Tài liệu môn Phân tích dụng cụ sắc ký

Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân- 2016 Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân MỤC LỤC CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ 1.1 KHÁI NIỆM VỀ SẮC KÝ 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Phân loại sắc ký 1.1.3 Sắc ký rửa giải cột 1.2 CÁC TƯƠNG TÁC TRONG QUÁ TRÌNH SẮC KÝ 1.2.1 Lực phân tán (Dispersion force) 1.2.2 Lực phân cực 1.2.3 Lực ion 1.3 CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG CHO QUÁ TRÌNH RỬA GIẢI 1.3.1 Thời gian lưu tR (Retention time) 1.3.2 Hệ số phân bố K hệ số dung lượng k’ 1.3.3 Hệ số chọn lọc  (Selectivity factor) 1.4 LÝ THUYẾT SẮC KÝ 1.4.1 Lý thuyết đĩa 1.4.2 Lý thuyết động học - Phương trình Van Deemter 1.5 ĐỘ PHÂN GIẢI RS 12 1.5.1 Khái niệm 12 1.5.2 Phương trình Purnell : Rs = f(n; ; k‘) 13 1.5.3 Các biện pháp tăng độ phân giải 14 1.6 HỆ SỐ KHÔNG ĐỐI XỨNG 14 CHƯƠNG SẮC KÝ KHÍ 17 2.1 GIỚI THIỆU 17 2.2 CÁC THÀNH PHẦN CƠ BẢN CỦA MÁY SẮC KÝ KHÍ 21 2.2.1 Pha động 21 2.2.2 Cột 21 2.2.3 Hệ tiêm mẫu 26 2.2.4 Chương trình nhiệt độ cột 30 2.2.5 Đầu dò sắc ký khí 30 2.3 ỨNG DỤNG 35 2.3.1 Định tính 35 2.3.2 Định lượng 36 CHƯƠNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 45 3.1 MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG 45 3.1.1 Sắc ký pha thuận (normal phase mode) 45 3.1.2 Sắc ký pha đảo (Reversed phase ) 47 3.1.3 Sắc ký trao đổi ion 50 3.1.4 Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing) 53 3.2 HỆ THỐNG MÁY HPLC 56 3.2.1 Hệ thống cấp pha động 56 3.2.2 Bộ khử khí on line 58 3.2.3 Hệ thống bơm 58 3.2.4 Hệ tiêm mẫu 59 3.2.5 Cột 61 3.2.6 Đầu dò 62 3.3 CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 66 3.3.1 Các đặc điểm dung môi [10] 66 3.3.2 Chuẩn bị pha động 69 3.3.3 Chuẩn bị hệ thống HPLC trước tiêm mẫu vào 72 3.3.4 Chuẩn bị mẫu tiêm vào hệ thống HPLC 74 3.3.5 Chương trình isoractic gradient pha động, gradient bước sóng 76 3.3.6 tính tốn định lượng 79 TÀI LIỆU THAM KHẢO 80 i Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân CHƯƠNG CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ 1.1 KHÁI NIỆM VỀ SẮC KÝ Sắc ký kỹ thuật TÁCH ứng dụng nhiều ngành khoa học đóng vai trò quan trọng nghiên cứu lý thuyết ứng dụng khoa học cơng nghệ Đặc biệt lĩnh vực hóa phân tích 1.1.1 Khái niệm Tất loại hình sắc ký có nguyên tắc tách giống nhau:Mẫu phân tích hòa tan pha động Pha chất khí chất lỏng cho qua pha tĩnh cách liên tục khơng hòa lẫn với Pha tĩnh cố định cột hay bề mặt chất rắn Các chất tan thành phần mẫu di chuyển qua pha động với tốc độ khác tùy thuộc vào tương tác pha tĩnh – pha động – chất tan Nhờ tốc độ di chuyển khác nhau, thành phần mẫu tách riêng biệt thành dải, làm sở cho phân tích định tính định lượng Trên sở nguyên lý phân loại kỹ thuật sắc ký theo nhiều cách khác 1.1.2 Phân loại sắc ký 1.1.2.1 Phân loại theo cách lưu giữ pha tĩnh - Sắc ký cột (column chromatography): Pha tĩnh giữ ống nhỏ; pha động qua nhờ áp suất hay trọng lực - Sắc ký phẳng (planar