ĐỀ TÀI TIỂU LUẬN TỐT NGHIỆP(AMLODIPINE)_V2_11062018

LỜI CẢM ƠN Trong trình thực đề tài này, em nhận hướng dẫn giúp đỡ tận tình mặt từ thầy cơ, bạn bè đồng nghiệp Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới Ths Đồn Thanh Trúc – Trường Đại học Tây Đơ, người trực tiếp hướng dẫn, dành nhiều thời gian tâm huyết giúp em hoàn thành luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban giám hiệu trường Đại học Tây Đô, thầy cô trực tiếp giảng dạy giúp đỡ em suốt trình học tập trường Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè, người sát cánh động viên, ủng hộ giúp em hồn thành khóa học luận văn tốt nghiệp Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày 20 tháng năm 2018 Học viên Trần Hồng Miền TÓM TẮT Bệnh tim mạch nguyên nhân gây tử vong tàn phế lớn giới chiếm tỷ lệ cao, người đứng tuổi người già Bệnh tim mạch thể thể khác suy tim, tăng huyết áp, rối loạn nhịp, đau thắt ngực, rối loạn tuần hồn não, tăng lipid - huyết…Trong bệnh tăng huyêt áp (THA) yếu tố nguy tim mạch quan trọng nguyên nhân hang đầu đến tỷ lệ tử vong tỷ lệ mắc bệnh toàn cầu cao nguyên nhân khác sử dụng thuốc hay tăng đường huyết Tại Việt Nam, tần suất bệnh THA người lớn ngày gia tăng Trong năm 1960, tỷ lệ THA khoảng 1%; nawm 11,2%; năm 2001 16,3% năm 2003 18,3% Theo điều tra gần năm 2008 viện tim mạch Việt Nam tiến hành người lớn (≥ 25 tuổi) tỉnh thành phố nước ta thấy tỷ lệ tăng huyết áp tăng lên đến 25,1% Theo hướng dẫn “Chẩn đoán điều trị tăng huyết áp” Bộ Y Tế (2010) (phụ lục 6) [5] có quy định số loại thuốc điều trị tăng huyêt áp sau: 1.Nhóm thuốc dùng đường uống (lợi tiểu, chẹn kênh calci, tác động lên hệ rennin angiotensin, chẹn beta giao cảm, chẹn alpha giao cảm, tác động lên hệ giao cảm trung ương, giãn mạch trực tiếp) 2.Nhóm thuốc dùng qua đường tĩnh mạch (Nitroglycerin, Nicardipine, Natrinitroprusside, Esmolol, Labetalol, Hydralazine, Enalaprilat) Ngày nay, với phát triển ngày cao công nghệ nghiên cứu bào chế dược phẩm, thuốc đa thành phần nhằm phối hợp tác dụng dược lý dược chất sản xuất, lưu hành sử dụng phổ biến giới nước Một số phối hợp thuốc tác động lên hệ renin angiotensin (Valartan) với thuốc lợi tiểu (Hydroclorothiazid), thuốc tác động lên hệ renin angiotensin (Valartan) với thuốc chẹn kênh calci (Amlodipin) phối hợp ba loại thuốc Để đảm bảo nâng cao lực quản lý loại thuốc với mục đích ban hành thường quy kỹ thuật hệ thống để phân tích, kiểm tra chế phẩm có chứa hoạt chất Tiến hành thực đề tài “Các phương pháp định lượng Amlodipin” với hai mục tiêu sau: - Xây dựng phương pháp định tính định lượng Amlodipin sắc ký lỏng hiệu cao - Áp dụng phương pháp xây dựng để kiểm nghiệm Amlodipin besylat MỤC LỤC Trang Chương 1: MỞ ĐẦU 1.TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN BESYLAT 1.1 Cấu tạo hóa học: 1.2 Tính chất vật lý - hóa học: 1.3 Dược lý chế tác dụng: 1.4 Một số phương pháp định lượng Amlodipin 2.TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG VÀ HIỆU NĂNG CAO 2.