NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - NGUYỄN THỊ MỸ THỦY NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CẢM BIẾN SINH HỌC THEO NGUYÊN LÝ ĐIỆN HÓA KHÔNG SỬ DỤNG CHẤT ĐÁNH DẤU ỨNG DỤNG TRONG Y SINH Chuyên ngành: HÓA HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGÀNH HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS HUỲNH ĐĂNG CHÍNH PGS TS TRẦN ĐẠI LM H Ni 2012 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng y sinh công trình nghiên cứu độc lập , kết phân tích đợc thực xác không sử dụng tác giả khác Trong luận văn có tham khảo kết nghiên cứu số tác giả đợc rõ danh mục tài liệu tham khảo Mọi số liệu, tài liệu sử dụng luận văn có nguồn gốc rõ ràng Hà Nội, ngày 26 tháng 03 năm 2012 Tác giả Nguyễn ThÞ Mü Thđy MỤC LỤC MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ MỞ ĐẦU CHƯƠNG I: TỔNG QUAN I.1.CẢM BIẾN SINH HỌC I.1.1 Sơ lược trình phát triển cảm biến sinh học I.1.2 Cấu tạo chung cảm biến I.1.3 .Cảm biến theo nguyên lý điện hóa I.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến sinh học I.1.5 Một số ứng dụng cảm biến sinh học I.2.ENZYME VÀ CẢM BIẾN ENZYME CHOLESTEROL 10 I.2.1 Enzyme 10 I.2.2 Cholesterol oxidase 17 I.2.3 Phản ứng với xúc tác ChOx 17 I.3.POLYME DẪN VÀ POLYANILIN 18 I.3.1 Polyme dẫn 18 I.3.2Polyanilin 22 I.4.HẠT NANO OXIT SẮT TỪ TÍNH 29 I.4.1 Giới thiệu chung 29 I.4.2 Tính chất hạt nano 30 I.4.3 .Phương pháp tổng hợp hạt nano sắt từ 32 CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM VÀ NGHIÊN CỨU 37 II.1.PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM 37 II.1.1 Điện cực làm việc 37 II.1.2 .Chế tạo hạt nano Fe3O4 bọc copolyme poly 38 II.1.3 Trùng hợp điện hóa màng PANi 40 II.1.4 Cố định enzyme Cholesterol 41 II.1.5 Các phân tích điện hóa 43 II.1.6 Phân tích cholesterol phương pháp CHOD-PAP 44 II.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 II.2.1 Phương pháp phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 45 II.2.2 Phương pháp kính hiển vi điện tử quét 46 II.2.3 Các phương pháp nghiên cứu điện hóa 48 II.2.4 Phương pháp trắc quang 50 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 52 III.1 TỔNG HỢP ĐIỆN HÓA MÀNG NANOCOMPOSITE PANi/Fe3O4 52 III.2.HÀNH VI ĐIỆN HÓA CỦA ĐIỆN CỰC PANi VÀ PANi-Fe3O4 54 III.3 PHÂN TÍCH HÌNH THÁI HỌC QUA ẢNH FE-SEM .1 III.3.1 Ảnh FE-SEM màng PANi PANi-Fe3O4 55 III.3.2 Ảnh FE-SEM màng PANi PANi-Fe3O4 cố định ChOx 55 III.4.PHỔ HỒNG NGOẠI PANi PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 57 III.5 CÁC PHÉP ĐÁNH GIÁ ĐIỆN HÓA ĐỐI VỚI CẢM BIẾN ChOx .58 III.5.1 Phương pháp Von-Ampe vòng (CV) 58 III.5.2 Phương pháp quét tuyến tính (LSV) 59 III.5 So sánh đáp ứng dòng cảm biến PANi-ChOx, PANiFe3O4/ChOx PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx 60 III.6.KHOẢNG TUYẾN TÍNH,GIỚI HẠN PHÁT HIỆN,GIỚI HẠN ĐỊNH LƯỢNG 62 III.6.1 Khoảng tuyến tính 62 III.6.2 Giới hạn phát giới hạn định lượng 66 III.7.