NGHIÊN cứu mối LIÊN QUANGIỮA đa HÌNH KIỂU GEN MTHFR c677t với mật độ XƯƠNG và NGUY cơ gãy XƯƠNG đốt SỐNG ở PHỤ nữ mãn KINH

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THANH TÙNG NGHI£N CøU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY XƯƠNG ĐốT SốNG ë PHơ N÷ M·N KINH LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYN THANH TNG NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY XƯƠNG ĐốT SốNG PHụ Nữ MãN KINH Chuyên ngành: Sinh Lý Học Mã số: 62720405 LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Huy Bình TS Nguyễn Thị Thanh Hương HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập tiến hành nghiên cứu, giúp đỡ tận tình từ thầy giáo, bạn đồng nghiệp, từ quan người thân gia đình Hồn thành luận văn này, cho phép tơi bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Bình, TS Nguyễn Thị Thanh Hương, người thầy, người cô, người hướng dẫn khoa học, tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt q trình làm luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc Tập thể cán nhân viên Khoa khám bệnh - Bệnh viện Bạch Mai, Khoa xương khớp – Bệnh viện Bạch Mai, Trung tâm Gen Ứng dụng - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ thực nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Nghiên cứu Y Học Đinh Tiên Hoàng tạo điều kiện cho tham gia vào đề tài: “Xác định tính đa hình nhạy cảm gen gây loãng xương gãy xương người Việt Nam” mã số 106 – YS.03-2013.33 Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, thầy cô giáo Trường Đại học Y Hà Nội nói chung thầy giáo Bộ mơn Sinh lý học nói riêng tạo điều kiện thuận lợi nhiệt tình giảng dạy truyền đạt kiến thức q báu cho tơi q trình học tập, nghiên cứu làm luận văn tốt nghiệp Cuối xin chân thành cảm ơn bạn bè đồng nghiệp, gia đình, người thân động viên, chia sẻ giúp đỡ tơi q trình học tập Hà Nội, ngày tháng Học viên năm 2017 Nguyễn Thanh Tùng LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thanh Tùng, học viên Bác sĩ nội trú khóa 40 chuyên ngành Sinh lý học, xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn TS Nguyễn Huy Bình, TS Nguyễn Thị Thanh Hương Cơng trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp nhận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thanh Tùng DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BMD Bone Mineral Density (mật độ xương) BMI Body Mass Index (chỉ số khối thể) ĐTXĐ Đầu xương đùi CXĐ Cổ xương đùi CSTL Cột sống thắt lưng DNA Deoxyribonucleic acid F Forward primer Hcy Homocystein MTHFR Methylen Tetrahydrofolat Reductase MĐX Mật độ xương Rw Reverse wild type primer Rm Reverse mutation primer SNP Single nucleotide polymorphism MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan gãy xương đốt sống .3 1.1.1 Định nghĩa .3 1.1.2 Dịch tễ học gãy xương đốt sống loãng xương 1.1.3 Chẩn đoán gãy xương đốt sống lỗng xương 1.1.4 Chẩn đốn xác định loãng xương 10 1.1.5 Cơ chế bệnh sinh loãng xương gãy xương loãng xương 12 1.1.6 Gen liên quan đến loãng xương gãy xương .17 1.2 MTHFR (Methylene Tetrahydrofolate Reductase) 18 1.2.1 Tổng quan MTHFR 18 1.2.2 Vị trí cấu trúc gen MTHFR .18 1.2.3 Cấu trúc chức protein MTHFR 18 1.2.4 Đa hình gen MTHFR 20 1.2.5 SNP rs1801133 - C677T - Ala222Val 21 1.2.6 Các nghiên cứu MTHFR C677T tương quan với mật độ xương nguy gãy xương 23 1.