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng 2.2 Một số thông số đặc trưng 2.3 Ứng dụng Chương 2: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 10 1.1 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu 10 1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 10 1.3 Thẩm định phương pháp 10 1.4 Ứng dụng phương pháp phân tích số chế phẩm thị trường: 10 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 10 2.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng Amlodipin Besylat 11 2.2 Ứng dụng phân tích số chế phẩm thị trường 13 2.3 Phương pháp xử lý số liệu 13 Chương 4: KẾT QUẢ 14 CHUẨN BỊ MẪU 14 1.1 Mẫu chuẩn 14 1.2 Mẫu thử 14 2.LỰA CHỌN DUNG MÔI PHA MẪU VÀ ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 14 2.1 Lựa chọn dung môi pha mẫu 14 2.2 Lựa chọn điều kiện sắc ký 14 3.1 Định đính 14 3.2 Định lượng 15 4.ỨNG DỤNG TRONG ĐỊNH LƯỢNG VIÊN NÉN BAO PHIM NORMODIPINE 19 Chương 5: THẢO LUẬN 20 VỀ PHƯƠNG PHÁP HPLC 20 VỀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 20 2.1Tính thích hợp hệ thống 20 2.2 Tính chọn lọc 20 2.3 Độ tuyến tính 21 2.4 Độ xác 21 2.5 Độ 21 2.6 Độ thô 21 VỀ ỨNG DỤNG CỦA PHƯƠNG PHÁP 21 Chương 6: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 22 KẾT LUẬN 22 ĐỀ NGHỊ 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Một số nghiên cứu định lượng AML HPLC Bảng 1: Thẩm định tính thích hợp hệ thống 15 Bảng 2: Thẩm định nồng độ tuyến tính 15 Bảng 3: thẩm định độ AML 16 Bảng 4: Kết thẩm định độ lặp lại phương pháp 17 Bảng 5: Kết thẩm định độ tái lặp phương pháp 17 DANH SÁCH HÌNH Trang Hinh1 1: Công thức cấu tạo Amlodipin besylat [32] Hinh1 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AAB Acid acetic băng ACN Acetonitril ALM Amlodipin BP CH3COONH4 DĐVN Dược điển Anh Amoni acetate Dược điển Việt Nam H3PO4 HCL Acid phosphoric Acid hydrochloric HCT HPLC Hydroclorothiazid Sắc ký lỏng hiệu cao KH2PO4 LC-MS MeOH NH2PO4 Kali dihydrophosphat Sắc ký lỏng – khối phổ Methanol Natri dihydrophosphat NP-HPLC RP-HPLC RSD TEA THF Sắc ký lỏng pha thuận Sắc ký lỏng pha đảo Độ lệch chuẩn tương đối Triethylamin Tetrahydrofuran UV-VIS VAL Quang phổ tử ngoại – khả kiến Valsartan Chương 1: MỞ ĐẦU 1.TỔNG QUAN VỀ AMLODIPIN BESYLAT 1.1 Cấu tạo hóa học: 1.1.1 Cơng thức cấu tạo Hinh1 1: Công thức cấu tạo Amlodipin besylat [32] 1.1.2 Công thức phân tử: C20H25ClN2O5.C6H6O3S 1.1.3 Khối lượng phân tử: 567,05 1.1.4 Tên khoa học: 3-Ethyl 5-methyl (±)-2-[(2-aminoethoxy) methyl]-4-(0chlorophenyl)-1,4-dihydro-6-methyl-3,5-pyridinedicarboxylate, monobenzenesulfonate [32] 1.2 Tính chất vật lý - hóa học: 1.2.1 Cảm quan: Bột màu trắng gần trắng [1], [13] 1.2.2 Tính tan: Dễ tan methanol, tan ethanol khan, khó tan nước 2-propanol [1], [13] 1.2.3 Đặc tính phổ hấp thụ UV: Dung dịch Amlodipin dung dịch HCl 0,1N methanol có cực đại hấp thụ 360nm (quét phổ từ 300nm đến 400nm) [1], [13] 1.2.4 Đặc tính phổ hấp thụ hồng ngoại: Phổ hấp thụ hồng ngoại Amlodipin có đỉnh đặc trưng số song sau 561,52; 613,36; 667,66; 753,76; 996,54; 1031,94 [30] 1.2.5 Nhiệt độ nóng chảy: 209,980C [30] 1.3 Dược lý chế tác dụng: 1.3.1 Dược lực học: [2] - Amlodipin dẫn chất dihydropyridin có tác dụng chẹn dịng vào calci qua màng tế bào Amlodipin ngăn chặn kênh calci loại L phụ thuộc điện thế, tác động trơn mạch máu tim - Amlodipin có tác dụng chống tăng huyêt áp cách trực tiếp làm giãn trơn quanh động mạch ngoại biên có tác