chromatography) : Pha tĩnh cố định mặt phẳng (giấy, mỏng), pha động di chuyển qua mặt nhờ mao dẫn tác động trọng lực 1.1.2.2 Phân loại theo chất vật lý pha động - Sắc ký khí: Pha động chất khí thường khí trơ Mẫu phân tích đưa vào đầu cột trình rửa giải thực nhờ dòng khí trơ qua cột sắc ký Pha động khơng tương tác với chất phân tích mà làm chức vận chuyển chất phân tích qua cột - Sắc ký lỏng: Pha động chất lỏng, Sắc ký lỏng chia thành hai nhóm: Sắc ký lỏng áp suất thường ( sắc ký cổ điển) sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC : High Performance Liquid chromatography) Trong HPLC tùy thuộc chất trình sắc ký pha tĩnh (stationary phase) cột tách, có loại sắc ký: Sắc ký phân bố (Partition Chromatography: PC) Sắc ký pha thuận (Normal phase: NP-HPLC) Sắc ký pha đảo (Reverse phase: RPHPLC), Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange IE-HPLC), Sắc ký ghép cặp ion ( IP-HPLC); Sắc ký loại cỡ (Size exclusion chromatography SEC-HPLC) 1.1.3 Sắc ký rửa giải cột Hình 1.1 mơ tả sơ đồ di chuyển hai chất A & B cột sắc ký Quá trình rửa giải thực cách thêm liên tục pha động qua cột mẫu phân tích hòa tan pha động đưa vào đầu cột (ứng với thời gian t0) Khi thêm pha động vào cột Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân mẫu hai pha Thêm liện tục pha động đưa A B di chuyển cột với tốc độ khác Sự khác tốc độ phân hai thành phần hổn hợp thành hai vùng khác dọc theo chiều dài cột (ứng với thời gian t2 hình vẽ) A di chuyển nhanh A tương tác với pha tĩnh yếu , B bị pha tĩnh giữ mạnh nên di chuyển theo pha động chậm Hình 1.1 a Sơ đồ tách hai chất A B từ hổn hợp sắc ký rửa giải b Sắc ký đồ Q trình tách hồn tồn thêm đủ lượng pha động vào cột để tách riêng biệt thành hai dải cuối cột ứng với thời gian t3 t4 hình) Nếu cuối cột có đầu dò (detector) phát có mặt nồng độ pha động A B (thường qua tín hiệu) , tín hiệu vẽ theo thời gian thể tích pha động qua cột, ta có đồ thị với số pic sắc ký Đây sắc ký đồ, dùng cho phân tích định tính định lượng 1.2 CÁC TƯƠNG TÁC TRONG QUÁ TRÌNH SẮC KÝ Trong q trình sắc ký chất tách khỏi lực tương tác khác với pha tĩn h pha động Trong sắc ký khí, pha động khí mang (khí trơ) khơng có tương tác với chất phân tích, có tương tác chất phân tích pha tĩnh Trong sắc ký lỏng, có tương tác chất tan pha tĩnh, chất tan pha động, pha tĩnh pha động Bản Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân tương tác tương tác tĩnh điện Có thể phân thành ba loại tương tác 1.2.1 Lực phân tán (Dispersion force) Lực tương tác hợp chất không phân cực HC mạch thẳng nhân thơm Phân tử khơng mang điện tích , phân bố điện tích electron nhân khơng phải luôn đối xứng Ở thời điểm chuyển động electron bên phân tử làm xuất tức thời moment lưỡng cực nhỏ Lưỡng cực tức thời phân tử có hướng xác định thời điểm gây lưỡng cực trở lại phân tử bên cạnh, dẫn đến trường đồng tòan thể Lực tương tác tăng theo kích thước phân tử, phân tử lớn lực tương tác lớn Điều giải thích CH4 khí, hecxan C6H14 lỏng nhiệt Hình 1.2 Tương tác khuếch