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử phân tích vị trí đa hình kiểu gen C677T 24 1.3.1 Kỹ thuật PCR 25 1.3.2 Phương pháp ARMS–PCR (Amplification refractory mutation system) 26 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .29 2.1 Đối tượng nghiên cứu .29 2.1.1 Nhóm bệnh 29 2.1.2 Nhóm chứng 30 2.2 Thiết kế nghiên cứu cỡ mẫu 30 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu .30 2.2.2 Cơng thức tính cỡ mẫu 30 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 31 2.3.1 Thời gian nghiên cứu: Từ tháng năm 2016 đến tháng năm 2017 .31 2.3.2 Địa điểm nghiên cứu .31 2.4 Quy trình nghiên cứu 31 2.5 Các phương pháp công cụ thu thập số liệu 32 2.5.1 Quy trình lấy máu bảo quản .32 2.5.2 Đánh giá gãy xương đốt sống X Quang 33 2.6 Các bước tiến hành phân tích gen 33 2.6.1 Tách DNA .33 2.6.2 Qui trình xác định kiểu gen ARMS-PCR .33 2.6.3 Phương pháp giải trình tự gen .36 2.7 Các biến số nghiên cứu 37 2.8 Phân tích xử lý số liệu 38 2.9 Đạo đức nghiên cứu 38 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .39 3.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu 39 3.1.1 Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 39 3.1.2 Đặc điểm mật độ xương đối tượng nghiên cứu 40 3.1.3 Đặc điểm gãy xương đối tượng nghiên cứu 40 3.2 Xác định đa hình kiểu gen MTHFR C677T 42 3.2.1 Kết tách chiết DNA 42 3.2.2 Kết xác định kiểu gen MTHFR C677T phương pháp ARMS PCR 44 3.2.3 Kết quảxác định kiểu gen MTHFR C677T phương phápgiải trình tự gen 45 3.2.4 Phân bố kiểu gen tần số alen đa hình MTHFR C677T đối tượng nghiên cứu 46 3.3 Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống đối tượng nghiên cứu 47 3.3.1 Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ xương đối tượng nghiên cứu 47 3.3.2 Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống đối tượng nghiên cứu .49 3.3.3 Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với số đặc điểm đối tượng nghiên cứu 49 3.3.4 Mối liên quan gãy xương yếu tố ảnh hưởng mơ hình hồi quy đa biến nhị phân logistic 53 Chương 4: BÀN LUẬN 54 4.1 Đặc điểm đối tượng nghiên cứu .54 4.2 Tỷ lệ kiểu gen MTHFR C677T kĩ thuật ARMS PCR 57 4.2.1 Bàn luận xác định kiểu gen MTHFR C677T kĩ thuật ARMS PCR .57 4.2.2 Phân bố tần số alen đa hình kiểu gen MTHFR C677T nghiên cứu so với tần số người Việt Nam nước khác 58 4.2.3.Tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T phụ nữ mãn kinh Việt Nam .59 4.3 Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống loãng xương 60 4.3.1.Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống loãng xương .60 4.3.2 Mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T yếu tố nguy ảnh hưởng đến gãy xương đốt sống loãng xương 64 4.4 Dự phòng gãy xương đốt sống 65 4.5 Điểm mạnh, điểm yếu nghiên cứu .69 KẾT LUẬN 70 KIẾN NGHỊ 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Giá trị tham chiếu thang định lượng người Việt Nam 10 Bảng 1.2 Tiêu chuẩn chẩn đốn lỗng xương WHO 11 Bảng 1.3 Mật độ xương đỉnh trung bình (g/cm2) quần thể phụ nữ Việt Nam đo máy Hologic .12 Bảng 1.4 Vị trí kiểu đa hình gen MTHFR .20 Bảng 1.5 Bảng phân bố tần số đa hình kiểu gen MTHFR C677T giới 21 Bảng 2.1 Thành phần phản ứng PCR 34 Bảng 2.2 Trình tự chuỗi DNA mồi 35 Bảng 2.3 Các biến số nghiên cứu 37 Bảng 3.1.