dụng kênh calci tim - Amlodipin có tác dụng tốt làm giảm sức cản mạch máu thận, làm tăng lưu lượng máu thận cải thiện chức thận - Amlodipin ảnh hưởng xấu đến nồng độ lipid huyết tương chuyển hóa glucose, dùng Amlodipin để điều trị tăng huyết áp người bệnh đái tháo đường - Amlodipin có tác dụng chống đau thắt ngực 1.3.2 Dược động học: [2] - Sinh khả dụng Amlodipin uống khoảng 60 – 80% không bị ảnh hưởng thức ăn Nồng độ đỉnh huyết tương đạt sau uống liều khuyến cáo đến 12 Nữa đời huyết tương từ 30 – 40 - Phân bố: Thuốc liên kết với protein huyết tương cao (trên 98%) - Chuyển hóa gan thành chất hoạt tính tiết qua nước tiểu - Ở người suy gan, đời Amlodipin tăng, cần phải giảm liều kéo dài thời gian liều dung 1.3.3 Chỉ định: [2] - Điều trị tăng huyết áp - Điều trị đau thắt ngực 1.3.4 Chống định: [2] Quá mẫn với dihydropyridin 1.4 Một số phương pháp định lượng Amlodipin 1.4.1 Phương pháp HPLC Hinh1 Sơ đồ cấu tạo hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao Bảng 1: Một số nghiên cứu định lượng AML HPLC Cột sắc ký Điều kiện Mẫu thử C18 (250x4,0) mm; -Pha động: Nguyên liệu 5µm) MeOH: CH3COONH4 2,3g/l=70:30 -Detector: λ= 237nm -Tốc độ dịng: ,5ml/phút -Nhiệt độ cột: 300C -Thể tích tiêm: 20µl C18 (150x3,9) mm; -Pha động: Nguyên liệu + 5µm MeOH: đệm 3,0: ACN=35:50:15 -Detector: λ= 237nm (viên nén) -Tốc độ dòng: 1,0ml/phút -Thể tích tiêm: 10µl (ngun lệu); 50µl (viên nén) C18(250x4,6) mm; 5µm -Pha động: H2O: ACN: AAB=300:700:1 viên nén -Detector: λ= 220nm -Tốc độ dịng: 0,7ml/phút -Thể tích tiêm: 20µl 1.4.2 Các phương pháp khác: Amlodipin cịn định lượng phương pháp: Quang phổ hấp thụ [19]; Quang phổ đạo hàm tỉ đối [20]; Quang phổ huỳnh quang [28]; Điện di mao quản [11]; Sắc ký lớp mỏng hiệu cao [18]; Sắc ký lỏng – khối phổ (LC-MS) [9], [29]; Sắc ký lỏng sử dụng detector huỳnh quang [24] 2.TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG VÀ HIỆU NĂNG CAO 2.1 Nguyên lý chung sắc ký lỏng Sắc ký lỏng trình tách xảy cột tách với pha tĩnh chất rắn pha động chất lỏng (sắc ký lỏng – rắn) Mẫu phân tích chuyển cột tách dạng dung dịch Cơ chế trình sắc ký lỏng hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay phân loại theo kích cỡ Trong sắc ký lỏng hiệu cao, mẫu phân tích tiêm qua buồng tiêm vào cột nhờ pha động, thành phần mẫu phân tích tách pha tĩnh chứa cột qua detector để phát cho tính hiệu ghi sắc đồ [1], [3], [4], [13], [32] 2.1.1 Pha tĩnh sắc ký lỏng Pha tĩnh hay dùng sắc ký lỏng hiệu cao pha tĩnh mà nhóm sinalol bề mặt hạt silicagel (chất mang) liên kết với nhóm hóa học khác tạo nên hợp chất siloxan có độ phân cực khác tùy theo nhóm liên kết Khi R nhóm phân cực octyl (C8), octadecyl (C18), phenyl pha động phân cực, ta có sắc ký pha đảo (RP-HPLC) Khi R nhóm phân cực alkylamin hay alkylnitril pha động dung môi phân cực, ta có sắc ký pha thuận (NP-HPLC) Hiện kỹ thuật RP-HPLC sử dụng rộng rãi tách tốt nhiều hợp chất khác nhau, thành phần pha động nước nên kinh tế Cột thông dụng cột OSD (RP18), C8 với cỡ hay 10µm Để cải thiện khả tách, tiết kiệm dung môi thời gian, gần người ta đưa sắc ký lỏng nhanh (UPLC) vào ứng dụng rộng rãi Trong UPLC, kích thước hạt chất mang nhỏ (thường từ 1,7 – 2,2 µm) sử dụng