Aspergilus oryzae sinh enzyme lactase

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .ii LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC iv DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ iii PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu chung .2 1.3 Mục tiêu cụ thể .2 PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan enzyme lactase .3 2.1.1 Enzyme lactase 2.1.2 Phương pháp thu nhận enzyme 2.2 Giới thiệu nấm mốc Aspergillus oryzae 2.2.1 Các đặc điểm chung của Aspergillus oryzae .7 2.2.2 Ứng dụng của A oryzae 11 2.2.3 Khả sinh enzyme lactase của chủng A.oryzae yếu tố ảnh hưởng đến khả .13 2.2.4 Đặc điểm của enzyme sinh A.oryzae 13 PHẦN THỨ BA – VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Vật liệu nghiên cứu 14 3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 14 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng cho nghiên cứu 15 3.1.3 Môi trường nghiên cứu 15 3.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 15 3.3 Nội dung nghiên cứu 15 3.4 Phương pháp nghiên cứu 16 3.4.1 Phương pháp phân lập .16 3.4.2 Phương pháp tuyển chọn 16 3.4.3 Phương pháp xác định đặc tính của enzyme lactase .19 3.4.4 Phương pháp xử lý số liệu .19 PHẦN THỨ TƯ – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 4.1 Kết phân lập A oryzae 20 Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái nấm phân lập mẫu thu thập 20 4.3 Kết tuyển chọn chủng Aspegillus oryzae sinh enzyme lactase môi trường PDA 25 4.3.1 Kết định tính chủng sinh enzyme .25 4.3.2 Kết định lượng hoạt độ enzyme lactase 26 4.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tốc độ phát triển của nấm 27 4.3.4 Ảnh hưởng của pH nuôi cấy đến tốc độ phát triển của nấm 28 4.4 Đặc tính của enzyme lactase sinh nấm mốc Aspergillus oryzae 29 4.4.1 Độ bền nhiệt 29 PHẦN THỨ NĂM – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .32 5.1 Kết luận 32 5.2 Đề nghị .32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC 39 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Thành phần chất tham gia phản ứng enzyme định lượng lactase .17 Bảng 4.2 Tốc độ phát triển của tản nấm môi trường PDA 300C 22 Bảng 4.3 Tốc độ phát triển của tản nấm môi trường CYA 300C 24 Bảng 4.4 Kết định tính lactase của loại nấm phân lập 25 Bảng 4.5 Kết định lượng hoạt độ enzyme 26 Bảng 4.6 Tốc độ phát triển của tản nấm điều kiện nhiệt độ khác môi trường PDA sau thời gian nuôi cấy 96h .27 Bảng 4.7 Tốc độ phát triển của nấm môi trường pH khác .28 DANH MỤC HÌNH, ĐỒ TH Hình 2.1 Cơ chế thủy phân đường lactose của enzyme lactase Hình 4.1 Một số hình ảnh nấm phân lập 21Y Hình 4.2 Độ bền nhiệt của enzyme lactase sinh chủng M1 30 Hình 4.3 Độ bền nhiệt của enzyme lactase sinh chủng G1 30 vii PHẦN THỨ NHẤT – MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong thể sống, khơng có q trình hóa học lại khơng có liên quan mật thiết đến trình sinh học xúc tác của enzyme Chính thế, việc sản xuất chế phẩm enzyme đời phát triển mạnh mẽ quy mô công nghiệp Công nghệ enzyme nghiên cứu, ứng dụng nhiều lĩnh vực khác thu nhiều lợi nhuận Trong số enzyme đó, khơng thể khơng kể đến có mặt ứng dụng của enzyme lactase Enzyme lactase có khả thủy phân đường lactose thành đường đơn giản gồm galactose glucose mà sinh vật nói chung hấp thụ Do thế, dùng để thủy phân lactose sữa whey, tạo sản phẩm có hàm lượng lactose thấp Với thói quen dùng sữa của số người enzyme lactase bị dần, đó, việc sử dụng sữa hay sản phẩm từ sữa khiến thể phản ứng lại với biểu khó tiêu, tiêu chảy… Do