Đặc điểm chung đối tượng nghiên cứu 39 Bảng 3.2 Đặc điểm mật độ xương đối tượng nghiên cứu 40 Bảng 3.3 Đặc điểm vị trí, hình thái gãy xương X-Quang nhóm bệnh nhân gãy xương 41 Bảng 3.4 Kết đo nồng độ độ tinh DNA 42 Bảng 3.5 Nồng độ DNA độ tinh trung bình 44 Bảng 3.6.Phân bố kiểu gen tần số alen đa hình C677T gen MTHFR đối tượng nghiên cứu 46 Bảng 3.7 Mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ xương cổ xương đùi đối tượng nghiên cứu 47 Bảng 3.8 Mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với mật độ xương đầu xương đùi đối tượng nghiên cứu .48 Bảng 3.9 Mốiliên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới mật độ xương cột sống thắt lưng đối tượng nghiên cứu .48 Bảng 3.10 Mối liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677Tvới gãy xương đối tượng nghiên cứu 49 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Xiumei Hong, Yi-Hsiang Hsu, and Xu, Xiping (2006), "Association of the methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism and fracture risk in Chinese postmenopausal women", Bone 40 40, pp 737742 Wang H and Liu C., (2012), "Association of MTHFR C667T polymorphism with bone mineral density and fracture risk: an updated meta-analysis", Osteoporos Int 23, pp 2625-2634 Guan J.Z and Wu M., (2014), "MTHFR C677T polymorphism and osteoporotic fracture in postmenopausal women: a meta-analysis", Genetics and Molecular Research 13(3), pp 7356-7364 Shepherd A., Cass A., and Ray L., (2012), "Treatment for older men with fractures", Osteoporosis international 23(3), pp 1041-1051 Jane A Cauley and Lisa Palermo, (2008), "Prevalence vertebral fractures in Black woman and White woman", JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH 23(9), p 2008 Meunier P J., Roux C., and Seeman E., (2004), "The effects of strontium ranelate on the risk of vertebral fracture in women with postmenopausal osteoporosis", New England Journal of Medicine 350(5), pp 459-468 Genant H K., Wu C Y., and van Kuijk C., (1993), "Vertebral fracture assessment using a semiquantitative technique", Journal of Bone and Mineral Research 8(9), pp 1137-1148 Adams, Judith E., Lenchik, Leon, and Christian Roux et al, (2011), "Vertebral fracture initiative Part II: Radiological assessment of vertebral fracture" Kanis J.A., (1994), "The diagnosis of osteoporosis", J Bone Miner Res 9, pp 1137-1141 H T T Nguyen., B von Schoultz., and T V Nguyen, (2009), "Peak bone mineral density in Vietnamese women", Arch Osteoporos 4, pp 9-15 Yang SO., (2006), "Normative study on bone mineral density in a Korean women using DXA" L A McNutt, (2003), "Estimating the relative risk in cohort studies and clinical trials of common outcomes", Am J Epidemiol 157(10), pp 940-943 M Kaneki, (2001), "Japanese fermented soybean food as the major determinant of the large geographic difference in circulating levels of vitamin K2: possible implications for hip-fracture risk", Nutrition 17(4), pp 315-321 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 M J Henry and Pasco JA., (2004), "Reference ranges for bone densitometers adopted Aus-tralia-wide:Geelong osteoporosis study", Autralas Radiol 48, pp 473-475 F Betoldo, S Adami, and M.L Brandi, (2009), "Guidelines for the diagnosis, prevention and treatment of osteoporosis", Reumatismo 61(4), pp 260-284 Burger EH., Aarden EM., and Nijweide PJ., (1994), "Function of osteocytes in bone", J Cell Biochem 55(3), pp 287-299 Baud