Gen Thorac Cardiovasc Surg 2008)  Việt Nam: ? 46 ĐÁP ỨNG VỚI THUỐC ỨC CHẾ EGFR PHỤ THUỘC KIỂU ĐỘT BIẾN 47 KHẢO SÁT ĐỘT BIẾN EGFR VÀ K-RAS TRÊN BỆNH NHÂN VIỆT NAM UNG THƯ PHỔI KHƠNG TẾ BÀO NHỎ • MỤC TIÊU: 100 BỆNH NHÂN • ĐÃ THỰC HIỆN: 7/12 BN Wild-type Đột biến Wild-type Đột biến HĨA MƠ MIỄN DỊCH WESTERN BLOT 49 SO SÁNH CÁC KỸ THUẬT SOUTHERN, NORTHERN VÀ WESTERN BLOT 50 TÓM TẮT ỨNG DỤNG CỦA CÁC KỸ THUẬT Nhiễm sắc thể NST đồ Huyết học Chẩn đoán tiền sinh – bệnh di truyền – bẩm sinh FISH Huyết học Chẩn đoán tiền sinh – bệnh di truyền – bẩm sinh Ung thư Ung thư vú: HER2/neu Ung thư tiền liệt tuyến: TMPRSS2/ERG Ung thư bàng quang: NST 3, 7, 9, 17 51 PCR Các lĩnh vực khác (chẩn đoán) Huyết học: Vi sinh Virus: HBV, HCV, HPV, Các gen tổ hợp: Bạch cầu cấp, mạn Deletion: alpha-thalasemia Đột biến điểm JAK2 : tăng sinh tủy Ung thư Vi khuẩn: lao Ung thư tiền liệt tuyến : KST TMPRSS2/ERG 52 DNA sequencing Vi sinh Khảo sát đột biến kháng thuốc: Virus: HBV, HCV, HIV, Vi khuẩn: lao, thương hàn, sốt rét, Các lĩnh vực khác Huyết học: CML: kháng imatinib AML: FLT3, NPM1, RAS, Ung thư Breast: BRCA1, RAS, PI3KCA, NSCLC: EGFR Melanoma, thyroid: BRAF GIST: KIT, PDGFRA Colorectal: KRAS , p53 Tim mạch: Brugada syndrome (SCN5A) Idiopathic cardiac hypertrophy (sarcomere-gene mutations),Wafarin (CYP2C9, VKORC1) Sản phụ khoa: Metformin/polycystic ovary syndrome (STK11) Nội tiết Tiểu đường type (TCF7L2 polymorphisms) Di truyền: Wilson, tăng cholesterol máu, 53 Huyết học Ung thư Bệnh truyền nhiễm Nội tiết Sản phụ khoa Trung tâm Y sinh học phân tử Nhi khoa – di truyền Tim mạch Da liễu Thần kinh Dược 54 CHÚC CÁC ANH CHỊ LÀM BÀI TỐT! 55 ... exon vùng nối exon – intron • Có thể sử dụng bệnh phẩm bảo quản mô vùi nến RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR, khơng phải real time PCR): • Chỉ khảo sát exon, khơng khảo sát intron • Đặc biệt quan... kb/3.300 Mb = 1/2.000.000) Cặp mồi (primer): khoảng 18 – 25 bp Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs): Nguyên liệu cho tổng hợp chuỗi DNA Polymerase chịu nhiệt: Xúc tác phản ứng Buffer: Tạo môi... có hoạt tính sửa sai cần giải trình tự chuỗi DNA 27 PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR Real-time PCR (Quantitative PCR, Q-PCR) Điện di Tinh sản phẩm DNA sequencing A Wild-type sequence AAG GTT GTT GAG