Vậy cây An Xoa có thực sự chữa được tế bào ung thư như dân gian truyền miệng. Và thành phần mang hoạt tính chữa bệnh của cây An Xoa là gì? Chúng ta có thể tách được hoạt tính này hay không để có một hướng đi điều chế thuốc cho căn bệnh tế bào ung thư trong tương lai? Chính vì những câu hỏi trên mà nhóm chúng tôi thực hiện đề tài nghiên cứu “ Tách chiết và xác định thành phần hóa học trong cây An Xoa (Helicteres hirsuta Lour) góp phần xác minh khả năng chống ung thư của thành phần cây An Xoa.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU Tên đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC TỪ THÂN CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR) TỈNH BÌNH PHƯỚC Họ tên : LƯƠNG ÁNH HỒNG Khóa : 2016-2018 Chuyên nghành: KỸ THUẬT HÓA HỌC Mã nghành : 60520301 TP Hồ Chí Minh - Tháng 07/2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐỀ CƯƠNG NGHIÊN CỨU Tên đề tài: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG MỘT TẾ BÀO UNG THƯ CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC TỪ THÂN CÂY AN XOA (HELICTERES HIRSUTA LOUR) TỈNH BÌNH PHƯỚC CBHD : TS Hoàng Minh Hảo TS Mai Huỳnh Cang HVTH : Lương Ánh Hồng Khóa : 2016 – 2018 Chuyên nghành : KỸ THUẬT HÓA HỌC TP Hồ Chí Minh - Tháng 07/2018 MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Kế hoạch công việc Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan An Xoa 1.1 Mơ tả chung: 2.1.2 Dược tính học 11 2.1.3 Thành phần hóa học 11 2.2 Các kết nghiên cứu có 11 2.2.1 Cytotoxi Lignans từ thân An Xoa thu Indonesia 11 2.2.2 Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào HEP-G2 An Xoa (Helicteres hirsute L.) 12 2.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào 14 2.4 Phương pháp phân lập chất 15 2.4.1 Sắc ký cột 15 2.4.1.1Cơ sở lý thuyết 15 2.4.1.2 Hóa chất dụng cụ 16 2.4.1.3 Cách tiến hành 16 2.4.2 Sắc ký lớp mỏng 18 2.4.2.1 Cơ sở lý thuyết 18 2.4.2.2 Hóa chất dụng cụ 18 2.4.2.3 Cách tiến hành 18 2.4.2.4 Sắc ký lớp mỏng điều chế 19 2.4.2.5 Hiện hình vết sau giải ly 19 2.5 Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất sau cô lập 20 2.5.1 Phổ hồng ngoại (IR) 20 2.5.2 Phổ NMR 20 2.5.2.1 Phổ 1H-NMR 21 2.5.2.2 Phổ 13C-NMR 21 Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Hóa chất, thiết bị 22 3.2 Phương pháp nghiên cứu 23 3.2.1 Phương pháp ly trích cô lập hợp chất hữu từ thân An Xoa 23 3.2.1.1 Điều chế cao etanol thân 23 3.2.1.2 Điều chế loại cao từ cao etanol thân 23 3.2.1.3 Cô lập hợp chất cao etanol thân 24 Chương 4: THỰC NGHIỆM 25 4.1 Ly trích cô lập hợp chất từ thân An Xoa 25 4.1.1 Xử lý mẫu 25 4.1.2 Điều chế cao etanol 25 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Bảng kết khảo sát khả chống tế bào ung thư từ cao MeOH thân An Xoa 12 Bảng 2.2: Bảng kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư) bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether (PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH) 13 Sơ đồ 3.1: Qui trình điều chế cao etanol thân Cây An Xoa - Helicteres hirsuta Lour 23 Sơ đồ 3.2: Qui trình điều chế loại cao từ cao etanol (EOH) thân Cây An Xoa - Helicteres hirsuta