ĐÁNH GIÁ CẢM BIẾN ChOx 66 III.7.1 Kiểm tra độ đặc hiệu cảm biến ChOx .66 III.7.2 Độ nhạy cảm biến 67 III.7.3 Phân tích mẫu giả lập 68 KẾT LUẬN 70 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ANi Aniline CE ChOx Điện cực phụ trợ Cholesterol oxidase CoE Coenzyme CV E Phân cực vòng Enzyme p(St-coAA) EIS Copolyme polystyren polyacrylic axit EM Emeraldine ES FT-IR Muối Emeraldine Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier GS IDE Phân cực dòng tĩnh Điện cực có cấu trúc lược IUPAC LE Hiệp hội quốc tế hố học lý thuyết hóa ứng dụng Leucoemeraldine MEMS Micro-Electro-Mechanical Systems PANi PBS Polyanilin Dung dịch đệm muối phosphat PE PEDOT Pernigraniline Poly (3, 4-ethylenedioxythiophene) PPy Polypyrol PS Phân cực tĩnh RE SCE Điện cực so sánh Điện cực calomen bão hòa SEM Kính hiển vi điện tử quét USB WE Universal Serial Bus Điện cực làm việc Phổ tổng trở điện hóa DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng III Chênh lệch cường độ dòng thêm cholesterol vào hệ điện hóa 64 Bảng III Kết đo chênh lệch cường độ dòng mẫu trắng .66 Bảng III Độ nhạy cảm biến 68 Bảng III Kết xác định hiệu suất thu hồi cholesterol mẫu giả lập theo hai phương pháp 69 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình I Mơ hình cảm biến Glucose hệ [11] .3 Hình I Phòng Viện ITIMS, ĐH Bách Khoa Hà Nội .4 Hình I Sơ đồ cấu tạo chung cảm biến sinh học Hình I Một số phần tử sử dụng làm đầu thu sinh học .6 Hình I Một hệ cảm biến điện hóa .7 Hình I (a) Mơ hình Fisher (b) Mơ hình Koshland 12 Hình I Xúc tác Enzyme làm giảm lượng phản ứng 14 Hình I Cholesterol Oxidase (ChOx) 17 Hình I Vinylferrocene .19 Hình I 10 Một số polyme dẫn điện tử 20 Hình I 11 Polyme trao đổi ion (poly 4-Vilynpyridine với Fe(CN)63-) 20 Hình I 12 Cơng thức tổng qt PANi 23 Hình I 13 Quá trình chuyển đổi cấu trúc điện tử PANi môi trường oxy hóa- khử 24 Hình I 14: Đường CV PANi dung dịch HCl 1M thay đổi màu PANi giai đoạn oxy hoá khác tốc độ quét 50 mV/s [2]25 Hình I 15 Dạng bipolaron PANi 26 Hình I 16 Cấu trúc hạt nano Fe3O4 [38] .30 Hình I 17 Cơ chế hình thành phát triển hạt nano dung dịch 32 Hình I 18 Công thức phân tử glutaraldehyde 35 Hình I 19 Phương pháp liên kết chéo (cross-linking) 35 Hình II Sơ đồ chế tạo vi điện cực tích hợp .38 Hình II Vi điện cực tích hợp .38 Hình II Hệ điện hóa đa Autolab/PGSTAT12 41 Hình II Hệ ủ GA cố định enzyme .42 Hình II Sơ đồ nguyên lý máy quang phổ hồng ngoại biến đổi Fourier 46 Hình II Sơ đồ phận kính hiển vi điện tử quét 48 Hình II Phương pháp qt tuyến tính đa chu kỳ 49 Hình II Quan hệ điện dòng điện phương pháp CV 49 Hình II Sơ đồ nguyên lý máy trắc quang 51 Hình II 10 Đường chuẩn cách xác định nồng độ (Cx) theo phương pháp đường chuẩn từ Ax đo 51 Hình III Phổ trùng hợp điện hóa theo phương pháp CV màng (a) PANi (b) PANi-Fe3O4 vi điện cực Pt 52 Hình III So sánh cường độ dòng phổ CV (chu kỳ thứ 20) trình trùng hợp màng PANi PANi-Fe3O4 53 Hình III Ảnh hệ điện cực trước sau trùng hợp .54 Hình III Phổ CV điện cực Pt/PANi Pt/PANi-Fe3O4 đệm PBS (KCl 0,9%) 54 Hình III Ảnh FE-SEM màng (A) PANi (B) PANi-Fe3O4 trùng hợp theo phương pháp CV vi điện cực Pt 55 Hình III ảnh FE-SEM (A) hạt nano Fe3O4, điện cực (B) Pt/PANi/ChOx, (C) Pt/PANi-Fe3O4/ChOx (D) Pt/PANiFe3O4/ Fe3O4-ChOx 56 Hình III Phổ FT-IR (đường a) PANi (đường b) PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx Hình III Phổ CV Pt/PANi-Fe3O4/Fe3O4-ChOx với tốc độ quét thay đổi từ 10 tới 100mV/s với bước 10mV (đường a tới j) 58 57 40 I (A) 30 Axit Acrobic 0,05mM Axit Uric 0,02mM Glucose 1mM PBS 20 cholesterol 10 0 100 200 300 400 500 t (s) Hình III 15 Độ đặc hiệu cảm biến ChOx Có thể thấy cho cholesterol vào hệ điện hóa, cường ddoooj dòng thay đổi đột ngột đạt cân Trong đó, thêm chất khác axit acrobic, axit uric, đường glucose đệm PBS vào cường độ dòng thây đổi không đáng