vậy, lactase biết đến phương pháp việc giảm tượng trên, góp phần quan trọng cho ngành chế biến sữa nói riêng cơng nghiệp thực phẩm nói chung (Đặng Thị Thu cs., 2007) Lactase tự nhiên tìm thấy ruột non động vật Bên cạnh tìm thấy chất chuyển hóa thứ cấp sinh từ số vi sinh vật nấm men, nấm mốc, vi khuẩn Lactase sinh từ chủng vi sinh vật khác có đặc tính khác Lactase từ nấm mốc ổn định khơng cần ion kim loại cho hoạt động của mình, đồng thời, nấm mốc sản sinh ngoại bào nên dễ dàng cho việc thu nhận enzyme Chính vậy, việc nghiên cứu thu nhận lactase từ nấm mốc quan tâm Một số chủng nấm mốc có khả sinh lactase kể đến Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, nấm men Kluyveromyces lactics, Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotropicalis … (Nguyễn Thúy Hương, 2013) Aspergillus oryzae biết đến loại nấm mốc có lợi, có khả sinh trưởng phát triển nhiều loại chất khác Các chủng phân lập từ nguồn chất khác có đặc điểm khác nhau, khả sinh lactase hoạt tính lactase khác Chính đề tài “Phân lập, tuyển chọn xác định đặc tính chủng Aspergillus oryzae có khả sinh enzyme lactase” quan tâm nghiên cứu 1.2 Mục tiêu chung Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu đặc tính chủng Aspergillus oryzae có khả sinh enzyme lactase 1.3 Mục tiêu cụ thể - Phân lập chủng Aspergillus oryzae có khả sinh lactase từ nguồn chất khác môi trường PDA CYA; - Tuyển chọn chủng Aspergillus oryzae có khả sinh lactase khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH tới chủng đó; - Xác định độ bền nhiệt của enzyme lactase sinh chủng Aspergillus oryzae tuyển chọn PHẦN THỨ HAI – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan enzyme lactase 2.1.1 Enzyme lactase 2.1.1.1 Giới thiệu enzyme lactase Lactase hay gọi lactase – phlorizyn hydrolase lactose galactohydrolase, hay có tên gọi khác β-galactosidase Nó có khả thủy phân liên kết β-(1,2) β-(1,4) galactoside của polysaccharide oligosaccharide phản ứng nghịch đảo của phản ứng ngưng tụ chuyển hóa thành loại đường khác nhờ thay đổi liên kết glycoside Do đó, lactase dùng để thủy phân đường lactose thành đường đơn giản gồm galactose glucose sinh vật hấp thụ Việc sử dụng β- galactosidase để thủy phân lactose sữa whey ứng dụng tiềm công nghiệp chế biến thực phẩm sản phẩm từ sữa Enzyme sử dụng dạng hòa tan dạng cố định dạng hòa tan sử dụng qui trình sản xuất gián đoạn, dạng cố định có lợi sử dụng tốt cho hai qui trình sản xuất gián đoạn liên tục Mặc dù hầu hết ngành công nghiệp thủy phân lactose với enzyme tự do, việc sử dụng enzyme β-galactosidase cố định lĩnh vực đáng quan tâm tiềm của (Đặng Thị Thu cs., 2007) Hình 2.1 Cơ chế thủy phân đường lactose của enzyme lactase 2.1.1.2 Nguồn thu nhận Lactase tự nhiên tìm thấy loài thực vật, động vật vi sinh vật Tuy nhiên, tính chất của enzyme thu nhận từ nguồn khác có khác rõ rệt Enzyme thu nhận từ nguồn thực vật động vật có giá trị kinh tế thấp, thu nhận từ nguồn vi sinh vật lại có nhiều ưu dễ dàng xử lí thu nhận, tốc độ nhân giống vi sinh vật cao, suất thu nhận sản phẩm cao Một số vi sinh vật xem nguồn thu nhận tiềm của loại enzyme Nguồn thu nhận chủ yếu từ E.coli nhiên phổ biến tự nhiên, tìm thấy thực vật (quả mơ, táo…), quan động vật, nấm men, nấm mốc vi khuẩn (Lê Xuân Phương, 2001) Vi khuẩn: Bacillus acidocaldarius, B circulans, B coagulans, B subtilis, B megaterum, Bifidobacterium B bifidum, thermosulfurogens, agglomerans, stearothermophilus, E B.infantis, Clostridium Corynebacterium cloaceae, Bacteriodes Escherichia