Lour 24 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.2: Cây tổ kén hoa trắng (tên khoa học: Helicteres viscida Blume) .9 Hình 2.5: Cây tổ kén tròn (tên khoa học: Helicteres isora L.) 10 Hình 2.3: Cây tổ kén không lông (tên khoa học: Helicteres glabriuscula Wall.) 10 Hình 2.6: Cây An Xoa (Helicteres hirsuta Lour.) 10 Hình 2.4: Cây tổ kén mác (tên khoa học: Helicteres lanceolata DC.) 10 Hình 2.7: Các lignans tách từ an xoa thu Indonesia 11 Hình 2.8: Cấu trúc hợp chất HD09 (stigmasterol) 13 Hình 2.9: Cấu trúc hợp chất HD02 (lupeol) 13 Hình 2.10: Cấu trúc hợp chất HD08 (apigenin) 14 Hình 2.11: Cấu trúc hợp chất HD01 (tiliroside) .14 Hình 4.1: Kết SKLM cao etanol thân An Xoa 25 Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay, bên cạnh phát triển kinh tế xã hội nhanh đến chóng mặt phát sinh thêm bệnh nguy hiểm Trong đó, ung thư bệnh nguy hiểm việc chữa trị khó khăn, chưa có Phương thuốc điều trị hồn toàn Nhờ vào phát triển y học sinh học phân tử mà người ta biết rõ bệnh ung thư nhiều nguyên nhân gây nên Một tác nhân gây ung thư gây số loại ung thư ngược lại loại ung thư nhiều nguyên nhân khác gây Ung thư xảy đột biến DNA, làm tế bào tăng sinh vô hạn độ, vô tổ chức, khơng tn theo chế kiểm sốt phát triển thể Đặc điểm tế bào ung thư nhân lên mà khơng cần chất điều hồ sinh trưởng tế bào bình thường cần phải có chúng trơ với tín hiệu chết theo chương trình tế bào bình thường (apoptosis) Tại Việt Nam, dân gian bệnh nhân tế bào ung thư truyền tai thuốc dại có khả chữa trị bệnh ung thư mang tên An Xoa Một loài mọc dại khu vực cận đồi, đất khơ Bình Phước, Lâm Đồng… Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu cụ thể xác minh dược tính học loài khả chữa bệnh tế bào ung thư dân gian truyền miệng Người bệnh cầu trực vào thuốc dân gian với hy vọng mong manh đường họ sống Vậy An Xoa có thực chữa tế bào ung thư dân gian truyền miệng Và thành phần mang hoạt tính chữa bệnh An Xoa gì? Chúng ta tách hoạt tính hay khơng để có hướng điều chế thuốc cho bệnh tế bào ung thư tương lai? Chính câu hỏi mà nhóm chúng tơi thực đề tài nghiên cứu “ Tách chiết xác định thành phần hóa học An Xoa (Helicteres hirsuta Lour) góp phần xác minh khả chống ung thư thành phần An Xoa 1.2 Mục đích đề tài Tách chiết hợp chất hóa học có An Xoa Xác định cấu trúc hợp chất hóa học tách Thử nghiệm hoạt tính sinh học phân đoạn cao hợp chất tinh khiết tế bào ung thư 1.3 Nội dung đề tài Khảo sát quy trình trích ly hợp chất hóa học từ An Xoa Cơ lập chất hóa học thu từ cao An Xoa Xác định công thức cấu trúc hợp chất hóa học lập từ An Xoa Khảo sát hoạt tính sinh học phân đoạn cao hợp chất hóa học lập từ An Xoa tế bào ung thư 1.4 Kế hoạch công việc STT 01 Nội dung công việc Đọc tài liệu định hướng Viết đề cương NCKH, khảo sát nguyên liệu Thời gian Tháng 7/2018 02 Làm thí nghiệm điều chế cao etanol Tháng 8/2018 03 Điều chế loại cao từ cao etanol 04 Cô lập hợp chất hữu Tháng 9/2018 Từ tháng 10/2018 đến tháng 1/2019 05 Thử hoạt tính sinh học chụp loại phổ hợp chất lập Tháng 2/2019 06 Giải đốn cấu trúc viết luận văn Từ tháng 3/2019 đến tháng 4/2019 Địa điểm làm đề