kể, thay đổi (nhiễu) thời điểm thêm dung dịch vào điện tiếp xúc bơm dung dịch vào hệ điện hóa, cường độ dòng nhanh chóng trở lại vị trí cân trước Như độ đặc hiệu với chất cảm biến tốt III.7.2 Độ nhạy cảm biến Kết tính độ nhạy cảm biến đưa bảng III.2 Bảng III Độ nhạy cảm biến C (mM) I (µA) S (µA/mM) 0,196 4,576 23,34 0,385 8,049 20,90 0,566 10,08 17,80 0,741 13,85 18,69 0,909 17,49 19,24 1,071 22,50 21,00 1,228 26,11 21,26 1,379 28,87 20,93 1,525 33,00 21,63 1,667 35,02 21,00 1,803 37,25 20,66 1,935 38,84 20,07 2,063 39,70 19,24 Độ nhạy trung bình cảm biến 21,44 µA/mM III.7.3 Phân tích mẫu giả lập Thực với mẫu giả lập dung dịch cholesterol có nồng độ khác pha đệm PBS có chứa 0,05mM glucose, 0,02mM axit ascobic axit uric 0,2mM Tính nồng độ cholesterol theo phương trình đường chuẩn I (µA) = 21,45 * C (mM) - 0,8352, đánh giá hiệu suất thu hồi so sánh với phương pháp phân tích trắc quang Bảng III Kết xác định hiệu suất thu hồi cholesterol mẫu giả lập theo hai phương pháp Cảm biến sinh học [Cholestero l] thêm vào (mM) Trắc quang [Cholester Hiệu suất [Cholestero Hiệu suất ol] xác thu hồi l] xác định thu hồi định (%) (%) (mM) (mM) 0,600 0,558 93,0% 0,595 99,2% 0,800 0,872 109% 0,805 101% 1,00 0,975 97,5 0,999 99,9% 1,20 1,224 102% 1,15 95,8% Kết cho thấy cảm biến cho kết phân tích xác, nồng độ thấp (nhỏn 1mM) kết có sai số lớn 5%, nhiên nồng độ cao kết tương đương với phương pháp tiêu chuẩn phương pháp trắc quang KẾT LUẬN Trong trình thực đề tài “Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo ngun lý điện hóa khơng sử dụng chất đánh dấu ứng dụng y sinh” bước đầu thu số kết khoa học, đóng góp vào việc nghiên cứu chế tạo cảm biến sinh học điện hóa ứng dụng phân tích nhanh cholesterol Kết thu khn khổ nghiên cứu luận văn bao gồm: Đã ứng dụng hạt nano oxit sắt từ (Fe3O4) chế tạo cảm biến sinh học xác định nhanh cholesterol theo nguyên lý điện hóa Kết cho thấy hạt Fe3O4 bọc p(AA-co-St) có độ bền khả phân tán tốt dung dịch Các hạt Fe3O4 với enzyme ChOx cố định màng PANi-Fe3O4 thông qua tác nhân GA cho đáp ứng dòng với có độ đặc hiệu độ nhạy cao, thời gian đáp ứng ngắn, không tương tác với thành phần khác axit acrobic, axit uric Bằng phép phân tích điện hóa von-ampe qt vòng, von- ampe qt tuyến tính cho thấy cảm biến có đáp ứng dòng tốt nhát +0,5V (so với Ag/AgCl chế tạo tích hợp điện cực) Áp dụng phương pháp đo đáp ứng dòng theo thời gian thực (chronoamperometry) điện +0,5V cho thấy cảm biến có thời gian đáp ứng ngắn (nhỏ giây), đạt ổn định nhanh (chỉ sau khoảng 20 giây) Trong dải nồng độ cholesterol từ 0,196mM tới 2,063mM cảm biến cho tín hiệu đáp ứng dòng (khác có nghĩa so với tín hiệu nền) Khoảng tuyến tính cảm biến từ 0,196mM tới 1,803mM Hệ số tương quan đường chuẩn đạt 0,9929 Độ nhạy cảm biến đạt trung bình 21,44µA/mM Giới hạn phát (đo với mẫu trắng) 0,022mM giới hạn định lượng đạt 0,072mM Trong nghiên cứu tiến hành phân tích số mẫu giả lập (mẫu spike) với nồng độ cholesterol biết trước so sánh với phương pháp trắc quang Kết cho thấy cảm biến cho kết khác biệt lớn so với phương pháp trắc quang nằm sai số tương đối cho phép ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Từ kết thu luận văn, định hướng nghiên cứu chúng tơi ổn định quy trình chế tạo, tiếp tục nâng cao độ ổn định giới hạn đo cảm biến Tiến hành cố định đồng thời biemzyme cholesterol oxidase cholesterl ester nhằm