polypragmatus, acetobutylicum, murisepticum, coli, C Enterobacter Klebsiella pneumonia, Lactobacillus acidophilus, L bulgaricus,L helviticus, L kefiranofaciens, L lactis, L sporogenes, L themophilus, L delbrueckii… Nấm mốc: Aspergillus foelidis, A fonsecaeus, A fonsecaeus, A carbonarius, A oryzae, Auerobasidium pullulans, Curvularia inaequalis, Fusarium monilliforme, F oxysporum, Mucor meihei, M pusillus, Neurospora crassa, Penicillum canescens, P chrysogenum, P expansum, Saccharopolyspora rectivergula, Streptomyces violaceus… Nấm men: Bullera singularis, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, S lactis, S fragilis, Kluyveromyces bulgaricus, K fragilis, K lactis, K.marxianus (Tarek Elbashiiti et al., 2010) Lactase của nấm men hoạt động tối ưu pH – 7, của nấm mốc từ – Do lactase của nấm men nấm mốc có pH tối ưu khác nên enzyme của nấm men hoạt động tốt huyết sữa có pH trung tính, enzyme của nấm mốc hoạt động tốt huyết sữa có tính acid Việc lựa chọn chất rẻ tiền sẵn có với vi sinh vật sản xuất phù hợp yêu cầu sản xuất enzyme Mặt khác nấm mốc sản xuất enzyme ngoại bào nên dễ dàng cho việc thu nhận enzyme Vì thế, Aspergillus oryzae Aspergillus niger thường sử dụng nhiều (Nguyễn Đức Lượng, 2004) 2.1.1.3 Ứng dụng enzyme lactase Enzyme lactase có vai trò vơ to lớn ngành cơng nghiệp thực phẩm nói chung ngành cơng nghiệp chế biến sữa nói riêng Thủy phân lactose whey ứng dụng quan trọng của β-galactosidase ngành công nghiệp chế biến sữa Whey thủy phân cô đặc hay whey thu qua lọc màng sử dụng chất tạo sản xuất siro rau đóng hợp nước giải khát Ngoài ra, sữa thủy phân lactose sử dụng cho việc chế biến hương liệu sữa, phô mai, sữa chua Sự thủy phân lactose sữa dùng sữa chế biến thực phẩm ngăn ngừa kết tinh lactose đông lạnh sữa sản phẩm sữa cô đặc Hơn việc sử dụng sữa thủy phân sản xuất sữa chua mát làm tăng q trình acid hóa, thủy phân lactose thường bước làm chậm tốc độ của q trình, làm giảm thời gian đơng đặc của sữa chua tăng tốc độ phát triển cấu trúc hương vị cho mát Chất lượng của sữa đông lạnh kem làm từ sữa cải thiện đáng kể thêm enzyme lactase Nó chống lại kết tinh đường lactose cách thủy phân thành glucose galactose làm giảm cấu trúc cát sạn (Kumari et al., 2010) 2.1.1.4 Tình hình sản xuất enzyme lactase nước Trên giới sản xuất lactase ứng dụng rộng rãi thực phẩm Enzyme lactase biết có khả thủy phân đường lactose thành glucose galactose, đồng thời tạo sản phẩm phụ GOS (Galactooligosaccharide) Các GOS khơng có giá trị dinh dưỡng với người, người hấp thụ lại vi khuẩn ruột già sử dụng, GOS có tiềm để sản xuất prebiotic Trên giới GOS nghiên cứu sản xuất thương mại, GOS thừa nhận bổ sung vào thực phẩm châu Âu Đã có nhiều chiến lược đặt để sản xuất GOS dạng công nghiệp Từ năm 1950 người ta biết oligosaccharide hình thành từ monosaccharide với xúc tác acid vô Aronso thu oligosaccharide thủy phân lactose môi trường acid Do sản phẩm tạo thiếu đa dạng điều kiện khắc nghiệt dùng acid thủy phân lactose, đường sản xuất GOS không dùng công nghiệp Do người ta nghĩ đến hướng khác sử dụng enzyme lactase với hiệu suất tạo GOS cao (Nguyễn Bảo Dư, 2011) Tuy nhiên Việt Nam, lactase chưa sản xuất với qui mô công nghiệp, bước đầu nghiên cứu qui mơ phòng thí nghiệm Theo nghiên cứu của nhà khoa học Nhật Bản, lacstase từ nấm mốc Aspergillus oryzae có triển vọng để để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực công nghệ thực phẩm, công nghệ di truyền, y học… Lactase trở thành mối nghiên cứu quan trọng của nhà khoa học giới (Sunil Agrawal et al., 1989) 2.1.2 Phương pháp thu nhận enzyme Để phân lập vi sinh vật có khả sinh enzyme, người ta dùng mơi trường đặc trưng cho nhóm vi sinh vật Hiện nay, hai phương pháp nuôi mặt nuôi bề sâu hai phương pháp dùng phổ biến 2.1.2.1 Phương pháp nuôi bề mặt Theo Nguyễn Đức Lượng (2004): “Phương pháp ni mặt thích hợp cho q trình ni nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn Môi trường nuôi cấy rắn xốp” Căn vào kết định tính, có chủng A.oryzae có khả sinh enzyme lactase Chính chúng tơi tiến hành định lượng khảo sát hoạt độ enzyme của chủng Kết thu sau: Bảng 4.5 Kết định lượng hoạt độ enzyme STT Tên chủng Hoạt độ enzyme ngoại bào (U/l) G1 T1 F3 B3 M1 Đ1 T2 N3 37,760 4,935 0,000 8,635 18,825 3,740 2,535 7,600 Kết cho thấy, hoạt độ enzyme ngoại bào của chủng thu thấp Trong đó, chủng F3 kết định tính cho thấy có khả sinh enzyme lactase kết định lượng ngoại bào cho thấy khơng có hoạt độ enzyme Chủng G1 M1 định tính cho vòng phân giải lớn so với chủng lại, màu sắc xanh đậm cho hoạt độ cao (lần lượt 37,760 18,825) Chủng T1, T2 cho kết định tính vòng phân giải bé, màu xanh đậm định lượng cho hoạt độ thấp (lần lượt 4,935 2,535) so với chủng B3, Đ1, N3 (có hoạt độ 8,635; 3,740; 7,600) chủng định tính cho vòng phân giải bé, màu xanh nhạt Đồng thời, G1 chủng nấm mốc A oryzae có nguồn chất từ gạo mốc cho hoạt độ enzyme cao (37,760 U/l), chủng M1 nguồn chất lấy từ máng ăn khu chăn ni bò sữa cho kết định lượng cao thứ (18,825 U/l) Kết hoàn toàn phù hợp với kết nghiên cứu của nhà khoa học Nhật Bản A.oryzae sinh tổng hợp lactase ngoại bào thấp (M.J.Bailaey M.Linko 1990) 4.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến tốc độ phát triển nấm 27 Để xác định ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến tốc độ phát triển của nấm, lựa chọn chủng nấm đại diện cho nguồn phân lập nấm Aspergllus oryzae, chủng nuôi cấy điều kiện nhiệt độ khác để khảo sát tốc độ phát triển Từ có kết bảng 4.6 Bảng 4.6 Tốc độ phát triển của tản nấm điều kiện nhiệt độ khác môi trường PDA sau thời gian ni cấy 96h Đường kính tản nấm (mm) Loại nấm 20oC 25 oC 30 oC 35 oC 40 oC G1 15,5c 24,5b 30,5a 30,0a 28,5a T1 11,0b 17,5a 19,5a 20,0a 18,5a B3 13,0b 16,5a 18,5a 19,0a 16,5a T2 12,5b 17,5a 19,5a 19,5a 17,5a F3 14,0c 16,5b 18,5ab 19,0ab 17,5a M1 16,5c 27,5b 31,5b 30,5a 25,0a N3 11,0b 15,0a 17,5a 17,5a 15,0a Đ1 11,0b 13,0b 17,0a 18,0a 18,5a Qua bảng ta thấy, môi trường, thời gian nuôi cấy điều kiện nhiệt độ khác tốc độ phát triển của chủng khác Theo Lê Văn Nhượng, Quản Đức Thịnh cho rằng, Aspergillus oryzae sinh vật ưa ấm, thích hợp 28 - 32oC, qua bảng, nhiệt độ 30oC, 35oC, phát triển đạt kích thước của tản nấm cao so với mức nhiệt lại Đối với chủng G1, thời gian xuất khuẩn lạc 20 oC chậm nhất, kích thước tản nấm thấp (15,5 mm) Ở nhiệt độ lại, khuẩn lạc xuất đồng thời nhiên, qua ngày quan sát tốc độ phát triển của tản nấm lại khác Ở nhiệt độ 30oC, 35oC, 40oC kích thước tản nấm có chênh lệch không đáng kể (lần lượt 30,5; 30,0 28,5 mm), riêng mức 25oC, kích thước tản nấm (24,5 mm) có cao so với 20 oC (9mm) lại thấp có với mức nhiệt 28 Đối với chủng lại, thời gian xuất khuẩn lạc biến thiên kích thước tản nấm theo nhiệt độ tương tự chủng G1.Tương tự chủng lại, quy luật xuất khuẩn lạc tương quan kích thước chủng G1 Vì vậy, qua kết có được, chúng tơi đề nghị rằng, khoảng nhiệt áp dụng cho thí nghiệm phân lập, ni cấy nấm 30 – 35oC 4.3.4 Ảnh hưởng pH nuôi cấy đến tốc độ phát triển nấm Cũng khảo sát chủng nhiệt độ, tiến hành khảo sát chủng yếu tố pH Nhưng pH thấp (pH