tài nghiên cứu: Phòng thí nghiệm BM CNHH, TRƯỜNG ĐH NƠNG LÂM TP HCM Và phòng thí nghiệm KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC VÀ THỰC PHẨM, TRƯỜNG ĐH SƯ PHẠM KỸ THUẬT 3.2 Dự kiến kinh phí STT MỤC CẦN KINH PHÍ Giá (vnd) 01 Các hóa chất liên quan Chụp loại phổ, thử hoạt tính sinh học Dụng cụ thiết bị Khoảng triệu Tổng 12 triệu 02 03 triệu triệu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan An Xoa Tên khoa học: Helicteres hirsuta Lour Tên gọi Việt Nam: Dó lơng, tổ kén cái, an xoa Họ: Trôm – Sterculiaceae Một số loại họ: Tổ kén (tên khoa học: Helicteres angustifolia L.), tổ kén hoa trắng (tên khoa học: Helicteres viscida Blume), Tổ kén không lông (tên khoa học: Helicteres glabriuscula Wall.), tổ kén mác (tên khoa học: Helicteres lanceolata DC.), tổ kén tròn (tên khoa học: Helicteres isora L.), 1.1 Mô tả chung: Thân: Cây bụi cao - 3m; nhánh hình trụ, có lơng Lá: Hình trái xoan dài - 17cm, rộng 2.5 - 7.5cm, gốc cụt hay hình tim, đầu nhọn thành mũi nhọn, mép có khơng đều, mặt màu trắng, hai mặt phủ đầy lơng hình sao; gân gốc 5, cuống dài từ 0.8 - 4cm; kèm hình dải, có lơng dễ rụng Hoa: cụm hoa ngắn, đơn hay xếp đôi nách Hoa màu hồng hay đỏ; cuống hoa có khớp có bắc dễ rụng; đài hoa hình ống phủ lơng hình màu đo đỏ, chia răng; cánh hoa 5; cuống nhị có vân đỏ; nhị 10, nhị lép nhị; bầu có nhiều gợn, chứa 25 - 30 màu noãn Quả nang hình trụ nhọn; hạt nhiều hình lăng trụ Ra hoa2.2: kết đến mùa Hình Câytừtổmùa kénhạhoa trắngđơng Hình Nơi 2.1: sống Cây tổ thu kénhái: (Helicteres phân bố ở(tên namkhoa Trunghọc: Quốc nhiềuviscida nước Nam Helicteres angustifolia L.) ta, an xoa mọc nhiều Blume) Châu Á Ở nước Bình Phước, Lâm Đồng, Hòa Bình , Hình 2.4: Cây tổ kén mác (tên Hình 2.3: Cây tổ kén không lông Điện Biên, Sơn La, Phú Thọ, khoa học: Helicteres lanceolata (tên khoa học: Helicteres DC.) glabriuscula Wall.) 2.1.2 Dược tính học Cây An Xoa thường mọc dại số vùng đất cao Hiện chưa có tài liệu cơng bố dược tính 2.1.3 Thành phần hóa học Trên giới có nghiên cứu thành phần hóa học An Xoa Tuy nhiên, An Xoa Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học 2.2 Các kết nghiên cứu có 2.2.1 Cytotoxi Lignans từ thân An Xoa thu Indonesia Theo nghiên cứu Indonesia [1] thành phần An Xoa có khả chống lại tế bào ưng thư, đặc biệt tế bào ung thư Nghiên cứu hợp chất tách từ cao chiết thân An Xoa sau: 1: 2: 3: R1 OMe OMe OMe R2 H OMe OMe R3 H H OMe R4 OMe OMe OMe 1: 2: 3: R1 Feruloyl Feruloyl H R2 feruloyl H H Hình 2.7: Các lignans tách từ an xoa thu Indonesia Nhóm nghiên cứu khảo sát khả chống lại tế bào ung thư từ cao MeOH thân An Xoa với loại tế bào ung thư: Lu1 (tế bào ung thư biểu mô phổi người), LNCaP (tế bào ung thư tuyến tiền liệt), MCF-7 (ung thư vú), HUVEC (tế bào nội mô tĩnh mạch) 10 Bảng 2.1: Bảng kết khảo sát khả chống tế bào ung thư từ cao MeOH thân An Xoa 2.2.2 Khảo sát thành phần hóa học hoạt tính gây độc tế bào HEP-G2 An Xoa (Helicteres hirsute L.) Nhóm tác giả Nguyễn Hữu Duyên Lê Thanh Phước đăng tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ (2016) [2] thành phần cao chiết từ thân, hoa An Xoa thu Hòn