tán độ thường, phân tử lớn nhiệt độ sôi cao tương tác phân tử mạnh 1.2.2 Lực phân cực Lực phân cực lực tương tác hai chất bị phân cực Đầu dương phân tử chất hút đầu âm phân tử chất nên tương tác gọi tương tác lưỡng cực – lưỡng cực Các hợp chất phân cực thông thường alcohols,esters Amines nitrile Hình 1.3 Tương tác lưỡng cực lưỡng cựccảm ứng Lực phân cực xuất trường hợp phân tử lưỡng cực, phân tử không phân cực Dưới tác dụng phân tử phân cực, phân tử không phân cực trở nên phân cực Tương tác gọi tương tác lưỡng cực cảm ứng Ví dụ poly ethylenglycol HO-CH2 – CH2 – OH chất phân cực, có benzen vào có tương tác lưỡng cực – lưỡng cực cảm ứng Phân tử hữu tương tác lưỡng cực – lưỡng cực có lực phân tán Hình cho thấy hai phân tử tương tác hút lực phân tán lực lưỡng cực tự cực thường xuyên cực cảm ứng 1.2.3 Lực ion Lực tương tác hai tiểu phân mang điện tích trái dấu Trong thực tế thường xảy với chất hữu cho chất hoạt động bề mặt sodium dodecyl sulfonate Đây chất có đầu mang điện tích ưa nước( hydrophilic)) Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân đầu mạch HC dài kỵ nước (hydrophobic) Hình 1.4 Sodium dodecyl sulfonate Phần mang điện tích ưa nước tương tác với đầu mang điện tích phần tử chất tan theo lực tương tác ion-ion Phần mạch HC dài không ưa nước tương tác với pha tĩnh không phân cực theo lực phân tán Cho qua pha tĩnh (cột sắc ký C18 không phân cực) dòng dung dịch chưa sodium dodecyl sulfonate Tại tiêm mẫu cation vào tách * Quy tắc sắc ký: “ Những chất giống có lực với nhau” Chất hữu thường có hai tính chất : độ phân cực (háo nước) háo dầu (kỵ nước: hydrophobic) Những chất hữu có H C mạch thí tính háo dầu cao, chất có nhiều nhóm phân cực (-OH, -COOH; -NH2 …) có tính háo nước Ví dụ : chất CH3COOH (1) ; CH3-CH2 –COOH (2); CH3-CH2 -CH2 –COOH (3) Cả ba chất có nhóm COOH , với tăng mạch C, Độ phân cực giảm dần tính háo dầu tăng dần Tương tác sắc ký hổn hợp nhiều tương tác, có tương tác túy 1.3 CÁC THƠNG SỐ ĐẶC TRƯNG CHO Q TRÌNH RỬA GIẢI 1.3.1 Thời gian lưu tR (Retention time) Khi tiêm mẫu vào cột sắc ký, chất tan di chuyển dọc theo cột có thời gian lưu giữ định cột sắc ký Hình 1.5 sắc ký đồ trục tung thời gian, trục tung tín hiệu detector Thời gian lưu tR : Thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến chất phân tích đến detector ứng với nồng độ cực đại Thời gian lưu chết t0 : Thời gian mà chất không bị lưu giữ qua cột Tốc độ di chuyển chất không lưu giữ tốc độ di chuyển trung bình phân tử pha động Thời gian lưu hiệu chỉnh tR’ = tR – t0 Vận tốc trung bình chất phân tích (Linear velocity) v = L/tR (L chiều dài cột) Đơn vị tốc độ dòng cm/s Vận tốc trung bình phân tử pha động ͞u = L/tM Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xn Hình 1.5 Sắc ký đồ Nếu trục hồnh sắc ký đồ đơn vị thể tích pha động thay cho thời gian, ta tích lưu VR, thể tích chết V0 cột Thể tích lưu hiệu chỉnh VR’ = VR – V0 Mối liên quan thể tích thời gian pha động qua cột: V=Ft F: lưu lượng hay gọi tốc độ dòng (Flow rate) Đơn vị ml/phút