ứng dụng định lượng nhanh cholesterol mẫu thật mẫu huyết Tiến hành chế tạo thiết bị phân tích cầm tay nhỏ gọn, theo chuẩn kết nối USB với điện cực TÀI LIỆU THAM KHẢO Clark, L.C and C Lyons, Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular surgery Annals of the New York Academy of Sciences, 1962 102(1): p 29-45 Hòa, D.T., Nghiên cứu tổng hợp polyanilin phương pháp điện hóa khả ứng dụng để chế tạo biosensor xác định glucoza 1993, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Vũ Thị Hồng Ân, N.D.Đ., Trương Thị Ngọc Liên, Trần Đại Lâm, Cảm biến sinh học Glucose oxidaza (GOx) sở màng nanocomposite: Polypyrrol/ống cacbon nano ứng dụng phân tích hàm lượng glucose Tạp chí Hóa học, 2008 46(5A): p 187-191 Vũ Thị Hồng Ân (2008), Cảm biến sinh học sở composite polypyrrole ống nanocacbon ứng dụng xác định GOx ADN 2008, Đại học Bách Khoa Hà Nội Tran Dai Lam, N.H.B., Nguyen Ngoc Thinh, Nguyen Duc Chien, Fabrication and characterization of microscaled DNA sensor based on advanced materials Journal of Analytical Sciences in Physics, Chemistry and Biology, 2006 2: p 77 Ánh, T.T.N., Nghiên cứu phương pháp cố định ADN lên bề mặt cảm biến sinh học sở độ dẫn 2008, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tam, P.D., et al., DNA sensor development based on multiwall carbon nanotubes for label-free influenza virus (type A) detection Journal of Immunological Methods, 2009 350(1– 2): p 118-124 Tran, L.D., et al., Electrochemical detection of short HIV sequences on chitosan/Fe3O4 nanoparticle based screen printed electrodes Materials Science and Engineering: C, 2011 31(2): p 477-485 Tam, P.D., et al., Facile preparation of a DNA sensor for rapid herpes virus detection Materials Science and Engineering: C, 2010 30(8): p 1145-1150 10 Tran, L.D., et al., Development of interdigitated arrays coated with functional polyaniline/MWCNT for electrochemical biodetection: Application for human papilloma virus Talanta, 2011 85(3): p 1560-1565 11 Wang, J., Glucose Biosensors: 40 Years of Advances and Challenges Electroanalysis, 2001 13(12): p 983-988 12 IUPAC, Recommended Definitions and Classification Pure Appl Chem., 1999 71(12): p 2333-2348 13 Chemistry, T.N.P.i http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2000/illpre s/index.ht ml 2000 14 Lange, U., N.V Roznyatovskaya, and V.M Mirsky, Conducting polymers in chemical sensors and arrays Analytica Chimica Acta, 2008 614(1): p 1-26 15 Nghĩa, N.Đ., Bán dẫn hữu polyme Cơng nghệ chế tạo, tính chất, ứng dụng, 2007: Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ 16 Ánh, T.T.N., Nghiên cứu phương pháp cố định ADN lên bề mặt cảm biến sinh học sở độ dẫn, in Khoa học vật liệu 2008, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội: Hà Nội p 72 17 Tuấn, M.A., Cảm biến sinh học tình hình nghiên cứu, chế tạo ứng dụng Thế giới cảm biến, 2006 11(75): p 38 18 Dzyadevych, S.V., et al., Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future IRBM 29(2-3): p 171-180 19 Amine, A., et al., Enzyme inhibition-based biosensors for food safety and environmental monitoring Bioelectronics, 2006 21(8): p 1405-1423 Biosensors and 20 Wang, J., et al., Remote electrochemical sensor for monitoring TNT in natural waters Analytica Chimica Acta, 1998 361(1–2): p 85-91 21 Dzyadevych S V., A.V.N., Soldatkin A P., El'skaya A V., Martelet C., Jaffrezic-Renault N., Amperometric enzyme biosensors: Past, present and future IRBM 29(2-3): p 171180 22 Thịnh, B.