CA., (1968), "Submicroscopic structure and functional aspects of the osteocyte", Clin Orthop Relat Res 56, pp 227-236 Pacifici R., (1991), "Effect of surgical menopause and estrogen replacement on cytokine release from human blood mononuclear cells", Proc Natl Acad Sci USA 88(12), pp 5134-5138 Takahashi N., Udagawa N., and Akatsu T., (1990), "Origin of osteoclasts: mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells", ProcNatl Acad Sci USA 87(18), pp 7260-7264 Kuiper G G., van den Bemd G J., and van Leeuwen J P., (1999), "Estrogen receptor and the SERM concept", J Endocrinol Invest 22(8), pp 594-603 Bord S., (2001), "Estrogen receptors alpha and beta are differentially expressed in developing human bone", J Clin Endocrinol Metab 86(5), pp 2309-2314 Vedi S., (1999), "Bone remodeling and structure in postmenopausal women treated with long-term, high-dose estrogen therapy", Osteoporos Int 10(1), pp 52-58 International Menopause Society, " Menopause Terminology" Bendixen AC., Huber DM., and Pathrose P., (2001), "Androgens suppress osteoclast fomation induced by RANK and macrophagecolony stimulating factor", Endocrinology 142, pp 3800-3808 Vandenput L., Vanderschueren D., and Boonen S., (2004), "Androgens and bone", Endocr Rev 25, pp 389-425 Nguyen H T., (2014), "Sex hormone levels as determinants of bone mineral density and osteoporosis in Vietnamese women and men", J Bone Miner Metab Hồ Phạm Thục Lan Nguyễn Văn Tuấn, (2011), "Sinh lý học lỗng xương", Tạp chí Thời y học, p 62 Ralston S.H and Uitterlinden A.G., (2010), "Genetics of osteoporosis", Endocr Rev 31(5), pp 629-662 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Goyette P., Sumner JS., and Milos R., (1994), "Human methylenetetrahydrofolate reductase: isolation of cDNA, mapping and mutation identification", Nature Genetics 7(2), pp 195-200 Goyette P., Frosst P., and Rosenblatt DS., (1995), "Seven novel mutations in the methylenetetrahydrofolate reductase gene and genotype/phenotype correlations in severe MTHFR deficiency", Am J Hum Genet 56, pp 1052 - 1059 Wen-Xing Li, (2015), "Homocysteine Metabolism Gene Polymorphisms (MTHFR C677T, MTHFR A1298C, MTR A2756G and MTRR A66G) Jointly Elevate the Risk of Folate Deficiency", Nutrients 7, pp 6670-6687 Brambila-Tapia Aniel Jessica Leticia (2012), "MTHFR C677T, MTHFR A1298C, and OPG A163G polymorphisms in Mexican patients with rheumatoid arthritis and osteoporosis", Disease Markers 32, pp 109-114 Linnebank M., Homberger A., and Nowak-Goettl U., (2000), "Linkage disequilibrium of the common mutation 677C→T and 1298A→C of the human methylenetetrahydrofolate reductase gene as proven by the novel polymorphisms 129C→T, 1068C→T", Eur J Ped 159, pp 472 473 Rosenberg N., Murata M., and Ikeda Y., (2002), "The frequent 5,10methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism is associated with a common haplotype in Whites, Japanese, and Africans", Am J Hum Genet 70, pp 758 - 762 Frosst P., Blom H.J., and Milos R., (1995), "A candidate genetic risk factor for vasc ular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase", Nat Genet 10, pp 111 - 113 Goyette P., Christensen B., and Rosenblatt DS., (1996), "Severe and mild mutations in cis for the methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) gene, and description of novel mutations