Mỗi chất có thời gian lưu cố định điều kiện sắc ký Cho nên thời gian lưu đại lượng để định tính chất Thời gian lưu phụ thuộc vào yếu tố : Bản chất pha tĩnh; Bản chất ,thành phần,tốc độ pha động; Cấu tạo chất phân tử chất tan; Trong số trường hợp thời gian lưu phụ thuộc vào pH pha động Trong phép phân tích, Nếu tR q nhỏ q trình tách chất khơng hồn tồn, chí peak chập lên nhau, tR lớn peak tách hồn tồn peak bị bành rộng ra, độ lặp lại cũa peak kém., thời gian hóa chất tiêu tốn cho phân tích tăng lên Do phải chọn tR thích hợp cách thay đổi yếu tố vừa nêu 1.3.2 Hệ số phân bố K hệ số dung lượng k’ 1.3.2.1 Hệ số phân bố K (Partition Coefficient) Biểu thị khác biệt chất tan phân bố pha tỉnh pha động 𝐾= 𝐶𝑠 (1.1) 𝐶𝑀 CS nồng độ mol chất tan pha tĩnh CM nồng độ mol chất tan pha động Lực tương tác chất phân tích hai pha định giá trị K Trị số K lớn, chất phân tích di chuyển qua pha tĩnh chậm Nếu chất hổn hợp có số K khác nhiều khả tách chất dễ dàng Theo phương trình (1.1) hệ số K giữ khơng đổi khoảng nồng độ nồng độ Cs tỷ lệ thuận với CM pha động Đây sắc ký tuyến tính Chúng ta khảo Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân 1.3.2.2 Hệ số dung lượng k’ (Capacity/retention factor) Đối với chất phân tích , hệ số dung lượng cho biết khả lưu giữ cột, đồng thời phân bố chất phân tích pha tĩnh pha động Do hệ số lưu giữn k’sẽ lượng chất phân tích bị lưu giữ pha tĩnh chia cho lượng chất chia cho lượng chất phân tích pha động 𝑘′ = 𝐶𝑠 𝑉𝑆 𝑉𝑆 =𝐾× 𝐶𝑀 𝑉𝑀 𝑉𝑀 * Mối liện hệ k’ tR Tốc độ di chuyển pha động dọc theo cột u, tốc độ di chuyển chất phân tích X uX xác định tỷ lệ R chất phân tích có mặt pha động thời điểm ux = R x u Ví dụ thời điểm R=0.5 có nghĩa có phân tử X pha động pha tĩnh Vì tốc độ chất phân tích nhanh ½ tốc độ pha động Một chất phân tích phải có mặt pha tĩnh, pha động Vì phần có mặt pha động R phần có mặt pha tĩnh 1-R Theo định nghĩa 1−𝑅 𝑘′ = 𝑅 ➔ 𝑅= 1+𝑘′ Thời gian lưu ( tR ) khoảng cách (chiều dài cột L) chia cho tốc độ di chuyển chất phân tích uX 𝑡𝑅 = 𝐿 𝑢𝑥 𝑡𝑜 = 𝐿 𝑢 Tương tự ➔ 𝑢 𝑡𝑜 𝑥 𝑅 𝑡𝑅 = 𝑡𝑜 𝑢 = 𝑘′ = = 𝑡0 (1 + 𝑘 ′ ) 𝑡𝑅 − 𝑡0 𝑡0 - Khác với hệ số phân bố K, k’ phụ thuộc không chất chất phân tích mà phụ thuộc tỷ lệ VS/VM - Nếu hệ số k’ KA nên  luôn lớn Để tách riêng hai chất A B cần >1 Thường chọn  dao động khoảng 1.05 -2 Nếu  lớn thời gian phân tích dài 1.4 LÝ THUYẾT SẮC KÝ Sắc ký q trình phức tạp, có tương tác ba thành phần : chất phân tích (PT) Pha tĩnh (SP), pha động (MP) Có nhiều cơng trình khoa học đưa lý thuyết mơ tả q trình sắc ký Bài giảng giới thiệu cách định tính hai nội dung : Lý thuyết đĩa lý thuyết động học Hình 1.6 Tương tác thành phần sac ky lỏng 1.4.1 Lý thuyết đĩa Năm 1941 Martin Synge mơ tả q trình sắc ký sau: Cột tách hình dung cột chưng cất Cột sắc ký phân nhiều lớp mỏng xếp sát gọi đĩa lý thuyết Ở đĩa diễn phân bố cân tức thời chất tan pha tĩnh pha động Khi phần pha động đưa vào đĩa làm dịch chuyển cân phần chất tan theo pha động vào đĩa Ở đĩa cân thiết lập chất tan theo pha động sang tiếp đĩa sau Nhờ thiết lập