Đ.H., Lưu Duẫn, Lê Doãn Biên Hóa sinh cơng nghiệp 2000: NXB Khoa học Kỹ thuật 23 Copeland, R.A., Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism, and Data Analysis 2000: Wiley-VCH 397 24 Schomburg, D., I Schomburg, and A Chang, Class Oxidoreductases XI: EC 1.14.11 - 1.14.14 (Springer Handbook of Enzymes) 2006: Springer 25 MacLachlan, J., et al., Cholesterol oxidase: sources, physical properties and analytical applications The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, 2000 72(5): p 169-195 26 Gordon G Wallace, G.M.S., Leon A P Kane-Maguire, Peter R Teasdale, Conductive electroactive polymers : intelligent polymer systems, ed r ed 2009: CRC Press Taylor & Francis Group 27 Tân, T.V., ed Khoa học công nghệ nano 2009, NXB Tri Thức 28 Nghĩa, N.Đ., Bán dẫn hữu polyme Cơng nghệ chế tạo, tính chất, ứng dụng 2007, Hà Nội: Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ 29 Wikipedia Aniline http://vi.wikipedia.org/wiki/Anilin 30 Tahir Zarini Muhammad, A.E.C., Grooms Daniel L., Polyaniline synthesis and its biosensor application Biosensors and Bioelectronics, 2005 20(8): p 1690-1695 31 Hải, N.H Chế tạo hạt nanô ô xít sắt từ tính https://sites.google.com/a/hus.edu.vn/nguyenhoanghai/che-taohat-nano-o- xit-sat 32 Yang, C., J Wu, and Y Hou, Fe3O4 nanostructures: synthesis, growth mechanism, properties and applications Chemical Communications, 2011 47(18): p 5130-5141 33 Hải, N.H Ứng dụng hạt nano từ tính xít sắt http://user.hus.edu.vn/nguyenhoanghai/ung-dung-hat-nano-tu-tinho-xit-sat 34 Yanling CHENG, L.M., Ruohui LI, Poly(styrene-acrylic acid) magnetic polymer microspheres Front Chem China, 2008 3(4): p 454–457 35 Luong, T.T., et al., Design of carboxylated Fe3O4/poly(styreneco-acrylic acid) ferrofluids with highly efficient magnetic heating effect Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 2011 384(1–3): p 23-30 36 Doretti, L., et al., Covalently immobilized enzymes on biocompatible polymers for amperometric sensor applications Biosensors and Bioelectronics, 1996 11(4): p 365-373 37 Khan Raju, K.A., Mishra A P., Immobilization of cholesterol oxidase onto electrochemically polymerized film of biocompatible polyaniline-Triton X100 Materials Science and Engineering: C, 2009 29(4): p 1399-1403 38 P.D Gaikwad, D.J.S., V.K Gade, P.A Savale, H.J Kharat, K.P Kakde, and M.D Shirsat, Immobilization of GOD on Electrochemically Synthesized PANI Film by Cross-linking via Glutaraldehyde for Determination of Glucose Int J Electrochem Sci., 2006 1: p 425-434 39 Đĩnh, N.H and T.T Đà, Ứng dụng số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử 1999: NXB Giáo Dục 40 ... Luận văn Thạc sỹ khoa học - ngành Hóa Học, đề tài Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo nguyên lý điện hóa không sử dụng chất đánh dấu ứng dụng y sinh công trình nghiên cứu độc lập , kết phân... tính hữu ích khả ứng dụng cao, luận văn Nghiên cứu phát triển cảm biến sinh học theo ngun lý điện hóa khơng sử dụng chất đánh dấu ứng dụng y sinh , hướng tới chế tạo cảm biến sinh học với điều kiện... I.1.CẢM BIẾN SINH HỌC I.1.1 Sơ lược trình phát triển cảm biến sinh học I.1.2 Cấu tạo chung cảm biến I.1.3 .Cảm biến theo nguyên lý điện hóa I.1.4 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến