công nghệ di truyền chuyển hoá năng lượng

CHƯƠNG CÔNG NGHỆ DI TRUYỀN Nội dung 7.1 Các enzyme dùng công nghệ di truyền 7.2 Vector chuyển gen 7.3 Thư viện cDNA 7.4 Thư viện genomic DNA 7.5 Các kĩ thuật sử dụng công nghệ di truyền 7.1 Các enzyme dùng công nghệ di truyền ➢ Các enzyme sử dụng tạo dòng phân tử chia làm bốn nhóm lớn sau đây: ✓ Các enzyme hạn chế ✓ Các nuclease ✓ Các enzyme kết nối ✓ Các enzyme tổng hợp 7.1 Các enzyme dùng công nghệ di truyền 7.1.1 Các enzyme hạn chế ➢ Phân lập từ sinh vật prokaryote, có khả phân hủy DNA bacteriophage ➢ Các enzyme hạn chế có ba loại (type): I, II III ➢ Cách gọi tên enzyme hạn chế dựa qui ước quốc tế 7.1.1 Các enzyme hạn chế ➢ Loại I ➢ có trình tự nhận biết đặc hiệu ➢ cắt điểm cách vị trí nhận biết dao động từ 1.000 đến 5.000 nucleotide ➢ sản phẩm khơng đồng khơng phát điện di gel ➢ cần Mg+2 làm cofactor ATP để cung cấp lượng 7.1.2 Các enzyme hạn chế ➢ Loại II ➢ có trình tự nhận biết chuỗi nucleotide đặc hiệu ➢ cắt vị trí nhận biết ➢ cần Mg+2 làm cofactor không cần lượng ATP ➢ sản phẩm đoạn DNA đặc hiệu phát điện di gel agarose ➢ cắt DNA vị trí nhận biết riêng biệt bao gồm từ 4-6 cặp nucleotide có trình tự đối xứng đảo ngược nhau, đoạn ngắn gọi palindrome 7.1.1 Các enzyme hạn chế EcoRI TaqI 7.1.1 Các enzyme hạn chế ➢ Loại II ➢ Các kiểu cắt enzyme hạn chế ➢ Cắt đầu (blunt ends): cắt phân tử DNA palindrom, tạo hai đoạn DNA đầu ➢ Cắt đầu dính (cohesive ends): Cắt bên bên tâm đối xứng để tạo hai đầu lệch vài nucleotide gen sở phương pháp tạo dòng 7.1.1 Các enzyme hạn chế 7.1.1 Các enzyme hạn chế ➢ Loại II ➢ Kích thước cắt đoạn ➢ Nếu vùng nhận biết (chuỗi đích) enzyme cặp bazơ sinh đoạn có kích thước trung bình 46 = 4.096 bazơ ≈ 4,1 kb ➢ Nếu vùng nhận biết enzyme cặp bazơ sinh mảnh có kích thước 44 = 256 bazơ ≈ 0,26 kb 7.3 Thư viện cDNA ❖ Thư viện cDNA (complementary DNA) tập hợp đoạn DNA bổ sung (cDNA) tổng hợp từ mRNA phận thể sinh vật ❖ Ưu điểm ✓ Các dòng cDNA chứa trình tự mã hóa liên tục gen ✓ Sự dồi cDNA làm giảm nhẹ đáng kể việc xác định dòng mong muốn từ thư viện gen 7.3 Thư viện cDNA ❖ Xây dựng thư viện cDNA gồm năm bước ➢ Tinh mRNA từ RNA tổng số phần thể sinh vật ➢ Tổng hợp sợi cDNA thứ từ khuôn mẫu mRNA nhờ enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) ➢ Gây biến tính thể lai mRNA-cDNA để phá hủy sợi mRNA RNase H E coli Tổng hợp sợi cDNA thứ hai từ khuôn mẫu sợi cDNA thứ nhờ enzyme DNA polymerase với primer vòng cặp tóc để thu phân tử cDNA sợi đơi ➢ Cắt vòng cặp tóc enzyme nuclease S1 dùng enzyme Klenow sửa chữa hai đầu sợi đôi cDNA để tạo đầu ➢ Gắn đoạn nối (linker) vào hai đầu cDNA sợi đơi trước tạo dòng vector thích hợp để xây dựng thư viện cDNA 7.4 Thư viện genomic DNA ❖ Thư viện genomic DNA tập hợp đoạn DNA đại diện cho genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) cá thể mà DNA bắt nguồn