trình cân đĩa nối tiếp thế, chất tan phân bố số đĩa số đĩa đĩa có nồng độ cực đại so với đĩa lân cận hai bên Số đĩa lý thuyết tưởng tượng N=L/H ( L : chiều dài cột; H: chiều cao đĩa lý thuyết) Số đĩa lý thuyết N chiều cao đĩa lý thuyết H dùng để đo hiệu lực cột sắc ký N mô tả mối liên quan cột độ hẹp peak gọi hiệu cột (column efficiency) xác định theo công thức 𝑡𝑅 𝑁 = 16 × ( )2 𝑊 Ví dụ: Độ rộng W peak A hình 1.7 = 4.00 – 3.85 =0.15 phút tR =3.93 phút ➔ N=16 (3.93/0.15)2 = 10.980 Giá trị N khác mẫu khác nhau, điều kiện tách cột khác Giá trị N lớn , peak thu sắc ký đồ hẹp tách tốt Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân Hình 1.7 Sắc ký đồ W1/2 Độ rộng peak đo W1/2 (chiều rộng pic ứng với chiều cao peak ) cho kết tin cậy Lúc N tính sau 𝑡𝑅 𝑁 = 5.54 × ( ) 𝑊1/2 Lý thuyết đĩa đề cập đến hai thơng số đặc trưng cho q trình rửa giải Tuy nhiên lý thuyết đĩa chưa xem xét đến yếu tố cột ảnh hưởng đến pic sắc ký, làm bành rộng pic Lý thuyết động học bổ sung cho nhược điểm lý thuyết đĩa 1.4.2 Lý thuyết động học - Phương trình Van Deemter Van Deemter – Kỹ sư Hóa người Hà Lan thiết lập phương trình mơ tả phụ thuộc chiều cao đĩa H theo yếu tố động học B H=A + + Cu u Trong A, B, C số ; u : vận tốc pha động (cm/s) 1.4.2.1 Khuếch tán xoáy (A) Hằng số A liên quan đên khuếch tán xoáy (Eddy diffusion) chất tan di chuyển theo pha động qua cột Quãng đường di chuyển theo pha động chất tan qua cột không hồn tồn Vì pha động phải qua kẻ hở cột nhồi Điều làm pic giản rộng di chuyển theo nhiều đường khác Thực tế tốc độ pha động thay đổi từ điểm đến điểm khác, phụ thuộc nhiều yếu tố: Hình 1.8 Khuếch tán xốy - Khoảng cách đến bề mặt hạt nhồi cột, độ đồng hạt (hình dáng kích thước hạt) - Hiệu ứng thành cột: Ngay ống rỗng, dòng chảy qua ống hiệu ứng thành ống có vận tốc khác nhau: Ở thành ống vận tốc bé, gần không, Ở trung tâm ống, vận tốc cực đại Trong trường hợp cột sắc ký nhồi đầy hạt, tính chất dòng chảy phức tạp hơn, phụ thuộc vào tính chất pha động, đặc điểm kỹ thuật cột sắc ký (đặc điểm hạt, mật độ nhồi cột, đường kính cột) Người ta nhận thấy thay đổi tốc độ Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xn dòng tác động khơng đáng kể đến khuếch tán xoáy chất tan Cho nên số hạng thứ khơng có đại lượng u Hình 1.9 Hiệu ứng di chuyển nhiều quãng đường lên bành rộng peak Hình dạng dải chất phân tích ban đầu hình chữ nhật Khi dải di chuyển dọc theo cột, phân tử chất tan riêng biệt di chuyển theo đường khác nhau, ba đường vẽ theo đường có màu khác (chiều dài thực đường biểu thị mũi tên thẳng hình Hầu hết chất phân tích di chuyển theo đường có chiều dài tương tự đường màu xanh Một số khác di chuyển theo đường dài (đỏ) ngắn (lục) Hình dạng dải chất phân tích cuối cột bị bành rộng có hình Gause 1.4.2.2 Khuếch tán dọc (B/u) Số hạng thứ hai liên quan đến khuếch tán dọc (longitudinal diffussion) theo cột chất tan pha động Còn gọi khuếch tán trục (axial diffussion) Các phân tử chất tan khuếch tán từ vùng có nồng độ cao sang vùng có nồng độ thấp