Sơn thuộc xã Lại Sơn, huyện Kiên Hải, tỉnh Kiên Giang Nghiên cứu khảo sát hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư) bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether (PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH) Kết có hai cao có biểu hoạt tính gây độc với dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư) cao PE cao DC Từ cao DC cô lập hợp chất: stigmasterol, lupeol, apigenin tiliroside Cấu trúc hóa học hợp chất xác định phương pháp phổ (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) 11 Bảng 2.2: Bảng kết khảo sát hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào HepG2 (tế bào ung thư) bốn phân đoạn cao khác nhau: petroleum ether (PE), dichloromethane (DC), ethyl acetate (EA), methanol (MeOH) Hình 2.8: Cấu trúc hợp chất HD09 (stigmasterol) Stigmasterol sử dụng phòng ngừa khối u kháng oxy hóa Ngồi ra, stigmasterol có tiềm chữa viêm xương khớp [2] Hình 2.9: Cấu trúc hợp chất HD02 (lupeol) 12 Lupeol tiêu diệt ngăn chặn lan truyền tế bào ung thư Hợp chất lupeol có khả gây độc tế bào với dòng tế bào tế bào ung thư (Hep-G2) [2] Hình 2.10: Cấu trúc hợp chất HD08 (apigenin) Apigenin có khả chống viêm, chống oxy hóa ngăn ngừa ung thư [2] Hình 2.11: Cấu trúc hợp chất HD01 (tiliroside) Tiliroside hợp chất tự nhiên có khả kháng oxy hóa kháng viêm, thử nghiệm in vitro in vivo cho kết tốt [2] 2.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính sinh học hợp chất tinh khiết cô lập từ thân An Xoa tế bào ung thư thực Khoa Khoa học, Đại học Y Dược TP HCM Tiến 13 hành thử nghiệm hoạt tính sinh học tế bào ung thư Phương pháp Sulforhodamine B (SRB) Môi trường McCoy’s 5A từ Gibco BRL (Đan Mạch) huyết (FBS) từ Seromed (Đức) Chất chuẩn resveratrol, dimetylsulfoxid (DMSO), Sulforhodamine B (SRB), acid tricloroacetic (TCA) propidium iodua mua từ Sigma-Aldrich (Đan Mạch) Tris-base acid acetic mua từ hang Merck Tế bào ung thư ni cấy bình Roux đạt độ phủ 80-90% Huyền phù để tách lớp đơn tế bào Đếm phủ tế bào vào đĩa 96 giếng với mật độ 10000 tế bào/ giếng, tiến hành ủ 24h, 37 oC, 5% CO2 Thêm chất cần thử với nồng độ khác (chất chứng dương resveratrol), tiếp tục ủ 48h, 37 oC, 5% CO2 Cố đinh tế bào TCA 50%, đặt vào tủ oC 1h sau rửa lần với nước Nhuộm SRB thời gian 20 phút nhiệt độ phòng Rửa lần với acid acetic 1%, hòa tan SRB gắn 10nM Tris-base, lắc máy 10 phút, đọc kết bước song 492 620 nm Xử lý số liệu phần mềm Microsoft Excel 14 ... 01 Các hóa chất liên quan Chụp loại phổ, thử hoạt tính sinh học Dụng cụ thiết bị Khoảng triệu Tổng 12 triệu 02 03 triệu triệu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan An Xoa Tên khoa học: Helicteres... MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG DANH SÁCH CÁC HÌNH Chương 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích đề tài 1.3 Nội dung đề tài 1.4 Kế hoạch công việc Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan An Xoa 1.1... học An Xoa Tuy nhiên, An Xoa Việt Nam nghiên cứu thành phần hóa học 2.2 Các kết nghiên cứu có 2.2.1 Cytotoxi Lignans từ thân An Xoa thu Indonesia Theo nghiên cứu Indonesia [1] thành phần An Xoa