in MTHFR", Am J Hum Genet 59, pp 1268 - 1275 Viel A., Dall'Agnese L., and Simone F., (1997), "Loss of heterozygosity at the 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase locus in human ovarian carcinomas", Br J Cancer 75, pp 1105 - 1110 Weisberg I., Tran P., and Christensen B., (1998), "A second genetic polymorphism in methylenetrahydrofolate reductase (MTHFR) associated with decreased enzyme activity", Mol Genet Metabol 64, pp 169 - 172 Rady PL., Szucs S., and Grady J., (2002), "Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) and methionine 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 synthase reductase (MTRR) in ethnic populations in Texas: A report of a novel MTHFR polymorphic site, G1793A", Am J Med Genet 107(162 - 168) Xingmin Wang, (2016), "Geographical and Ethnic Distributions of the MTHFR C677T, A1298C and MTRR A66G Gene Polymorphisms in Chinese Populations: A Meta-Analysis", PLOS ONE, pp 1-20 Wilcken B., Bamforth F., and Li Z., (2003), "Geographical and ethnix variation of the 677T>C allene of 5, 10 meththylenetetrahydrofolat reductase (MTHFR): findings from over 7000 newborns from 16 areas worldwide", J Med Genet 40, pp 619 - 625 Schneider J A., Rees D C., and Liu Y T., (1998), "Worldwide distribution of a common MTHFR mutation", Am J Hum Genet 62, pp 1258 - 1260 Sadewa A., Sunarti H., and Sutomo R., (2002), "The C677T mutation in he MTHFR gene among the indonesia Javanese populoation", Kobe J Med Sci 8, pp 137 - 144 Hegete R A., Tully C., and Young T K., (1997), "677T mutation of MTHFR and cardiovascular disease in Canada Inuit", Lancet 349, pp 1221 - 1222 Bruno Zappacosta., Mirella Graziano., and Silvia Persichilli, (2014), "5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T and A1298C polymorphisms: genotype frequency and association with homocysteine and folate levels in middle-southern Italian adults", Cell Biochem Funct 32, pp 1-4 Grieco AJ., (1977), "Homocystinuria: pathogenetic mechanisms", Am J Med Sci 273, pp 120-132 Roman Thaler., Marlies Agsten., and Franz Varga, (2011), "Homocysteine Suppresses the Expression of the Collagen Cross-linker Lysyl Oxidase Involving IL-6, Fli1, and Epigenetic DNA Methylation", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 286(7), pp 55785588 Abrahamsen B., Madsen JS., and Tofteng CL., (2003), "A common methylenetetrahydrofolate reductase (C677T) polymorphism is associated with low bone mineral density and increased fracture incidence after menopause: longitudinal data from the Danish osteoporosis prevention study", J Bone Miner Res 18, pp 723-729 Robert R McLean, David Karasik, and Douglas P Kiel, (2004), "Association of a Common Polymorphism in the Methylenetetrahydrofolate Reductase (MTHFR) Gene With Bone 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 Phenotypes Depends on Plasma Folate Status", JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH 19(3) Villadsen MM., Bunger MH., and Carstens M., (2005), "Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism is associated with osteoporotic vertebral fractures, but is a weak predictor of BMD", Osteoporos Int 16, pp 411-416 Zhu K., Beilby J., and Prince R L., (2008), "The effects of homocysteine and MTHFR genotype on hip bone loss and fracture risk in elderly women", Osteoporos Int 20, pp 1183-1191 Masataka Shiraki, Tomohiko Urano, and Satoshi Inoue, (2008), "The synergistic effect of bone mineral density and methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphism (C677T) on fractures", J Bone Miner Metab 26, pp 595-602 Lı'dia Agueda., Roser Urreizti., and Mariona Bustamante, (2010), "Analysis of Three Functional Polymorphisms in Relation to Osteoporosis Phenotypes: Replication in a Spanish Cohort", Calcif Tissue Int 87, pp 14-24 Valero C., (2006), "MTHFR C677T Polymorphism and Osteoporotic Fractures", Horm Metab Res 39, pp 543-547 Tạ Thành Văn, (2010), "PCR số kỹ thuật sinh học phân tử", Nhà xuất y học Little S., (2001), "Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations.", Curr Protoc Hum Genet 9, pp 10-15 Keat Wei Loo., Lyn Robyn Griffiths., and Siew Hua Gan, (2012), "A novel multiplex PCR-RFLP method for simultaneous detection of the MTHFR 677 C > T, eNOS +894 G > T and - eNOS -786 T > C variants among Malaysian Malays", BMC Medical Genetics, pp 13-34 Ho-Pham L T., Nguyen U D., and Pham H N., (2011), "Reference ranges for bone mineral density and prevalence of osteoporosis in Vietnamese men and women BMC musculoskeletal disorders" 12(1), p Ho-Pham L T., Nguyen S C., and Tran B., (2015), "Contributions of Caucasian-associated bone mass loci to the variation in bone mineral density in Vietnamese population", Bone 76, pp 18-22 Eastel R., Cedel S L., and Wahner H W., (1991), "Classification of vertebral fractures", Journal of Bone and Mineral Research (3), pp 207-215 Waterloo S., Ahmed L A., and Center J R., (2012), "Prevalence of vertebral fractures in women and men in the population-based Tromso Study ", BMC musculoskeletal disorders 13(1), p 74 75 76 77 78 79 80 81 Miller D., Bryant J., and Madsen E., (1999), "Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil andsediment samples ", Applied and environmental microbiology 65 (11), pp 4715-4724 WHO (2004), "Laboratory biosafety manual" Rui Bai, Wanlin Liu, and Aiqing Zhao, (2013), "Quantitative assessment of the associations between MTHFR C677T and A1298C polymorphisms and risk of fractures: a meta-analysis", Mol Biol Rep 40, pp 2419 - 2430 Martina Huemer, (2017), "Guidelines for diagnosis and management of the cobalamin-related remethylation disorders cblC, cblD, cblE, cblF, cblG, cblJ and MTHFR deficiency", J Inherit Metab Dis 40, pp 21-48 Trần Thị Tô Châu, (2002), Nghiên cứu số biểu lâm sàng xương khớp đo mật độ xương gót siêu âm phụ nữ mãn kinh Hà Nội, Trường Đại học Y Hà Nội Ehsanbakhsh A R., Akhbari H., and Iraee M B., (2011), "The prevalence of undetected vertebral fracture in patients with back pain by dual-energy X-ray absorptiometry (DXA) of the lateral thoracic and lumbar spine.", Asian spine journal 5(3), pp 139-145 Maša Vidmar, Alenka Šmid, and Nataša Karas-Kuželički, (2017), "The influence of folic acid and 5-methyltetrahydofolate on the metabolic activity depending on changes in the folate cycle genes", Department of Obstetrics and Gynecology, Universery Medical Centre Ljubljana, Slovenia Jacob Joseph and Joseph Loscalzo, (2013), "Methoxistasis: Integrating the Roles of Homocysteine and Folic Acid in Cardiovascular Pathobiology", Nutrients 5(8), pp 3235 - 3256 BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU “Xác định liên quan đa hình kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống loãng xương phụ nữ mãn kinh” Bộ câu hỏi sàng lọc 1.1 Thông tin STT Câu hỏi Bác có 40 tuổi không? Bác mãn kinh chưa? Bác bị bất động ốm nằm liệt giường ngồi xe đẩy từ tháng trở lên chưa? Từ trước tới bác bị phẫu thuật cắt dày chưa? Từ trước tới bác bị phẫu thuật đoạn ruột chưa? (Trừ cắt ruột thừa) Từ trước tới bác bị phẫu thuật cột sống chưa? Từ trước tới bác bị phẫu thuật cắt bỏ buồng trứng chưa? Từ trước tới bác bị phẫu thuật cắt bỏ tử cung chưa? Khác Có Khơng 1.2 Kết đo mật độ xương X-Quang cột sống lưng thắt lưng gần STT Câu hỏi Kết đo mật độ xương cột sống bác có Có Khơng bình thường khơng? Kết đo mật độ xương đùi bác có bình thường khơng? Kết chụp Xquang cột sống lưng thắt lưng bác có bình thường khơng? 1.3 Sàng lọc gãy xương loãng xương (Dành cho bệnh nhân gãy xương) STT Câu hỏi Bác bị gãy xương lần có phải tai nạn giao thơng khơng? Bác bị gãy xương lần có phải ngã từ vị trí cao chiều cao thể khơng? Hồn cảnh cụ thể Có Khơng 1.4 Bệnh mạn tính Từ trước tới bác chẩn đốn mắc bệnh mạn tính chưa? STT Tên bệnh Bệnh suy thận Đi sống phân thương xuyên (lớn năm) Bệnh viêm gan mạn tính Bệnh xơ gan Bệnh ưu tuyến yên Bệnh nhược tuyến yên Bệnh ưu tuyến giáp Bệnh nhược tuyến giáp Bệnh calci máu cao cường tuyến 10 11 12 13 14 15 cận giáp Bệnh calci máu thấp Bệnh ưu tuyến thượng thận Bệnh nhược tuyến thượng thận Bệnh đái tháo đường Bệnh Cushing Bệnh hệ thống bệnh ác tính (Lupus 16 17 18 19 20 21 22 23 24 ban đỏ, ung thư….) Bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính Bệnh khí phế thủng Bệnh xơ nang phổi Bệnh Hemophilia Bệnh suy tim xung huyết Bệnh leukemia Bệnh tăng calci huyết vô Bệnh thiếu hụt calci Bệnh thiếu phospho người trưởng 25 26 27 thành Hội chứng Ehlers – Danlos Hội chứng Menkes Kinky Hội chứng Marfan Có Khơng Nghi Ghi ngờ 28 29 Hội chứng Klinerfelter Khác 1.5 Tiền sử dùng thuốc Trong vòng tháng qua bác dùng thuốc đây? STT Tên thuốc Uống, hít, tiêm, bơi thuốc có dẫn xuất Có Khơng corticosteroid ( ≥ tháng) Dùng thuốc chống đông heparin, Coumarin Thuốc ức chế miễn dịch Hoá trị liệu Thuốc điều trị suy tuyến giáp Thuốc chống co giật Thuốc điều trị tâm thần Các chất kháng GnRH (lupron, leuprolide acetate…) Bệnh án nghiên cứu 2.1 Thông tin Họ Tên:………… Tuổi:……… Số năm mãn kinh:……………… Địa chỉ:……………………………………………………… .………… Điện thoại:………………………………………………………… ……… Nghề nghiệp:………………………………………………………… … 2.2 Các số nhân trắc Chiều cao: Chiều cao tối đa:………………………… … Cân nặng:……………… BMI:………………………………………… 2.3 Các số sinh tồn Mạch:…………………………… Huyết áp:………………………………… Nhiệt độ:………………………… Nhịp thở: ………………………………… 2.4 Tiền sử 2.4.1 Tiền sử loãng xương, gãy xương * Bác bị gãy xương chưa? Khơng  Có  Số lần:……… Vị trí:………………………………………………………………………… * Trong gia đình bác có (bố, mẹ, anh chị em ruột) bị lỗng xương khơng? Khơng  Có  Người bị lỗng xương:………………… * Trong gia đình bác có (bố, mẹ, anh chị em ruột) bị gãy xương lỗng xương khơng? Khơng  Có Người bị gãy xương:………………………… 2.4.2 Tiền sử bệnh lý Từ trước đến bác chẩn đoán mắc bệnh mạn tính khơng? Khơng  Có  Tên bệnh:………………………………… 2.4.3 Tiền sử dùng thuốc Bác có thường xuyên (trên tháng) dùng loại thuốc không? Không  Có  Tên thuốc:……………………………… 2.4.4 Tiền sử kinh nguyệt, thai nghén, sản phụ khoa Tuổi bắt đầu hành kinh: Thời gian hành kinh:…………………………… Chu kỳ kinh