Kiểu khuếch tán có thể hướng ngược hướng với pha động Trong cột sắc ký, phân tử chất tan khuếch tán khỏi dãi hai phía: Hình 1.10 Khuếch tán dọc làm dải Phía trước phía sau dải, dải bành rộng mở rộng Nếu thời gian cột lâu khuếch tán dọc theo cột mạnh Cho nên tốc độ pha động tăng, thời gian lưu chất tan cột ngắn hiệu ứng khuếch tán dọc giảm : Khuếch tán dọc tỷ lệ nghịch với tốc độ pha động u Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân - Hình 1.11 Ảnh hưởng khuếch tán dọc lên bành rộng dải chất phân tích Mũi tên đỏ hướng mà pha động di chuyển 1.4.2.3 Quá ttrình chuyển khối (mass transfer) Chất tan di chuyển pha động, pha tĩnh mặt phân cách hai pha với tốc độ khác Sự phân bố chất tan dòng chảy qua cột sắc ký khơng thể đạt cân thực trình chuyển khối hai pha khơng diễn tức thời Nếu tốc độ dòng lớn cân khó phân tử chất tan pha động cón hội chuyển vào pha tĩnh mà lướt nhanh lên phía trước dải, số phân tử chất tan pha tĩnh vào pha động chậm nên nằm lại phía sau dải Kết dải mở rộng hai phía Rõ ràng trường hợp hiệu ứng mở rộng pic sắc ký liên quan đến động học trình hấp giải hấp chất tan, tăng tỷ lệ thuận với tốc độ dòng : ta có đại lượng liên quan đến trình chuyển khối C.u Hình 1.12 Ảnh hưởng trình chuyển khối lên bành rộng dải: (a) Hình dạng Gause với cân lý tưởng chất phân tích pha động pha tĩnh (b, c) Nếu để dải chất tan di chuyển đoạn nhỏ dọc theo cột, cân hai pha bị phá vỡ Mũi tên đỏ biểu thị di chuyển chất phân tích từ pha động vào pha tĩnh (Cái gọi chuyển khối), (d) Một cân tái thiết lập, dãi chất phân tích bị bành rộng 10 Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân Đường cong tổng hợp tác động đến chiều cao H có dạng hyperbol Hình 1.13 Đường cong Van Deemter Khi tốc độ dòng u bé, chiều cao H giảm theo chiều tăng u, H giảm đạt cực tiểu sau tăng dần theo tốc độ dòng Vì hiệu lực cột đạt tối ưu H cực tiểu, nên tốc độ dòng hiệu lực cột tối ưu ứng với cực tiểu đường cong Để xác định cực tiểu lấy vi phân phương trình theo u 𝑑𝐻 −𝐵 = + 𝐶 𝑑𝑢 𝑢 ➔𝑢= 𝐵 𝐶 ➔ 𝐻𝑚𝑖𝑛 = 𝐴 + 𝐵𝐶 Dựa vào thuyết động học, có sở tối ưu hóa q trình sắc ký rửa giải: xác định tốc độ dòng tối ưu để có hiệu lực cột cực đại Trong sắc ký lỏng dùng cột dài 25 – 30 cm Nếu cột dài phải dùng áp suất cao trì tốc độ dòng Ngược lại sắc ký khí dùng cột dài đến 100m Vì hiệu cực cột sắc ký khí cao săc ký lỏng 1.5 ĐỘ PHÂN GIẢI RS 1.5.1 Khái niệm Rs đặc trưng cho khả tách hai cấu tử A B khỏi điều kiện sắc ký Rs = Hiệu số thời gian lưu hai peak / Độ rộng trung bình hai peak gần 𝑅𝑆 = 2(𝑡𝑅𝐵 − 𝑡𝑅𝐴 ) 𝑊𝐴 + 𝑊𝐵 Trong (tR)B: thời gian lưu cấu tử B lưu giữ mạnh (tR)A: thời gian lưu cấu tử A lưu giữ WA: Bề rộng mũi cấu tử A đường (bề rộng đáy A) 11 Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân Hình 1.14 Hai peak phân giải Hình 1.15 minh họa khả tách peak cải tiến vớí tăng R S Nếu diện tích peak Rs =1.5 hai peak chập khoảng 0.13% xem tách hồn tồn Hính 1.15 Ba ví dụ minh họa tương quan Rs khả tách hổn hợp hai chất peak màu xanh đỏ đồ thị rửa giải hai chất Peak sắc ký - tổng hai đồ thị đường màu đen 1.5.2 Phương trình Purnell : Rs = f(n; ; k‘) Việc lựa chọn điều kiện sắc ký để có Rs phù hợp thuận lợi xác định ảnh hưởng thông số đặc trưng k’, , N Giả định chất A B rửa giải liên tiếp liền kề Do xem WA =WB, Cơng thức tính Rs viết lại 𝑅𝑠 = (𝑡 𝑅 )𝐵 − (𝑡 𝑅 )𝐴 𝑊 Thay W tính theo số đĩa lý thuyết N có 𝑅𝑠 = Thay hệ số k’ tính theo thời gian lưu vào có 𝑅𝑠 = Thay  theo hệ số dung lương k’ vào 12 (𝑡 𝑅 )𝐵 − (𝑡 𝑅 )𝐴 × (𝑡 𝑅 )𝐵 𝑘′ 𝐵 − 𝑘′ 𝐴 1+ 𝑘′ 𝐵 × 𝑁 𝑁 Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân 𝑅𝑠 = 𝑁 × 𝛼 −1 𝛼 × 𝑘′ 𝐵 1+ 𝑘′ 𝐵 Phương trình phương trình Purnell, mô tả phụ thuộc Rs vào số đĩa lý thuyết N, Hệ số dung lượng k’, hệ số chọn lọc  Để tăng độ phân giải Rs thay đổi thông số 1.5.3 Các biện pháp tăng độ phân giải a Tăng số đĩa N - Dùng cột dài tăng N, thời gian phân tích dài hơn, pic bành rộng - Giảm chiều cao H cách giảm tốc độ pha động, giảm kích thước hạt (thay cột khác) b Tăng hệ số dung lượng k’: Tăng k’B hệ số dung lượng chất chậm (chất có k’ lớn hơn) Tuy nhiên tăng k’ tăng thời gian phân tích Thơng thường trị số k’ nên dao động khoảng 1-5 c Tăng hệ số chọn lọc  - Thay đổi thành phần pha động (pH, tăng giảm thành phân dung môi hữu cơ, thay đổi dung mơi pha động có độ phân cực cao thấp sắc ký lỏng - Thay đổi pha tĩnh (thay cột) -Thay đổi nhiệt độ cột : nhiệt độ tăng , vận tốc trao đổi chất tăng lên ➔ số đĩa lý thuyết tăng lên Tuy nhiên yếu tố nhiệt độ cột không quan trọng sắc ký lỏng mà quan trọng sắc ký khí 1.6 HỆ SỐ KHƠNG ĐỐI XỨNG Khi hệ số phân bố K=Cs /CM số với tất nồng độ chất phấn tích, ta có sắc ký tuyến tính peak rửa giải chất có hình Gause đối xứng Nếu K khơng số, peak rửa giải có dạng khơng đối xứng hình 1.16 Peak tailing xảy số tâm hoạt tính pha tĩnh lưu giữ mạnh tâm khác Peak fronting thường xảy cột bị overload mẫu (lượng mẫu lớn ) Để đo mức độ tailing hay fronting peak sắc ký , người ta dùng hệ số tailing (hệ số kéo đuôi TF hệ số khơng đối xứng As Có thể biểu diễn mức độ không đối xứng peak sắc ký theo hai cách hình 1.17 - Hệ số khơng đối xứng As = Nửa chiều rộng phía sau peak chia cho nửa chiều rộng phía trước peak (tại điểm 1/10 chiều cao peak) - Hệ số kéo đuôi peak TF= Độ rộng peak chia cho lần chiều rộng phía trước peak (tại điểm 1/20 chiều cao peak) Hai peak có TF=As=1.0 tách tốt Khi hệ số tailing tăng, tất nhiên khả tách giảm nhiều (Hình 1.19) 13 Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân Hình 1.16 peak sắc ký khơng đối xứng: (a) peak tailing (peak kéo đuôi) and (b) peak fronting (peak đổ đầu).peak sắc ký màu xanh hình a hình b peak khơng đối xứng đường màu đỏ nét rời thể dạng peak Gause lý tưởng Phần chèn vào thể mối tương quan nồng độ chất phân tích pha tĩnh [S]s, nồng độ chất phân tích pha động [S]m.Đường nét rời thể K số Đường màu xanh liền thể K giảm tăng tổng nồng độ chất phân tích tăng Hình 1.17 Cách tính TF Và As Hình 1.18 Mối liên quan As TF 14 Bài giảng Phân tích dụng cụ - ThS Phan Thị Xuân Hình 1.19 Khi hệ số tailing tăng, khả tách giảm Nếu TF