cột ngắn (5 – 10cm) [1], [3], [4] 2.1.2 Pha động sắc ký lỏng Pha động đóng phần quan trọng việc tách chất phân tích q trình sắc ký định Mỗi loại sắc ký có pha động rửa giải riêng cho để có hiệu tách tốt Pha dộng có hai loại phân cực phân cực thường dùng cho sắc ký pha đảo sắc ký pha thuận Tuy nhiên pha động thành phần không đáp ứng khả rửa giải, người ta thường phối hợp hai hay ba dung môi để có dung mơi có độ phân cực từ thấp đến cao phù hợp với phép phân tích Sự thay đổi thành phần pha động theo thời gian gọi rửa giải gradient nồng độ [1], [3], [4] 2.2.3 Detector sắc ký Có nhiều detector khác nhau, tùy thuộc chất lý hóa chất phân tích mà lựa chọn detector cho phù hợp: -Detector quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS: Áp dụng cho chất có khả hấp thụ ánh sang vùng tử ngoại khả kiến -Detector huỳnh quang: Sử dụng để phát chất có khả phát huỳnh quang Đối với chất không phát huỳnh quang cần phải dẫn xuất hóa chất phân tích để tạo sản phẩm có khả phát huỳnh quang -Detector khúc xạ: Thường dùng định lượng hợp chất đường -Detector độ dẫn: Phù hợp chất có hoạt tính điện hóa Ngồi cịn tán xạ ánh sáng bay (ELSD), khúc xạ (RI), điện hóa, phổ khối (MS)…trong detector chuỗi diode (DAD) cho phép thay đổi bước sóng theo chương trình đặt trình sắc ký [1], [3], [4] Tăng huyết áp bệnh mạn tính nên cần theo dõi đều, điều trị đủ hàng ngày, điều trị lâu dài, để hạn chế tối đa nguy hiểm đến tính mạng người “Tăng huyết áp – Vấn đề cần quan tâm hơn” GS.TS Nguyễn Lân Việt (2011) Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 1.1 Xây dựng phương pháp xử lý mẫu -Lựa chọn dung môi pha mẫu: thông dụng, rẽ tiền -Lựa chọn phương pháp xử lý: siêu âm, lắc học, ly tâm… 1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký Khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký phù hợp để phân tích Amlodipine bao gồm: -Pha tĩnh: Lựa chọn cột sắc ký có khả tách tốt chọn lọc -Pha động: Lựa chọn thành phần, tỷ lệ, pH tốc độ dòng pha động chop thời gian lưu chất phân tích vừa phải, tách tốt, sắc ký đồ đẹp -Detector bước sóng phát hiện: chọn bước song đáp ứng phân tích Amlodipine tối ưu 1.3 Thẩm định phương pháp Thẩm định phương pháp phân tích lựa chọn sau tiến hành khảo sát để đảm bảo phương pháp nghiên cứu phù hợp -Tính thích họp hệ thống sắc ký -Tính chọn lọc phương pháp (Độ đặc hiệu) -Độ tuyến tính -Độ xác: gồm độ lặp lại độ tái lặp -Độ phương pháp -Độ thô 1.4 Ứng dụng phương pháp phân tích số chế phẩm thị trường: -Thu thập số chế phẩm chứa thành phần -Tiến hành phân tích thành phần chế phẩm theo phương pháp xây dựng PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: Nguyên lý phân tích: Mẫu nghiền mịn, xử lý mẫu phương pháp thích hợp, lọc qua màng lọc 0.45µm, tiêm vào hệ thống sắc ký lỏng hiệu cao HPLC, ghi lại sắc ký đồ Ý nghĩa phương pháp nghiên cứu: Đưa quy trình phân tích sắc ký lỏng pha đão (Rp-HPLC) đơn giản, thiết bị phù hợp với đa số phịng thử nghiệm hệ thống kiểm nghiệm: dung mơi phân tích thơng dụng, dễ kiếm, độc hại; detector UV-VIS thong dụng; cách xử lý mẫu đơn giản, dễ tiến hành Các số liệu đề tài thu thập từ kết thực nghiệm ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 10 2.1 Xây dựng thẩm định phương pháp định tính, định lượng Amlodipin Besylat 2.