nguyêt:…………………………………………………………… Kinh có khơng? Khơng  Có  Tuổi mãn kinh:…………… Tuổi tiền mãn kinh:…………………………… Bác có chưa? Khơng  Có  Số con: Con lần đầu năm tuổi: Hiện bác có cho bú khơng? Khơng  Có  Số lần mang thai: Số lần sinh non: Số lần sẩy thai: Bác dùng thuốc tránh thai chưa? Không  Bác dùng hormon thay sau mãn kinh chưa? Khơng  Có  2.5 Các số cận lâm sàng: Có  2.5.1 Mật độ xương: Máy Hologic – DXA Đo CSTL CXĐ Region Area BMC MĐX (cm2) (g) (g/cm2) T-score PR (%) Z- score AM (%) L1 CSTL L2 L3 L4 Total CXĐ Neck Troch Inter Total Ward’s 2.5.2 Kết X-Quang chẩn đoán, phân loại gãy xương đốt sống theo thang định lượng Phân độ gãy xương đốt sống: 2.5.3 Các xét nghiệm máu Chỉ số HC (g/l) HGB (g/l) Hct (l/l) BC (G/l) Ca TP (mmol/l) Glucose (mmol/l) Kết Chỉ số Ure (mmol/l) Creatinin (Mmol/l) Cholesterol (mmol/l) TG/HDL/LDL (mmol/l) GOT/GPT (U/L) Hà Nội, Ngày tháng Kết năm 2015 Phụ lục Tách DNA từ máu toàn phần Phương tiện dụng cụ: Trang thiết bị - Máy li tâm Kubota 3300, máy Centrifuge 5424 R (Eppendorf) - Máy minispin - Máy lắc vortex - Máy đo mật độ quang NanoDrop 1000 (Thermo) - Máy ủ nhiệt Thermomixer comfort (Eppendorf) - Máy PCR mastercycle epgradient (Eppendorf) - Máy điện di Mulpid Exu (Nhật Bản) - Máy chụp Geldoc - Tủ an toàn sinh học - Tủ lạnh bảo quản -4°C, -20°C, -80°C - Ống PCR 0,2 ml; ống eppendorf 1,5 ml khử trùng - Bộ pipet 1000µl, 200µl, 100µl, 20µl, 10µl - Đầu loại khử trùng khơng có DNA (free DNA) - Giá để ống, phiến lạnh để mẫu - Găng tay, áo choàng, giấy thấm - Bút dạ, đồng hồ bấm giờ, thùng đựng rác Hóa chất sinh phẩm a Bộ hóa chất để tách DNA (Kit OMEGA) - Cell Lysis Solution - Nucleic Lysis Solution - RNAase Solution - DNA rehydration Solution - Protein precipitation Solution - Ethanol 70% nhiệt độ phòng (bảo quản 4°C) - Isopropanol tinh (96-100%) nhiệt độ phòng (bảo quản 4°C) b Hóa chất để PCR, điện di - Taq Buffer 10X - dNTP 10mM - Taq Polymerase - Primer F - Primer Rw Rm - Dung dịch EDTA (0.5M, pH=8) - Đệm điện di UltrapureTMTBE buffer 0.5X (Invitrogen) - RedsafeTM (Intron Biotechnology) - Thạch Agarose (Spain) - Nước tinh (DDW) - Mẫu bệnh phẩm DNA tách chiết Qui trình tách DNA sử dụng Kit OMEGA: Lấy 300ul máu, sau bổ sung thêm 900ul Cell Lysis Solution => Mix Ủ 10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm 14500 rcf 30 giây Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul Nucleic Lysis Solution => Mix Bổ sung 100ul Protein Precipitation Solution Vortex 20 giây Ly tâm 16000 rcf phút Chuyển sịch sang ống eppendorf có chứa 300ul Isopropanol => Mix Ly tâm 16000 rcf phút 10.Loại bỏ dịch Bổ sung 300ul ethanol 70% 11.Ly tâm 16000 rcf phút => Loại bỏ dịch 12.Làm khô mẫu 15 phút máy hút chân không 13 Bổ sung 100ul nước 3D/ DNA Rehydration Solution Ủ 65°C 4°C qua đêm ... nghiên cứu: Nghiên cứu mối liên quan đa hình kiểu genMTHFR C677Tvới mật độ xương nguy gãy xương đốt sống phụ nữ mãn kinh với mục tiêu là: Xác định tỷ lệ đa hình kiểu gen MTHFR C677T phụ nữ mãn. .. GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUY N THANH TNG NGHIÊN CứU MốI LIÊN QUANGIữA ĐA HìNH KIểU GEN MTHFR C677T VớI MậT Độ XƯƠNG Và NGUY CƠ GãY XƯƠNG ĐốT SốNG PHụ Nữ MãN KINH Chuyờn... C677T phụ nữ mãn kinh Việt Nam .59 4.3 Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt sống loãng xương 60 4.3.1 .Mối liên quan kiểu gen MTHFR C677T với gãy xương đốt