từ ❖Ứng dụng genomic DNA ➢ để lập đồ vật lý (physical mapping) DNA ➢ xác định gen gây bệnh chuỗi DNA quan tâm cho phân tích khác 7.5 Các kĩ thuật sử dụng công nghệ di truyền 7.5.1 Kĩ thuật PCR ❖ Nguyên tắc PCR ➢ tạo lượng lớn đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa sở hoạt động DNA-polymerase (Taq polymerase) để tổng hợp sợi bổ sung ➢ PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần đoạn DNA có chiều dài khoảng từ 200-3.000 bp ➢ Đoạn DNA khuếch đại (DNA đích) nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng (oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide 7.5.1 Kĩ thuật PCR ❖ Taq loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt ❖Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA nói nhân lên gấp nhiều lần, nhờ đủ số lượng để tách ra, phân tích trình tự tạo dòng 7.5.3 Phương pháp điện di DNA ❖ Nguyên tắc ➢ Điện di kỹ thuật sử dụng thí nghiệm để phân tích đại phân tử tích điện ➢ để tách ly, phát phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế DNA sản phẩm PCR ➢ Nucleic acid tích điện âm dịch chuyển qua bảng gel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) tác dụng điện trường ➢ Trên gel, có dòng điện phân tử DNA khác trọng lượng nên khác điện tích chạy quãng đường khác sau thời gian 7.5.3 Phương pháp điện di DNA ❖ Phương pháp làm hình ➢ Đối với gel agarose, người ta nhuộm ethidium bromid ➢ Đối với gel polyacrylamid, phân tử thường đánh dấu đồng vị phóng xạ vị trí chúng phát kỹ thuật phóng xạ tự ghi 7.5.3 Phương pháp điện di DNA ❖ Cách tiến hành ➢ Cân khoảng 1g agarose cho vào 100ml đệm TBE (Tris-borateEDTA) TAE (Tris-acetate-EDTA) nhiệt độ phòng, khuấy để yên phút, cho vào lò viba ➢ Làm ngui gel xung 50ữ55C, thờm 1àl ethidium bromid, gel vào khuôn gel lắp lược ➢ Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược đổ đệm chạy vào khay gel cho đệm cao mặt gel khoảng 2÷5 mm ➢ Nạp DNA mẫu DNA chuẩn vào giếng, đậy nắp cắm điện cực ➢ Điện di khoảng 30 phút với điện 100÷120V ➢ Chụp hình ảnh gel ánh sáng UV để xem kết 7.5.3 Phương pháp điện di DNA 7.5.3 Phương pháp điện di DNA Hình 3.5 Hình ảnh điện di đoạn DNA khuếch đại PCR bố, mẹ, Hình 3.6 Sản phẩm PCR so sánh với DNA khuôn mẫu gel agarose ... Các enzyme dùng công nghệ di truyền 7.2 Vector chuyển gen 7.3 Thư viện cDNA 7.4 Thư viện genomic DNA 7.5 Các kĩ thuật sử dụng công nghệ di truyền 7.1 Các enzyme dùng công nghệ di truyền ➢ Các enzyme... 7.2 Vector chuyển gen 7.2.1 Khái niệm vector chuyển gen 7.2.2 Một số tính chất cần thiết vector chuyển gen 7.2.3 Một số ứng dụng vector chuyển gen 7.2.4 Các vật chủ thu nhận vector chuyển gen... 7.2.5 Các loại vector chuyển gen 7.2.1 Khái niệm vector chuyển gen ➢ Sự chuyển gen ➢ Để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho) sang tế bào B (tế bào nhận) thực cách đính gen cần chuyển vào yếu tố trung