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký thích hợp: Nhận thấy Amlodipin besylat chất có độ phân cực tốt tơi tiến hành khảo sát hệ sắc ký lỏng pha đão với pha tĩnh phân cực (cột C18) hệ pha động phân cực để phân tích Nguyên tắc việc lựa chọn điều kiện sắc ký lựa chọn cột sắc ký, loại pha động, tỷ lệ pha động, tốc độ dòng bước song phát đảm bảo chất tách rõ rệt, píc gọn, cân đối, thời gian phân tích phù hợp, đáp ứng phân tích tối ưu cho hoạt chất -Lựa chọn cột sắc ký: Khảo sát loại cột có kích cỡ hạt khác hãng sản xuất khác -Lựa chọn pha động: Tham khảo tài liệu, khảo sát dung môi pha động gồm CAN, MeOH dung dịch đệm KH2PO4 0.05M (pH 3.0) với tỷ lệ khác -Lựa chọn bước song: Tiến hành quét phổ hấp thụ UV để lựa chọn bước sóng tối ưu phân tích 2.1.2 Thẩm định phương pháp phân tích Xử lý mẫu theo phương pháp lựa chọn, chạy sắc ký dung dịch thu theo điều kiện khảo sát, thẩm định phương pháp dựa tiêu: tính chọn lọc (độ đặc hiệu phương pháp), độ tuyến tính, độ đúng, độ xác, tính thích hợp hệ thống độ thơ *Tính thích hợp hệ thống [6], [7], [17]: -Xác định tính thích hợp hệ thống cách tiêm lặp lại lần lien tiếp mẫu chuẩn hỗn hợp có nồng độ nằm khoảng tuyến tính Ghi lại thời gian lưu diện tích pic lần sắc ký -Yêu cầu: +Số đĩa lý thuyết ≥ 3000 +Hệ số bất đối: 0.8 – 1.5 +Hệ số phân giải ≥ 2.0 +Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu lần tiêm mẫu, biểu thị độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 2.0%) * Độ đặc hiệu phương pháp [6], [7], [17]: -Tạo mẫu placebo tự tạo với thành phần tá dược tương tự chế phẩm khơng có hoạt chất Amlodipin Besylat Chuẩn bị mẫu chuẩn đơn, mẫu chuẩn hỗn hợp, mẫu thử, mẫu placebo Xử lý mẫu tiến hành sắc ký với điều kiện mẫu thử 11 -Dựa vào đặc tính detecto DAD, tiến hành quét chồng phổ UV-VIS hoạt chất mẫu chuẩn hỗn hợp mẫu thử, tính hệ số match -Tính hệ số tinh khiết pic hoạt chất mẫu thử -Yêu cầu: +Trên sắc ký đồ mẫu Placebo thu được, thời điểm tương ứng pic Amlodipin +Hệ số chồng phổ UV-VIS phải xấp xỉ 1.0 +Hệ số timh khiết pic hoạt chất xấp xỉ 1.0 *Độ tuyến tính [6], [7], [17]: -Tiến hành xác lập mối tương quan diện tích pic đáp ứng với nồng độ Amlodipin Tiến hành sắc ký theo điều kiện lựa chọn, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính xác định hệ số tương quan hồi quy r -Yêu cầu: Phương trình hồi quy dạng bậc giá trị r ≥ 0.999 * Độ xác: Thể mức độ phân tán kết loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích mẫu thử đồng điều kiện xác định [6], [7], [17] -Độ lặp lại phương pháp: Độ lặp lại diễn tả độ xác quy trình phân tích điều kiện thí nghiệm khoảng thời gian ngắn Tiến hành thí nghiệm mẫu thử song song mẫu chế phẩm (cùng nồng độ 100%), tính hàm lượng Amlodipin mẫu thử Đánh giá phân tán số liệu dựa vào giá trị RSD -Yêu cầu RSD kết ≤ 2.0 % -Độ tái lặp: Bố trí thí nghiệm tương tự phần độ lặp lại phương pháp tiến hành vào thời gian với phòng thí nghiệm khác Đánh giá kết lặp lại ngày qua giá trị RSD đánh giá độ xác phương pháp qua phân tích t-test Microsoft office Excel 2007 Yêu cầu: +RSD kết ≤ 2.0% + RSD kết ≤ 2.0% +Hàm lượng trung bình phịng thí nghiệm